Summary
L'unità di inalazione descritto può generare, campione per la caratterizzazione e depositare uniformemente un aerosol farmaco nei polmoni dei roditori. Ciò consente la determinazione pre-clinico di efficacia e sicurezza di dosi di farmaco depositate nei polmoni; dati chiave abilitanti clinica lo sviluppo di farmaci per via inalatoria.
Abstract
malattie respiratorie ostruttive come l'asma e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) sono attualmente trattati con farmaci anti-infiammatori e broncodilatatori per via inalatoria. Nonostante la disponibilità di trattamenti multipli, entrambe le malattie sono in crescita preoccupazioni per la salute pubblica. La maggior parte dei pazienti con asma sono ben controllati sulle attuali terapie per via inalatoria, ma un numero considerevole di pazienti con asma grave non lo sono. L'asma colpisce circa 300 milioni di persone in tutto il mondo e circa il 20 per cento hanno una forma grave della malattia. In contrasto con l'asma, ci sono poche terapie efficaci per la BPCO. Si stima che circa il 10% della popolazione ha la BPCO e l'andamento dei tassi di mortalità è in aumento per la BPCO, diminuendo per altre malattie importanti. Sebbene sviluppo farmaci per via inalatoria consegna è impegnativo, l'unità di inalazione naso-solo permette fornitura diretta di nuovi farmaci al polmone di roditori per efficacia e sicurezza / tossicologia studi preclinici. somministrazione di farmaci per via inalatoriaha molteplici vantaggi per malattie respiratorie, dove l'alta concentrazione nel polmone migliora l'efficacia e minimizza gli effetti collaterali sistemici. corticosteroidi e broncodilatatori per via inalatoria beneficiare di questi vantaggi e la consegna per via inalatoria possono anche tenere il potenziale per le future terapie biologiche. L'unità di inalazione descritto può generare, campione per la caratterizzazione e depositare uniformemente un aerosol farmaco nei polmoni dei roditori. Ciò consente la determinazione pre-clinico di efficacia e sicurezza di dosi di farmaco depositate nei polmoni dei roditori, i principali dati necessari prima di iniziare la fase di sviluppo clinico.
Introduction
Ci sono molti vantaggi per la somministrazione per via inalatoria di farmaci per il trattamento di malattie respiratorie. la consegna per via inalatoria si applica l'agente terapeutico direttamente al sito d'azione, i polmoni. Un'alta concentrazione locale del farmaco nei polmoni offre un vantaggio significativo che riduce al minimo la dose e l'esposizione sistemica, e massimizza l'efficacia. Questo è un vantaggio importante che può aumentare notevolmente l'indice terapeutico (TI, rapporto della dose di farmaco che provoca un effetto collaterale sulla dose di farmaco che fornisce efficacia) di un farmaco. Inalatori β 2 agonisti adrenergici, corticosteroidi e farmaci anti-colinergici sono dimostrati efficaci nel migliorare la funzione polmonare nei pazienti con asma e BPCO, riducendo al minimo gli effetti collaterali sistemici (tachicardia, immunosoppressione, e costipazione) osservato quando questi farmaci vengono assunti oralmente. Nuove classi di farmaci (ad esempio, gli inibitori PDE4 1 e gli inibitori della BTK 2) hanno di recentedimostrata efficace nel migliorare la funzione polmonare nei modelli animali di malattia pre-clinici ma, simile a beta2 agonisti, corticosteroidi e farmaci anti-colinergici, soffrono di effetti collaterali sistemici che possono essere minimizzate mediante consegna inalata. A causa del costo aggiunto di sviluppo di farmaci per via orale inalatori vs, una formulazione inalata deve essere considerato solo per indicazioni respiratorie successo dopo somministrazione orale / sistemica rivela la dose massima effetti collaterali sistemici per meccanismi.
Preclinicamente, composti per via inalatoria sono ottimizzati per aumentare la TI, che richiede nelle misure di efficacia vivo ed effetti collaterali. Inizialmente queste misurazioni possono essere effettuate in saggi separati, di solito una misura d'attualità consegnato efficacia e una misura degli effetti collaterali a livello sistemico consegnato, ma da confrontare veramente composti, di efficacia e gli effetti collaterali devono essere misurati negli stessi animali dopo la somministrazione per via inalatoria. Ciò richiede studi di dose / risposta che achieve abbastanza composto somministrato ai polmoni per indurre un effetto collaterale misurabile. L'unico modo per distribuire uniformemente attualmente grandi dosi di farmaco nei polmoni di più piccoli animali contemporaneamente è naso sola inalazione 3, 4, 5. I punti di forza e di debolezza delle diverse tecniche di esposizione per inalazione sono stati recentemente rivisti 6, 7, 8. attrezzature specializzate e una grande quantità di composto di prova (quantità dell'ordine del grammo) sono richiesti per il naso sola somministrazione di farmaci per via inalatoria, ma la prova-of-concept studi possono essere possibile con altri mezzi.
Quando la quantità di farmaco è limitata (quantità mg), metodi di somministrazione diretta sono un'opzione ma tutti soffrono di deposizione non omogenea, con più di farmaco concentrata lungo le vie aeree centrali e meno rappresentato nel parenchima / alveolareregioni 3, 4, 5. La dose efficace erogata dal instillazione diretta è sempre più alta e non può mai essere direttamente confrontata con le dosi per via inalatoria 4. Metodi instillazione diretta comprensiva intranasale 9, intratracheale liquido 10, 11 e spruzzo instillazione 12, o polvere secca insufflazione 13, 14 può essere utilizzato come strumento di screening per determinare l'intervallo di dose approssimativa per studi di inalazione naso sola successive, o per determinare la classifica di efficacia / tossicità per una serie di farmaci strutturalmente simili 15. A causa del modello centrale deposizione delle vie aeree, metodi di somministrazione diretta può essere più utile per determinare gli effetti dei composti che agiscono sulle vie respiratorie centrali (broncodilatatori o inibitori mastociti) che in polmone periferico (antinfiammatori).
A differenza di esseri umani, che può inalare una notevole dose di aerosol concentrato da un inalatore in un singolo respiro, la generazione continua di una respirabile (0,5-5 um massa diametro aerodinamico mediano, MMAD) aerosol, per un massimo di un'ora, si richiede il deposito una dose di farmaco efficace nei polmoni di un roditore che respira spontaneamente in un sistema di inalazione naso solo il 16. Aerosol (getto nebulizzatore o mangimi polvere Wright 17) che possono produrre continuamente la dimensione delle particelle di aerosol richieste e concentrazione per studi di inalazione naso sola non sono molto efficaci nel generare aerosol (respirabili) di alta qualità. Gli avanzamenti farmaco a questi aerosol per potente (IC 50 pM nM in saggi funzionali a base cellulare) composti sono comunemente nell'intervallo / min 1 a 10 mg e generalmente meno dell'1% di tale aerosol farmaco rende la zona di respirazione degli animali(Figura 1). Molte delle particelle generate sono troppo grandi (> 5 micron) per entrare nei polmoni e vengono rimossi da un classificatore aerosol (un pre-separatore a ciclone o con un punto di taglio 5 um) per evitare una grande dose di farmaco nel naso. Aggiungendo alla inefficienza dei sistemi di inalazione naso sola è la piccola gamma granulometria (da 0,5 a 5 um MMAD) per particelle respirabili. Molte delle particelle di aerosol inferiore a 0,5 um sono espirata (come il fumo di sigaretta) e non si deposita nei polmoni 18. Inoltre, molte delle particelle di aerosol "più grandi" (~ 5 micron) Deposito nel naso sono assorbiti o trasportato da clearance mucociliare verso la parte posteriore della gola dove vengono inghiottiti nello stomaco 19. Quando si utilizza inalazione naso sola, la dose depositata nel naso è sempre maggiore della dose depositata nei polmoni e la dose nasale può contribuire ad un'esposizione sistemica e gli effetti collaterali 20. Intrinsecamente, dru inalatog dosi sono piccole (nell'intervallo microgrammi) minimizzare qualsiasi sistemico potenziale effetto collaterale di farmaco assorbita dal nasale, polmonare o tessuti gastrointestinali. Anche quando la dimensione delle particelle dell'aerosol fornita agli animali è nell'intervallo respirabile, in media solo il 4% delle particelle di aerosol che rendono la zona di respirazione del deposito animali nei polmoni. Più efficienti aerosol sono disponibili, ma il nebulizzatore jet e mangimi polvere Wright sono incomparabili per la loro capacità di produrre aerosol continue da diverse formulazioni in polvere liquide e secche, rispettivamente.
Aerosol respirabile dal pre-separatore passa nell'unità inalazione esposizione naso sola 21 che si basa su un flusso passato la progettazione naso 22. L'unità inalazione ha 3 livelli (solo due livelli sono mostrati nella Figura 1) e ciascun livello contiene 10 porte di esposizione per animali e campionamento aerosol. Le porte sono situate perifericamente attorno al central plenum aerosol. topi coscienti sono collocati in supporti di vetro ritegno (6 pollici di lunghezza per diametro 1,2 pollici) e respirare il contenuto aerosol dell'unità inalazione. I topi non sono acclimatati ai dispositivi di ritenuta 23. Precedente esperienza ha dimostrato che i topi tollerano moderazione tubo di meno di una durata un'ora in modo simile, con o senza adattamento 2.
L'unità di inalazione è progettato per fornire aerosol droga direttamente ai polmoni degli animali evitando l'esposizione agli operatori. La potenza / tossicità di questi farmaci è di solito i controlli di sicurezza di ingegneria sconosciuti e molteplici sono utilizzati per evitare l'esposizione agli operatori. Gli operatori devono sempre indossare dispositivi di protezione individuale (guanti, camici da laboratorio, respiratori e occhiali protettivi). Il plenum esterna dell'unità inalazione è sotto pressione negativa in ogni momento durante il funzionamento, permettendo la rimozione sicura di singoli o gruppi di animali senzut lo spegnimento del generatore di aerosol. L'unità inalazione è anche contenuta in un contenitore secondario mantenuto ad una pressione negativa da una luce di scarico nel soffitto per impedire qualsiasi fuoriuscita di aerosol nella camera in caso di malfunzionamento. Tutta l'aria effluente dal sistema di inalazione viene filtrato da un filtro HEPA prima del rilascio nell'ambiente. Il sistema di esposizione naso-only utilizzato in questo manoscritto è stato acquistato da un singolo fornitore (vedi tabella supplementare dei Materiali).
Protocol
I topi utilizzati in questi studi sono stati curati in conformità con la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, ottava edizione 24. I topi sono stati gruppo ospitato presso un'associazione per la valutazione e l'accreditamento del Laboratorio di Animal Care (AAALAC) impianto internazionale accreditato in sterili abitazioni microisolator ventilato sulla biancheria da letto di pannocchia di mais. Quando si misura broncocostrizione, i topi sono stati anestetizzati con 100 mg / kg ip pentobarbital e profondità dell'anestesia stato monitorato dalla mancanza di punta pinch riflesso e mantenuto da ip anestesia come necessario. Alla fine degli esperimenti, i topi sono stati sottoposti ad eutanasia da dislocazione cervicale dopo overdose di barbiturici. Verifica dell'eutanasia è stata confermata dalla mancanza di respirazione. Non sono interventi chirurgici di sopravvivenza sono state eseguite su topi. Tutti i protocolli di ricerca sono stati approvati dal Comitato di cura e l'uso di animali Istituzionale (IACUC).
1. Selezione Formulazione e dispositivo per la generazione di Pharaerosol maceutiche
NOTA: Formulazione e selezione del dispositivo dipendono dalle proprietà fisico-chimiche del farmaco soggetto da aereosol, quindi protocolli generali sono presentati qui sotto e si rinvia alle recensioni di Zeng 25 e 26 O'Riordan.
- Aerosol polvere secca
- Micronizzazione farmaco polveri secche in un mulino a sfere, mulino a getto o un dispositivo simile 27 ed assicurare la distribuzione granulometrica micronizzato (PSD) contiene particelle di respirabili (0,5-5 um massa diametro aerodinamico mediano, MMAD) granulometria. Miscelare composti di prova potenti che devono essere diluite con lattosio micronizzato.
NOTA: Se non c'è abbastanza polvere micronizzata per determinare il PSD con un impattatore a cascata, il PSD di un piccolo (sub-milligrammo) campione della polvere micronizzata può essere misurata mediante diffusione della luce per confermare contiene piccole particelle / respirabili. - Generare l'aerosol secco in polvere utilizzando un feed polvere polvere secca generatore di aerosol Wright. Imballare il farmaco micronizzato / lattosio in polvere nel serbatoio cilindrico utilizzando una pressa idraulica manuale a circa 1000 libbre per pollice quadrato (psi) per produrre torte compattati di polvere utilizzata come input dal Wright alimentazione polvere generatore di aerosol 17.
- Avvitare il serbatoio cilindrico sulla alimentazione polvere Wright avanzare il serbatoio fino a quando il coltello rasatore è in contatto con la torta farmaco.
- Collegare l'uscita del mangime polvere Wright per un ciclone e l'ingresso ad una sorgente di aria compressa impostato portata d'aria 15 L / min (pressione massima 90 psi).
- Impostare il controllo avanzamento a 0,7 giri al minuto (rpm) e attivare il generatore di aerosol alimentazione Wright polvere.
NOTA: 0,7 rpm corrisponde ad una torta avanzamento articolo di prova di 1 g / h quando si utilizza il piccolo Wright polvere serbatoio di alimentazione cilindrico. Il feed Wright polvere raschia un sottile strato di po compattatowder fuori l'articolo torta prova ruotando il serbatoio. Aria trasporta la polvere del mangime polvere Wright, attraverso un ugello sonico per de-agglomerazione, e in un ciclone per rimuovere le particelle non respirabili e agglomerati. - Collegare l'uscita del ciclone a aerosol plenum centrale dell'unità di inalazione (figura 1).
NOTA: I composti possono essere compressa dal 300 a 1500 psi nel serbatoio del mangime polvere Wright. L'oggetto è quello di comprimere sufficiente le particelle in modo che saranno trattenute nel serbatoio quando invertita, ma non tanto che il mangime polvere Wright non può raschiare uno strato sottile per re-aerosolizzazione. Va ricordato che il misuratore sulla pressa idraulica manuale legge in libbre e lo stantuffo sul piccolo serbatoio di alimentazione polvere ha una superficie di circa 0,25 pollici quadrati. Pertanto, 250 libbre di forza di compressione sul 0,25 pollice quadrato è equivalente a 1000 psi.
- Micronizzazione farmaco polveri secche in un mulino a sfere, mulino a getto o un dispositivo simile 27 ed assicurare la distribuzione granulometrica micronizzato (PSD) contiene particelle di respirabili (0,5-5 um massa diametro aerodinamico mediano, MMAD) granulometria. Miscelare composti di prova potenti che devono essere diluite con lattosio micronizzato.
- Aerosol liquidi nebulizzati
- Sciogliere il farmaco in 100 ml di acqua o soluzione salina fisiologica.
- Caricare una siringa da 100 ml con la soluzione medicinale e posizionare la siringa nella pompa a siringa con una portata fissato a 1 mL / min.
- Collegare la pompa siringa al nebulizzatore getto e spurgare l'aria dalla linea di alimentazione che conduce al nebulizzatore.
- Collegare la sorgente di aria pressurizzata al nebulizzatore jet e impostare il contatore dell'aria a 10 L / min.
- Inserire il nebulizzatore jet nel pre-separatore. Il pre-separatore collega il nebulizzatore a aerosol plenum centrale dell'unità di inalazione (figura 1).
NOTA: Molti composti di droga hanno limitato la solubilità in acqua e sono meglio formulati sotto forma di aerosol a polvere secca. Se una sospensione stabile può essere fatto da micronizzato composto (MMAD <5 uM), esso può essere utilizzato con il nebulizzatore a getto. L'attenzione dovrebbe essere utilizzato come sospensione possono ostruire il nebulizzatore. concentrazioni mangimi nebulizzatore da 1 mg / mL per potenti composti (come il broncodilatatoreipratropio) a 40 mg / sono stati utilizzati sospensioni ml (per composti meno potenti come salbutamolo solfato). La velocità di alimentazione pompa a siringa è impostato a 1 mL / min per una ragione pratica; per consentire il periodo di equilibrio concentrazione di aerosol e l'esposizione di 45 min a lungo da completare, senza la necessità di ricaricare la siringa.
2. dell'esperimento esposizione Aerosol
- Misurare la concentrazione di farmaco (raccogliendo aerosol su un filtro assoluto) e distribuzione granulometrica (raccogliendo aerosol utilizzando un dispositivo di simulazione cascata) dell'aerosol che entra nell'unità inalazione dopo pre-separatore / ciclone. Utilizzare questi parametri insieme con ventilazione dell'animale minuto, il peso corporeo, e il tempo di esposizione per stimare la dose di farmaco depositate nei polmoni.
- Pesare il filtro assoluto e registrare il peso del filtro. Posizionare il filtro nel portafiltro e montare il portafiltro. Collegare l'ingresso del porta filtro assolutoad una porta di campionamento aerosol plenum centrale e l'uscita ad una sorgente di vuoto impostato per campionare l'aerosol ad una portata di 1 l / min per tutta la durata dell'esperimento.
NOTA: La massa di farmaco sul filtro dopo il campionamento per 45 minuti può essere nel range sub-microgrammi e / o essere mescolato con lattosio, sale NaCl, o altro veicolo. Una microbilancia che legge a 0,1 microgrammi è necessario. Per ottenere un peso esatto di farmaco depositate sul filtro, il filtro deve essere equilibrato e pesato in un ambiente ad umidità controllata. Il peso di farmaco sui filtri può essere utilizzato solo in calcolo della dose se non c'è nessun veicolo nella formulazione o il veicolo è acqua. Quando c'è un veicolo nella formulazione diversi dall'acqua, il peso della sostanza sul filtro fornisce soltanto un punto di partenza stimato per ulteriori analisi di contenuti farmaco mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). - Pesare e registrare il peso dei filtri stadio impattore 7 cascata e uno "bocchettone" finale; filtro. Collocare un filtro su ciascuno dei sette stadi del dispositivo di simulazione a cascata e montare la cascata di simulazione Mercer 28. Collegare l'ingresso del dispositivo di simulazione a cascata ad una porta di campionamento plenum aerosol centrale e l'uscita ad una sorgente di vuoto impostato per campionare l'aerosol a portata di simulazione cascata è calibrato a (solitamente 0,5 o 1 L / min) per la durata del sperimentare.
- Monitorare il contenuto di aerosol dell'unità di inalazione di aerosol con il monitor in tempo reale (vedi Tabella dei materiali e reagenti) per confermare i generatori aerosol sono funzionali e producendo un aerosol stabile per tutto l'esperimento. Collegare l'ingresso del monitor aerosol tempo reale ad una porta di campionamento aerosol plenum centrale e l'uscita ad una sorgente di vuoto impostato per campionare l'aerosol ad una portata di 1 l / min per tutta la durata dell'esperimento.
NOTA: Il segnale del tempo monitor reale aerosol è riportata in g / L, ma è calibrato per la polvere stradale e deve essere ricalibratoper ogni singolo aerosol farmaco per ottenere valori di concentrazione di aerosol corretti. Calibrazione non è necessaria per utilizzare il monitor per confermare la presenza o l'assenza e la stabilità temporale di concentrazione di aerosol. - Impostare i parametri di controllo di processo (flusso d'aria, vuoto, pressione, aerosol potenza del generatore) ai valori richiesti che dipende dal numero di animali da collegare all'unità inalazione. I generatori unità inalazione e aerosol sono continuamente controllati / monitorati da un sistema di controllo / acquisizione dati computerizzato (DACO) fornito dal produttore (vedere Tabella dei materiali e reagenti). Portata d'aria all'interno dell'unità di inalazione deve essere minimamente di circa 2 volte il tasso totale di ventilazione minuto di tutti gli animali presenti nell'unità di inalazione al fine di evitare un accumulo di CO 2.
- Pesare il filtro assoluto e registrare il peso del filtro. Posizionare il filtro nel portafiltro e montare il portafiltro. Collegare l'ingresso del porta filtro assolutoad una porta di campionamento aerosol plenum centrale e l'uscita ad una sorgente di vuoto impostato per campionare l'aerosol ad una portata di 1 l / min per tutta la durata dell'esperimento.
- Topi carico in limitazione dei movimenti naso sola prima dell'esposizione all'aerosol nell'unità inalazione naso sola. Anche caricare ritenuta animali di controllo dello stress inper la limitazione dei movimenti di respirare aria ambiente.
NOTA: Un esperimento di dose / risposta si compone di più gruppi di topi esposti all'aerosol per diverse quantità di tempo. Il tempo di esposizione è usato per controllare la dose ogni gruppo riceve durante un esperimento di dose / risposta.- Angle il contenimento tubo verso il soffitto durante il caricamento degli animali, in quanto tendono a correre verso l'alto cercando di scappare. Indicando i tubi verso il basso durante il caricamento incoraggerà voltarsi e fuggire dal retro del tubo. Garantire il naso del mouse viene orientato nella estremità appuntita del tubo e fissare lo stantuffo posizione variabile nel lato posteriore del dispositivo di immobilizzazione.
NOTA: Lo stantuffo è modellato per consentire la coda del topo di sporgere dal supporto, che permette il mouse per regolare la sua temperatura corporea mentre nel dispositivo di immobilizzazione. - Regolare lo stantuffo per permettere ai topi di ruotare, ma non ruotare testa alla coda; garantire l'aerosol viene inalato.
- Monitorare continuamente latopi mentre nei tubi di ritenuta. Dopo aver posizionato il pistone, piccoli topi (<20 grammi) spesso tentano di girare testa alla coda nei tubi e adottano una U posizioni dove hanno problemi di respirazione. Questo comportamento di sterzata è più diffusa nei primi 5 minuti di contenzione, dopo che i topi raramente tentano di girare la testa alla coda.
- Angle il contenimento tubo verso il soffitto durante il caricamento degli animali, in quanto tendono a correre verso l'alto cercando di scappare. Indicando i tubi verso il basso durante il caricamento incoraggerà voltarsi e fuggire dal retro del tubo. Garantire il naso del mouse viene orientato nella estremità appuntita del tubo e fissare lo stantuffo posizione variabile nel lato posteriore del dispositivo di immobilizzazione.
3. Aerosol consegna
- Inserire tappi per collegare gli attacchi di mandata dell'unità inalazione e attivare il generatore di aerosol, controllore di flusso di aria compressa, e la pompa per vuoto unità inalazione all'interno del software di controllo di processo.
- Una volta che le letture dal monitor aerosol tempo reale dimostrano la concentrazione di aerosol deve venire all'equilibrio (~ 30 min, figura 2), iniziare a rimuovere i tappi e inserendo i tubi naso sola immobilizzazione contenenti topi nell'unità inalazione. Ripetere l'operazione fino a quando tutti i mouse per essere esposti al farmaco sono collegati all'unità inalazione.
NOTA: Inl'esperimento esempio, il flusso d'aria totale fornito all'unità inalazione attraverso il generatore di aerosol e diluizione dell'aria è regolata per fornire una portata / min 0,5 L per ciascuna delle porte di esposizione animali in uso. Ad esempio, un / min flusso d'aria totale L 15 è sufficiente a fornire ciascuno dei 30 porti nell'unità inalazione. Questo è molto più flusso d'aria di quanto richiesto dalla ventilazione minuto dei topi, ma un flusso d'aria più grande è necessario fornire la (caduta di pressione attraverso il generatore di aerosol) per produrre energia (atomizzare / de-agglomerato) dell'aerosol. - Una volta che tutti gli animali sono caricati nell'unità esposizione, accendere le pompe per vuoto campionamento che sono collegati al filtro e impattore a cascata assoluto utilizzando il software di controllo di processo.
- Quando tutte le esposizioni sono completati, spegnere il generatore di aerosol e rimuovere topi rimanenti dall'unità inalazione.
NOTA: Gli animali saranno trattati in un cappuccio stazione di modifica o da personale che indossa una maschera facciale. Dopo la conclusione della consegna di aerosol, i topi sono rdell'uso e rimossi dai tubi e le provette vengono sterilizzate dopo ogni uso.
4. Calcolo del depositato Dose
- Per calcolare la dose depositata 29 in mg / kg (Equazione 1) moltiplicare la concentrazione del farmaco nel aerosol (mg / L) ventilazione x minuti (L / min) x durata dell'esposizione (min) x frazione inalabile x frazione deposizione polmonare e dividere per il peso corporeo (kg).
- Calcolare la concentrazione di aerosol (ug / L) dividendo la massa di farmaco sul filtro assoluto (ug) per la portata d'aria attraverso il filtro (L / min) moltiplicato per il tempo di campionamento (min). Stimare ventilazione minuto del topo da un'equazione allometrica base al peso corporeo 30. La frazione inalabile è 1 come l'aerosol è stata passata attraverso un pre-separatore per rimuovere particelle non respirabili, e la frazione deposizione polmonare è determinato dal MMAD aerosol farmaco (figura 3) usandocurve di taratura sperimentali aerosol monodisperse (Figura 4) 31.
Representative Results
Il bromuro broncodilatatore ipratropio è stato disciolto in soluzione fisiologica 0,9% normale ad una concentrazione di 1 mg / mL. Una siringa 100 mL è stato riempito con la soluzione di formulazione ipratropio e la siringa è stato inserito in una pompa a siringa destinata ad alimentare il nebulizzatore getto (figura 1) ad una velocità di flusso di 1 ml / min. Attivando il sistema di controllo per l'unità di inalazione inizia a 10 L / flusso dell'aria minuti al nebulizzatore a getto, 5 L / min portata dell'aria di diluizione nella camera di diluizione, e 15,5 L / min di flusso dell'aria di aspirazione per attirare l'aerosol farmaco dalla unità di inalazione una volta che passa il naso dei topi. La pompa a siringa e in tempo reale pompa di campionamento del monitor di aerosol sono stati attivati. Ventiquattro topi sono stati inseriti nell'unità inalazione dopo che il monitor aerosol tempo reale conferma la concentrazione di aerosol nell'unità inalazione era raggiungere un equilibrio (15-30 min, Figura 2). pompe campione per il filtro assoluto (1 L / min) e in cascataimpattatore (0,5 l / min) sono stati trasformati in una volta tutti i topi sono stati collegati all'unità inalazione. Il primo gruppo di 8 topi è stato rimosso dall'unità inalazione dopo 5 minuti, il secondo gruppo dopo 15 minuti, e il terzo gruppo dopo 45 min. Broncocostrizione 32 è stata misurata come l'aumento della resistenza respiratorio sistema (RR) ad una singola dose di metacolina nebulizzata (30 mg / mL) presentate 2 ore dopo la somministrazione di ipratropio usando l'respiratore roditore 33. L'incremento percentuale in Rrs per ciascun animale, calcolata come massimo Rrs durante l'intervallo di 3 minuti dopo nebulizzato metacolina (Rmax) meno il valore Rrs della misurazione basale prima metacolina (Rbase) diviso per Rbase (aumento% in Rrs = (Rmax -Rbase) / Rbase), è stato utilizzato per quantificare la broncocostrizione.
L'aerosol depositato sui filtri impattore a cascata e filtro assoluto durante i 45 minuti di esposizione aerosol viene sciolto in50% di acetonitrile e la massa di ipratropio quantificato mediante HPLC (Tabella 1). La MMAD x / GSD dell'aerosol ipratropio stata calcolata essere 1,7 x / 1,5 um (figura 3) ed una frazione di deposizione (DF) di 0,037 per topi è stato utilizzato per un aerosol con un MMAD di 1,7 um (Figura 4). La frazione inalabile (IF) era 1 come l'aerosol è stata passata attraverso un pre-separatore per rimuovere particelle non respirabili. La concentrazione media di ipratropio nell'aerosol (0,5 ug / L) è stata calcolata dalla massa di ipratropio sul filtro assoluto (22 ug) diviso per la portata di aria tirato attraverso il filtro (1 L / min) moltiplicato per il tempo di campionamento (45 min). Il peso corporeo medio dei topi era 0.019 kg e la loro ventilazione predetto minuto è stata calcolata come 0.021 L / min. Utilizzando l'Equazione 1, le dosi depositate a 5, 15, e 45 min gruppi di esposizione era di 0,1, 0,3, e 0,9 ug / kg; rispettivamente.
= "1"> Ipratropium inibito nebulizzata metacolina broncocostrizione indotta a 8 settimane di età topi C57BL / 6. Metacolina aumentato Rrs pochi secondi dalla somministrazione nebulizzato (figura 5, pannello superiore). Le Rrs del gruppo di controllo (esposti all'aria camera invece di ipratropio aerosol) è aumentato da un valore basale di 0,62 ± 0,03 cm H 2 O * s / ml ad un valore massimo di 1,66 ± 0,12 cm H 2 O * s / mL, che rappresentano un aumento 168 ± 9% in Rrs, 70 s dopo la somministrazione aerosol metacolina. L'aumento per cento in respiratoria resistenza del sistema è stato inibito in modo dose-dipendente da dosi per via inalatoria di ipratropio. L'incremento percentuale in Rrs è stato inibito del 51 ± 9%, 79 ± 14%, e 89 ± 2% (figura 5, pannello inferiore) a dosi depositati inalatoria di ipratropio di 0,1, 0,3, e 0,9 ug / kg, rispettivamente.
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Figura 1: unità inalazione con generatore di aerosol in polvere secca allegata. Il nebulizzatore utilizzato per generare aerosol da formulazioni liquide viene visualizzata sulla destra. 1) alimentazione Wright polvere, 2) ciclone, 3) pompa a siringa, 4) nebulizzatore inserito nella pre-separatore, 5) miscelatore aria di diluizione. Durante l'erogazione aerosol nebulizzate, l'alimentazione della polvere e ciclone sono sostituiti dalla pompa siringa, nebulizzatore / pre-separatore e miscelatore aria di diluizione. La vista ingrandita (modificato da Oldham 21) mostra il percorso di flusso di aerosol nella zona di respirazione attorno al naso dell'animale che viene creato inserendo il tubo di ritegno nell'unità inalazione. L'aerosol riempie l'aerosol centrale plenum (grigio) dell'unità inalazione, fluisce verso il naso dell'animale dove viene tirato indietro da una leggera depressione nel (bianco) plenum esterno e nei filtri di raccolta (non mostrato). Plfacilità clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: misurazioni in tempo reale del monitor aerosol confermare la concentrazione di aerosol nell'unità inalazione raggiunge l'equilibrio ~ 30 minuti dopo l'accensione del generatore di aerosol. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: massa Ipratropio raccolto su ogni fase del dispositivo di simulazione cascata (blu grafico a barre) rivestito con misura della curva (curva nera) utilizzato per calcolare il MMAD e GSD della distribuzione dimensionale delle particelle di aerosol. per favoreclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: frazione Deposizione per i polmoni del mouse come funzione di MMAD per aerosol per inalazione consegnati naso sola (come modificato da Hsieh 31). Per particelle di dimensioni inferiori a 0,5 um maggior dell'aerosol esala e non si deposita nei polmoni (come il fumo di sigaretta). Per particelle di dimensioni superiori a 5 um, più dell'aerosol viene filtrato dal naso. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Il rapido aumento della resistenza respiratorio sistema indotta da metacolina nebulizzata administerosso a topi è bloccato da ipratropio consegnato per inalazione naso-soltanto topi (n = 8 per gruppo, pannello superiore). Ipratropio inibito l'aumento indotto metacolina in respiratorio resistenza sistema con un ED50 di 0,1 ug / kg dose depositata (* p <0,05 rispetto al controllo, pannello inferiore). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Dati Impactor Cascade utilizzati per calcolare MMAD e GSD | ||
| Filtro Fase | Ipratropium del filtro mediante HPLC (mg) | Fase Cut Diametro (mm) |
| 1 | 0.002 | 6 |
| 2 | 0,19 | 4.5 |
| 3 | 1.43 | 2.5 |
| 4 | 2.55 | 1.5 |
| 5 | 2.95 | 1.2 |
| 6 | 1.03 | 0.7 |
| 7 | 0.37 | 0.5 |
Tabella 1: dati Impactor Cascade utilizzati per calcolare MMAD e GSD
Discussion
Un sistema di inalazione naso sola e il suo funzionamento per fornire aerosol farmaceutici ai polmoni di roditori è stata descritta. All'immobilizzazione degli animali nei supporti naso sola è un metodo comunemente utilizzato per esporre gli animali a materiale disperso nell'aria. Un esperimento è stato condotto dimostrando l'anticolinergico broncodilatatore ipratropio bromuro 34 può potentemente invertire metacolina broncocostrizione indotta quando somministrato per inalazione naso solo a topi con un ED50 di 0,1 ug / kg dose depositata. Un aumento di oltre 10 volte nella dose efficace di ipratropio era necessario per broncodilatazione dopo la consegna intratracheale (ED 50 intratracheale = 1,3 ug / kg, dati non mostrati) consegna. Ciò è dovuto al modello deposizione non omogenea del farmaco nei polmoni prodotti dalla somministrazione intratracheale 3, 5, 10. 10 volte e maggiore dose efficacedifferenziali tra le tecniche di dosaggio per via inalatoria e intratracheali di altri farmaci sono stati osservati in precedenza da altri 4.
Il pattern di deposizione non omogenea del farmaco nei polmoni prodotti dalla somministrazione intratracheale rallenta anche l'assorbimento del farmaco da parte del polmone 35, diminuendo la velocità alla quale il farmaco entra nella circolazione sistemica e diminuendo le probabilità di vedere gli effetti collaterali sistemici. Pertanto, per ottimizzare la sicurezza / efficacia (indice terapeutico) 36 di farmaci inalatori nuovi, naso sola consegna inalatoria deve essere utilizzato. deposizione intratracheale darà una stima imprecisa della TI generando erroneamente alte dosi efficaci nelle dosi basse polmone e nella circolazione sistemica.
Man mano che vengono sviluppati nuovi farmaci erogati per via inalatoria, è indispensabile per tradurre in modo appropriato la dose efficace farmaco da studi di efficacia preclinici di prevedere un efdose umana ficacious per le sperimentazioni cliniche. La morte infame Tusko elefante 37 è comunemente citato nella letteratura ricordano per effettuare il ridimensionamento allometrica per prevedere dosi interspecie droga e che dosi interspecie farmaco non deve essere linearmente estrapolato sulla base di un semplice confronto di masse corporee. E 'comune l'uso di un approccio allometrica con un esponente b allometrica di 0,67 per predire dosi dei farmaci umani da efficacia preclinica studia 38. Utilizzando il mouse inalato ED 90 di 0,9 mg / kg per ipratropio, un esponente allometrica di 0,67, una massa corporea topo di 0,03 kg ed una massa corpo umano di 60 kg; un ED umano stimato 90 di 0,07 mg / kg ((0,9 * (0,03 / 60 ) (1-0.67) = 0,07) può essere calcolato come la dose depositata umano predetto dai nostri dati del mouse. Questo valore predetto è paragonabile alla umano reale efficace dose depositata di 0,26 mg / kg, che può essere calcolato dal consegnato farese di 40 ug 39 divisa per la massa del corpo umano di 60 kg moltiplicata per una frazione umano orale deposizione polmonare inalazione 16 di 0,4 ((40/60) * 0,4 = 0,26). Una stima della dose inalata depositato umana efficace aiuta anche a pianificare le dosi consegnate utilizzati negli studi di tossicologia per inalazione necessari per la sperimentazione clinica 40.
Le attrezzature specializzate e grandi quantità di composto di prova (quantità dell'ordine del grammo) necessario per il naso sola somministrazione di farmaci per via inalatoria possono essere significative limitazioni nello sviluppo della tecnica di inalazione naso-soltanto. Una corsa di calibrazione senza animali presenti è necessario se è necessaria una dose specifica per una (di solito tossicologia e non un 'efficacia della dose / risposta) di studio, e questa corsa di taratura richiederà più di droga ad essere disponibili. Questa corsa di taratura è necessaria perché le proprietà fisico-chimiche di ciascun farmaco / formulazione può variare abbastanza per influenzare notevolmente la dose depositatadi farmaco nei polmoni. Ottimizzazione dei flussi d'aria e dei mangimi farmaco al generatore di aerosol durante la corsa di taratura è necessario per ottenere una dimensione di particelle aerosol e concentrazione per il dosaggio specifico richiesto. Mentre le quantità d'aria e dei mangimi farmaco generatore di aerosol proposte ai metodi sono un punto di partenza ragionevole, esiste la possibilità che una formulazione di medicamento specifico sarà generato un non-respirabile (granulometria> 5 mm) aerosol. Nella fase preclinica, c'è spesso non è sufficiente farmaco disponibile per fare una corsa di calibrazione ed è impossibile sapere a priori quale dosi (se presenti) sono sempre nei polmoni. Inoltre, l'elettricità statica viene prodotto durante il processo di generazione di aerosol e può influenzare il tempo necessario per la concentrazione di aerosol ad equilibrarsi. E 'importante nella messa a terra l'attrezzatura per ridurre al minimo la carica statica. Un'altra opzione per ridurre al minimo l'elettricità statica è quello di aggiungere umidità dell'aria fornita all'unità inalazione, per aumentare la conduttività edissipare le cariche elettrostatiche sulle particelle 25. Umidificare l'aria fornita al generatore di aerosol non è necessaria per il comfort degli animali durante brevi (<1 h) sessioni di dosaggio, ma dovrebbe essere presa in considerazione se si utilizzano tempi di dosaggio più.
I farmaci possono essere consegnati ai polmoni di animali per inalazione naso solo passiva o metodi di gestione intratracheali diretti che ignorano la deposizione del rinofaringe. Naso-soltanto la consegna inalazione è comunemente utilizzato nel campo della tossicologia per inalazione 41, ma viene utilizzato con parsimonia nelle prime fasi del processo di scoperta di nuovi farmaci. Un gruppo di ricerca multidisciplinare è necessario per lo svolgimento di studi di inalazione naso-solo per la: necessità di grandi quantità di droga, conoscenze specialistiche necessarie per formulare, generare e caratterizzare gli aerosol; utilizzare attrezzature complesse, e misurare l'efficacia dei farmaci in modelli animali di malattie respiratorie. Le tecniche di consegna qui descritti sono utilizzati per sviluppare Small molecola farmaci per via inalatoria, ma in futuro può essere applicata per sviluppare farmaci biologici per via inalatoria 42, 43. Speriamo che le procedure e suggerimenti documentate in questo manoscritto faciliterà scoperta di nuovi farmaci e tossicologia ricercatori pre-clinici per acquisire le competenze necessarie per fornire farmaci ai roditori per inalazione di aerosol.
Disclosures
Tutti gli autori impiegati da Amgen. spese di pubblicazione di questo video-articolo sono pagati da Amgen.
Acknowledgments
Noi riconosciamo: Dr. Thomas Budiman al TSE Systems GmbH per la sua tecnica di personalizzazione competenze e attrezzature. John Fry (Battelle Inc.) e il Dr. Rudy Jaeger (CH Technologies Inc.) per i loro utili discussioni. Tian Wu, Sam Mboggo, April Miller, e Sean Davis (Amgen) per un aiuto con gli esperimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nose-only exposure inhalation unit | TSE systems | 700100-KNES-040-ss | Custom configurations available |
| DACO data acquisition system | TSE systems | 700400-PRO-C-D/1 | |
| MC One Jet Mill | Jetpharma | DEC MicroJet 10 | |
| Turbula Mixer | GlenMills Inc | T2F | |
| Micronized Lactose | DFE Pharma | Lactohale 200 | |
| Hydraulic press | Specac | GS15011 | |
| Cascade impactor filters | Pall Life Sciences | 7219 | Emfab filter |
| Absolute filters | Whatman | 10370302 | 5 cm diameter |
| Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor |
Casella | CEL-712 | |
| Ipratropium bromide | Spectrum Chemical | I1178 | pre-micronized |
| flexiVent FX1 system | scireq | FV-FXCS |
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