Summary
Das Inhalationsgerät kann hier beschrieben, Probe zur Charakterisierung, erzeugen und gleichmäßig ein Medikament Aerosols in den Lungen von Nagetieren abzuscheiden. Dies ermöglicht die präklinische Bestimmung der Wirksamkeit und Sicherheit von Arzneimitteldosen in der Lunge abgelagert; Schlüsseldaten ermöglichen, die klinische inhalierten Arzneimittelentwicklung.
Abstract
Obstruktive Atemwegserkrankungen wie Asthma und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) werden derzeit von inhalierten entzündungshemmende und Bronchodilatator Medikamenten behandelt. Trotz der Verfügbarkeit von mehreren Behandlungen, wachsen beide Krankheiten der öffentlichen Gesundheit. Die Mehrheit der Asthma-Patienten auf aktuelle inhalativen Therapien gut kontrolliert, aber eine beträchtliche Anzahl von Patienten mit schwerem Asthma ist es nicht. Asthma leiden schätzungsweise 300 Millionen Menschen weltweit und rund 20 Prozent haben eine schwere Form der Krankheit. Im Gegensatz zu Asthma gibt es nur wenige wirksamen Therapien für COPD. Schätzungsweise 10% der Bevölkerung hat COPD und der Trend der Sterberaten für COPD steigt, während für andere schwere Krankheiten zu verringern. Obwohl die Entwicklung von Medikamenten zur inhalativen Lieferung herausfordernd sind, ermöglicht die Nase nur zur Inhalation direkte Lieferung von neuen Medikamenten in die Lunge von Nagetieren für die präklinische Wirksamkeit und Sicherheit / Toxikologie-Studien. Inhalativen Arzneimittelabgabehat mehrere Vorteile bei Atemwegserkrankungen, bei denen eine hohe Konzentration in der Lunge verbessert die Wirksamkeit und systemische Nebenwirkungen minimiert. Inhalativen Kortikosteroiden und Bronchodilatatoren profitieren von diesen Vorteilen und inhaliert Lieferung kann auch für zukünftige biologische Therapien Potential halten. Das Inhalationsgerät kann hier beschrieben, Probe zur Charakterisierung, erzeugen und gleichmäßig ein Medikament Aerosols in den Lungen von Nagetieren abzuscheiden. Dies ermöglicht die präklinische Bestimmung der Wirksamkeit und Sicherheit von Arzneimitteldosen in den Lungen von Nagetieren abgelagert, Schlüsseldaten erforderlich, bevor die klinische Entwicklung zu initiieren.
Introduction
Es gibt viele Vorteile bei der inhalativen Verabreichung von Medikamenten zur Behandlung von Atemwegserkrankungen. Inhalative Lieferung gilt das therapeutische Mittel direkt an den Wirkort, der Lunge. Eine hohe lokale Konzentration des Wirkstoffs in der Lunge bietet einen wesentlichen Vorteil, dass Dosis und die systemische Exposition minimiert und maximiert Wirksamkeit. Dies ist ein wichtiger Vorteil, dass erheblich den therapeutischen Index erhöhen (TI, das Verhältnis der Dosis des Arzneimittels, die eine Nebenwirkung auf die Dosis des Medikaments bewirkt, die die Wirksamkeit zur Verfügung stellt) eines Arzneimittels. Inhalierte β 2 -adrenergen Agonisten, Kortikosteroide und anticholinerge Medikamente haben bei der Verbesserung der Lungenfunktion bei Patienten mit Asthma und COPD, bei gleichzeitiger Minimierung der systemischen Nebenwirkungen (Tachykardie, Immunsuppression und Verstopfung) als wirksam erwiesen beobachtet , wenn diese Medikamente oral eingenommen werden. Neue Wirkstoffklassen (zum Beispiel PDE4 - Inhibitoren 1 und BTK - Inhibitoren 2) haben vor kurzembewährt Lungenfunktion in vorklinischen Tierkrankheitsmodellen zu verbessern , sondern, ähnlich 2 -Agonisten, Kortikosteroide ß und anticholinergische Drogen, leidet an systemischen Nebenwirkungen , die durch inhalierten Lieferung minimiert werden können. Aufgrund der zusätzlich Kosten für die Entwicklung von inhalativem vs. oralen Medikamenten, soll eine inhalierte Formulierung nur für respiratorische Indikationen nach erfolgreicher oral / systemische Verabreichung zeigt mechanismusbasierte systemische Nebenwirkungen zu begrenzen Dosis in Betracht gezogen werden.
Vorklinisch werden inhaliert Verbindungen optimiert , um den TI zu erhöhen, die in vivo Wirksamkeit und Nebenwirkungsmessungen erfordert. Zunächst können diese Messungen in getrennter Assays durchgeführt werden, in der Regel eine topisch gelieferte Wirksamkeit Messung und eine systemisch Nebeneffekt Messung geliefert, aber um wirklich Verbindungen zu vergleichen, Wirksamkeit und Nebenwirkungen sollten nach Inhalationsverabreichung bei denselben Tieren gemessen werden. Dies erfordert Dosis / Wirkungs-Studien, dass achievt genug Verbindung in die Lunge verabreicht, um eine meßbare Nebenwirkung zu induzieren. Der einzige Weg , zur Zeit gleichmäßig verteilt große Dosen des Arzneimittels in die Lungen von mehreren Kleintieren gleichzeitig ist die Nase nur Inhalation 3, 4, 5. Die Stärken und Schwächen der verschiedenen inhalative Exposition Techniken vor kurzem wurden 6 überprüft, 7, 8. Spezialausrüstung und eine große Menge an Testverbindung (Gramm-Mengen) für die Nase nur inhalierte Arzneimittelabgabe erforderlich, aber Proof-of-Concept-Studien möglich sein können, mit anderen Mitteln.
Wenn die Menge an Arzneimittel begrenzt ist (mg Mengen), sind direkte Verabreichungsmethoden eine Option, aber alle leiden unter nicht homogenen Ablagerung mit mehr Medikament entlang der zentralen Atemwege konzentriert und weniger gut in der parenchymalen / alveolar dargestelltBereiche 3, 4, 5. Die effektive Dosis durch direkte Instillation geliefert wird , immer höher und kann nie direkt 4 bis inhalativen Dosen verglichen werden. Direkte Instillation Methoden einschließlich intranasaler 9, intratracheal Flüssigkeit 10, 11 und Spritz Instillation 12 oder Trockenpulver - Insufflation 13, 14 können als Screening - Werkzeug verwendet werden , um den ungefähren Dosisbereich für die späteren nasen nur Inhalationsstudien zu bestimmen, oder die zu bestimmen Ranking der Wirksamkeit / Toxizität für eine Reihe von strukturell ähnlichen Drogen 15. Aufgrund der zentralen Atemwegsablagerungsmuster kann die direkte Verabreichung Methoden nützlicher sein, um die Wirkungen der Verbindungen zu bestimmen, die auf den zentralen Atemwege (Inhibitoren Bronchodilatatoren oder Mastzellen) wirken als in die periphere Lunge (Antiphlogistika).
Im Gegensatz zum Menschen, der eine erhebliche Dosis konzentrierten Aerosols aus einem Inhalator in einem einzigen tiefen Atemzug, kontinuierliche Erzeugung eines einatembaren (0,5-5 & mgr; m mittleres aerodynamisches Massendurchmesser, MMAD) Aerosol inhalieren kann, für bis zu einer Stunde, deponieren ist erforderlich, eine wirksame Arzneimitteldosis in ein spontan Nagetier der Lunge in einem Nase nur Inhalationssystem 16 zu atmen. Aerosolgeneratoren (jet nebulizer oder Wright Staubaufgabe 17) , die kontinuierlich die erforderlichen Aerosolteilchengröße und Konzentration für Naseninhalationsstudien nur erzeugen können , sind nicht sehr effizient bei der Erzeugung hoher Qualität (einatembaren) Aerosol. Die Arzneimittelzufuhrraten dieser Aerosolgeneratoren für potente (IC 50 pM bis nM in funktioneller Zell - basierter Assays) Verbindungen sind die üblicherweise in dem 1 bis 10 mg / min - Bereich und in der Regel weniger als 1% des Arzneimittelaerosols macht es den Atmungszone der Tiere(Abbildung 1). Viele der Teilchen erzeugt werden, sind zu groß (> 5 um) in die Lunge zu gelangen und sind durch einen Aerosol Klassifikator (Vorabscheider oder Zyklon mit einem 5 & mgr; m Schnittpunkt) entfernt, um eine große Dosis des Wirkstoffs in der Nase zu vermeiden. Zugabe zu der Ineffizienz der nasen nur Inhalationssysteme ist der kleine Partikelgröße im Bereich (0,5 bis 5 um MMAD) für einatembaren Teilchen. Viele der Aerosolteilchen weniger als 0,5 um ausgeatmetes wird (wie Zigarettenrauch) und nicht in der Lunge 18 abgeschieden. Auch viele des „größeren“ Aerosolteilchen (~ 5 & mgr; m) Ablagerung in der Nase wird durch mukoziliäre Clearance in Richtung der Rückseite der Kehle aufgenommen oder transportiert werden, wo sie in den Magen 19 geschluckt werden. Wenn die Nase nur Inhalation verwenden, die Dosis in der Nase abgelagert ist immer größer als die Dosis in der Lunge abgelagert und die Nasendosis kann 20 bis systemische Exposition und Nebenwirkungen beitragen. Von Natur aus, inhaliert drug Dosen sind klein (im Mikrogrammbereich) durch die nasale, Lungen- oder Magen-Darm-Gewebe absorbiert jede systemische Nebenwirkungspotential des Arzneimittels zu minimieren. Selbst wenn die Partikelgröße des Aerosols zu den Tieren zugeführt wird, in dem Bereich einatembaren, einen Durchschnitt von nur 4% der Aerosolpartikel, die es in der Atemzone der Tiere Ablagerung in den Lungen zu machen. Effizientere Aerosolgeneratoren sind verfügbar, aber die Strahl-Vernebler und Wright Staubaufgabe für ihre Fähigkeit, kontinuierliche Aerosolen aus verschiedenen flüssigen und trockenen Pulverformulierungen bzw. zu erzeugen unerreicht sind.
Einatembaren Aerosol aus dem Vorabscheider gelangt in die nasen nur Belichtungsinhalationseinheit 21 , die auf einer Strömungs Vergangenheit der Nase 22 Design basieren. Das Inhalationsgerät besitzt 3 Reihen (nur zwei Ebenen in Abbildung 1 dargestellt sind), und jede Spur enthält 10 Exposition Ports für Tiere und Aerosol Probenahme. Die Anschlüsse befinden sich am Umfang um den central Aerosol plenum. Conscious Mäuse werden in Glashaltehaltern (6 Zoll lang und 1,2 Zoll Durchmesser) und atmen die Aerosolgehalte des Inhalationsgerätes gegeben. Die Mäuse sind nicht auf die Rückhaltevorrichtungen 23 akklimatisiert. Die bisherige Erfahrung hat gezeigt , dass Mäuse Rohrstütze von weniger als eine Stunde Dauer in ähnlicher Weise tolerieren, mit oder ohne Anpassung 2.
Das Inhalationsgerät ist so konzipiert, Arzneimittel Aerosole direkt in den Lungen der Tiere zu liefern, während der Betreiber zu vermeiden Exposition. Die Wirksamkeit / Toxizität dieser Medikamente ist in der Regel unbekannt und mehrere Kontrollen der Sicherheitstechnik eingesetzt werden Exposition gegenüber den Betreibern zu vermeiden. Die Betreiber müssen immer persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Laborkittel, Beatmungsgeräte und Schutzbrille) tragen. Das äußeree Plenum des Inhalationsgerätes unter Unterdruck zu allen Zeiten während des Betriebes, so dass für die sichere Entfernung von einzelnen oder Gruppen von Tieren without Abschalten des Aerosolgenerators aus. Das Inhalationsgerät ist auch in einem sekundären Gehäuse bei einem Unterdruck durch eine Abgasöffnung in der Decke zu verhindern, dass ein Entweichen des Aerosols in den Raum, im Fall einer Störung aufrechterhalten enthält. Alle Abstrom von Luft aus dem Inhalationssystem wird durch einen HEPA-Filter gefiltert, bevor sie in die Umwelt zu. Das Nase nur in diesem Manuskript verwendete Belichtungssystem wurde von einem einzigen Anbieter (siehe zusätzliche Tabelle der Materialien) erworben.
Protocol
Die Mäuse in diesen Studien verwendet wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, achte Ausgabe 24 betreut. Die Mäuse wurden in Gruppen in einem Verein zur Beurteilung untergebracht und Akkreditierung von Labortierpflege (AAALAC) international anerkannte Einrichtung in sterilem belüfteten Gehäuse Mikroisolator auf Maiskolben Bettwäsche. Wenn Bronchokonstriktion Messung wurden die Mäuse anästhesiert mit 100 mg / kg ip Pentobarbital und Tiefe der Anästhesie wurde durch den Mangel an toe Prise Reflex überwacht und durch ip Anästhesie wie nötig gehalten. Am Ende der Versuche wurden die Mäuse durch Genickbruch nach Barbituratüberdosis eingeschläfert. Überprüfung der Euthanasie wurde durch den Mangel an Atmung bestätigt. Keine Überleben Operationen wurden an den Mäusen durchgeführt. Alle Forschungsprotokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen.
1. Formulierung und Geräteauswahl zur Erzeugung von Pharzeutische Aerosol
HINWEIS: Formulierung und Geräteauswahl ist abhängig von den physikalisch - chemischen Eigenschaften des einzelnen Arzneimittel aerolisiert wird daher allgemeine Protokolle werden im Folgenden vorgestellt und der Leser auf die Bewertungen von Zeng bezeichnet wird 25 und O'Riordan 26.
- Trockenpulver - Aerosole
- Mikronisieren Arzneimitteltrockenpulver in einer Kugelmühle, einer Strahlmühle oder einer ähnlichen Vorrichtung 27 und sorgen für die mikronisierte Teilchengrößenverteilung (PSD) enthält Teilchen von atembarer (0,5-5 & mgr; m mittlere aerodynamische Massendurchmesser, MMAD) Partikelgröße. Mischung potente Testverbindungen, die Verdünnung mit mikronisiertem Lactose erfordern.
HINWEIS: Wenn nicht genügend mikronisiertes Pulver ist die PSD mit einem Kaskadenimpaktor, die PSD einer kleinen (sub-Milligramm) Probe des mikronisierten Pulvers zu bestimmen, kann durch Lichtstreuung gemessen werden, es enthält kleine / respirable Teilchen zu bestätigen. - Erzeugen, um das Trockenpulveraerosol eines Wright Staubzufuhrtrockenpulveraerosolgenerator verwendet wird. Packen das mikronisierte Arzneimittel / Lactose - Pulver in dem zylindrischen Behälter unter Verwendung eines manuellen hydraulischen Presse bei etwa 1000 Pfund pro Quadratzoll (psi) bis kompaktierten Pulverkuchen herzustellen als Eingabe durch die Wright verwendet Staubzufuhraerosolgenerator 17.
- Schraube den zylindrischen Behälter auf der Wright Staubzufuhr Vorschieben des Reservoirs, bis das Abstreiferblatt in Kontakt mit dem Medikament Kuchen ist.
- Verbinden des Auslasses des Wright Staubzufuhr zu einem Zyklon und der Einlass zu einer Druckluftquelle auf 15 L / min Luftdurchsatz (Maximaldruck 90 psi).
- Stellen Sie die Vorschubratensteuerung auf 0,7 Umdrehungen pro Minute (rpm) und schalten den Wright Staubzufuhraerosolgenerator.
HINWEIS: 0,7 Umdrehungen pro Minute entspricht eine Testartikel Kuchen-Zufuhrrate von 1 g / h, wenn das kleinen Wright Staubzufuhr zylindrischen Reservoir verwendet wird. Der Wright Staubzufuhr schabt eine dünne Schicht aus verdichtetem powder den Prüfgegenstand Kuchen aus, indem das Reservoir dreht. Luft trägt den Staub aus dem Staub Wright Futter, durch eine Schalldüse zur Deagglomeration, und in einen Zyklon nicht einatembaren Teilchen und Agglomerate zu entfernen. - Verbinden des Auslasses des Zyklons an die zentrale Aerosols plenum der Inhalationseinheit (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Verbindungen können von 300 bis 1500 psi in dem Reservoir des Wright Staubzufuhr komprimiert werden. Die Aufgabe ist es, die Partikel ausreichend zu komprimieren, so werden sie in dem Reservoir zurückgehalten werden, wenn umgekehrt wird, aber nicht so viel, dass die Wright Staubaufgabe nicht eine dünne Schicht für die Wieder Aerosolisierung abkratzen kann. Es muss daran erinnert werden, dass das Messgerät auf der manuellen hydraulische Presse in Pfund liest und der Kolben auf dem kleine Speisereservoir Staub hat eine Fläche von etwa 0,25 Quadratzoll. Daher ist 250 Pfund Preßkraft auf 0,25 Quadratzoll bis 1000 psi äquivalent.
- Mikronisieren Arzneimitteltrockenpulver in einer Kugelmühle, einer Strahlmühle oder einer ähnlichen Vorrichtung 27 und sorgen für die mikronisierte Teilchengrößenverteilung (PSD) enthält Teilchen von atembarer (0,5-5 & mgr; m mittlere aerodynamische Massendurchmesser, MMAD) Partikelgröße. Mischung potente Testverbindungen, die Verdünnung mit mikronisiertem Lactose erfordern.
- Vernebelte flüssige Aerosole
- Man löst den Wirkstoff in 100 ml Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung.
- Laden eine 100-ml-Spritze mit der Medikamentenlösung und legt die Spritze in die Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate eingestellt auf 1 ml / min.
- Verbinden der Spritzenpumpe zu dem Düsenzerstäuber und spüle die Luft aus der Speiseleitung des Zerstäubers führt.
- Verbinden der Druckluftquelle zum Strahl-Vernebler und stellen Sie den Luftdurchflußmesser bis 10 l / min.
- Setzen Sie den Düsenvernebler in den Vorabscheider. Der Vorabscheider verbindet den Vernebler an den zentralen Aerosols plenum der Inhalationseinheit (Abbildung 1).
HINWEIS: Viele Arzneimittelverbindungen haben eine begrenzte Wasserlöslichkeit und sind besser als trockenes Pulver Aerosole formuliert. Wenn eine stabile Suspension aus mikronisiertem (MMAD <5 uM) Verbindung hergestellt werden, es kann mit dem Düsenvernebler verwendet werden. Vorsicht sollte als Suspension verwendet werden kann, den Vernebler verstopfen. Vernebler Zulaufkonzentrationen von 1 mg / ml für potente Verbindungen (wie der BronchodilatatorIpratropium) auf 40 mg / ml-Suspensionen (für Verbindungen weniger potent wie Salbutamolsulfat) verwendet wurden. Die Spritzenpumpenförderrate wird auf 1 ml / min für einen praktischen Grund gesetzt; die Aerosolkonzentration Äquilibrierungsperiode und 45-min-lange Belichtungszeiten zu ermöglichen, ohne die Notwendigkeit, abgeschlossen werden, um die Spritze erneut zu laden.
2. Aerosol Exposition Versuchsaufbau
- Messen Sie die Arzneimittelkonzentration (durch Aerosol auf einem absoluten Sammelfilter) und die Partikelgrößenverteilung (durch Sammeln eines Aerosols Kaskadenimpaktor verwenden) des Aerosols, das die Inhalationseinheit Postvorabscheider / Zyklon eintritt. Verwenden diese Parameter zusammen mit der Minutenventilation des Tieres, das Körpergewicht, und die Belichtungszeit , die Dosis des Arzneimittels in der Lunge abgelagert abzuschätzen.
- Wiegen Sie die absoluten Filter und nehmen Sie das Filtergewicht. Setzen Sie den Filter in den Filterhalter und montieren Sie den Filterhalter. Verbinden des Einlasses des absoluten Siebträgeran eine zentrale Aerosol plenum Probenöffnung und den Auslass mit einer Unterdruckquelle eingestellt das Aerosol mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l / min für die Dauer des Experiments zu probieren.
HINWEIS: Die Masse des Medikaments auf dem Filter nach 45 min Abtastung kann in dem Untermikrogrammbereich und / oder mit Lactose, NaCl-Salz, oder einem anderen Fahrzeug gemischt werden. Ein Mikro, die 0,1 Mikrogramm liest notwendig. Um eine genaue Gewicht des Arzneimittels auf dem Filter abgeschieden zu erhalten, müssen die Filter ins Gleichgewicht gebracht und in einer feuchtigkeitskontrollierten Umgebung abgewogen werden. Das Gewicht des Arzneimittels auf den Filtern kann nur in Dosisberechnung verwendet werden, wenn kein Fahrzeug in der Formulierung ist, oder das Fahrzeug ist Wasser. Wenn ein Fahrzeug in der Formulierung von Wasser verschieden ist, gibt das Gewicht der Substanz auf dem Filter nur einen geschätzten Startpunkt für eine weitere Analyse des Wirkstoffgehaltes durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). - Wiegen und das Gewicht der 7 Kaskadenimpaktor Stufenfilter und ein letztes „Endstück“ Record; Filter. Platzieren einen Filters auf jedem der sieben Phasen des Kaskadenimpaktor und zusammenbauen Mercer Kaskadenimpaktor 28. Verbinden des Einlasses des Kaskadenimpaktor an eine zentrale Aerosol plenum Probenöffnung und den Auslass mit einer Unterdruckquelle eingestellt das Aerosol bei der Strömungsgeschwindigkeit wird der Kaskadenimpaktor auf (in der Regel 0,5 oder 1 l / min) für die Dauer der kalibrierten abzuzutasten Experiment.
- Überwachen Sie den Aerosolgehalt des Inhalationsgerätes mit dem Echtzeit-Aerosolmonitor (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien), um zu bestätigen die Aerosolgeneratoren sind funktional und ein stabiles Aerosol während des Experiments zu erzeugen. Verbinden des Einlasses des Echtzeit-Aerosolmonitor an eine zentrale Aerosol plenum Probenöffnung und den Auslass mit einer Unterdruckquelle eingestellt das Aerosol mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l / min für die Dauer des Experiments zu probieren.
HINWEIS: Das Signal von der Echtzeit-Aerosolmonitor wird in & mgr; g / l berichtet, ist aber für den Straßenstaub kalibriert und muss neu kalibriert werdenfür jedes einzelnes Arzneimittelaerosol korrekten Aerosol-Konzentrationswert zu ergeben. Die Kalibrierung ist nicht erforderlich, um den Monitor zu verwenden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit und zeitliche Stabilität der Aerosolkonzentration zu bestätigen. - Stellen Sie die Prozesssteuerungsparameter (Luftstrom, Vakuum, Druck, Aerosolgeneratorleistung) auf die Werte erforderlich, die von der Anzahl der Tiere hängt mit dem Inhalationsgerät verbunden werden. Die Inhalationseinheit und Aerosolgeneratoren werden kontinuierlich gesteuert / überwacht durch einen computerisierten Prozesssteuerung / Datenerfassungssystem (DACO) des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien). Luftdurchsatz in die Inhalationseinheit sollte minimal etwa 2 - mal die Gesamtminutenvolumenrate aller Tiere in dem Inhalationsgerät sein , um einen Aufbau von CO 2 zu vermeiden.
- Wiegen Sie die absoluten Filter und nehmen Sie das Filtergewicht. Setzen Sie den Filter in den Filterhalter und montieren Sie den Filterhalter. Verbinden des Einlasses des absoluten Siebträgeran eine zentrale Aerosol plenum Probenöffnung und den Auslass mit einer Unterdruckquelle eingestellt das Aerosol mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l / min für die Dauer des Experiments zu probieren.
- Last Mäuse in nasen nur Verzögerer , bevor in der nase nur Inhalationsaerosoleinheit aussetzt. Auch laden Zurückhaltung Stress Kontrolltiere inIn der Verzögerer Raumluft zu atmen.
HINWEIS: Ein Dosis / Antwort-Experiment besteht aus mehreren Gruppen von Mäusen für verschiedene Mengen an Zeit Aerosol ausgesetzt. Die Belichtungszeit wird verwendet, um die Dosis zu steuern, wobei jede Gruppe während eines Dosis / Antwort-Experiments erhält.- Winkel des Halterohr bis zur Decke beim Versuch, die Tiere zu laden, da sie dazu neigen, sich nach oben zu laufen Fluchtversuch zu. Zeigen Sie die Rohre nach unten beim Laden ermutigt Umdrehen und die Rückseite des Rohrs entweicht aus. Stellen Sie sicher, die Nase des Maus in das spitze Ende des Rohrs ausgerichtet ist und fixieren die positionsveränderbare Kolben in das hintere Ende des Verzögerers.
HINWEIS: Der Kolben ist gestaltet der Schwanz der Maus zu erlauben, von dem Halter hervorstehen, die die Maus, während in dem Verzögerer seine Körpertemperatur zu regulieren ermöglicht. - Stellen Sie den Kolben, um die Mäuse zu erlauben, sich zu drehen, aber nicht drehen Kopf-Schwanz; um sicherzustellen, dass das Aerosol inhaliert.
- Kontinuierlich überwachen dieMäuse, während in den Halterohren. Nach der Positionierung des Kolbens versucht kleine Mäuse (<20 g) oft Kopf an Schwanz in den Rohren zu drehen und eine U-Position einnehmen, wo sie Schwierigkeiten beim Atmen haben. Diese Dreh Verhalten ist vor allem in den ersten 5 Minuten der Zurückhaltung nach, dass die Mäuse selten Kopf bis zum Schwanz zu drehen versuchen.
- Winkel des Halterohr bis zur Decke beim Versuch, die Tiere zu laden, da sie dazu neigen, sich nach oben zu laufen Fluchtversuch zu. Zeigen Sie die Rohre nach unten beim Laden ermutigt Umdrehen und die Rückseite des Rohrs entweicht aus. Stellen Sie sicher, die Nase des Maus in das spitze Ende des Rohrs ausgerichtet ist und fixieren die positionsveränderbare Kolben in das hintere Ende des Verzögerers.
3. Aerosolabgabe
- Legen Stoppern die Abgabeöffnungen des Inhalationsgerätes anzuschließen und den Aerosolgenerator, Druckluftdurchflussregler, und Inhalationseinheit Vakuumpumpe aus dem Innern der Prozesssteuerungssoftware aktiviert.
- Nachdem die Messwerte von der Echtzeit - Aerosolmonitor zeigen , hat die Aerosolkonzentration Gleichgewicht (~ 30 min, 2) zu kommen, beginnen Stopfen zu entfernen und das Einsetzen der Nasen nur Rückhalterohre Mäuse in die Inhalationseinheit enthält. Wiederholen, bis alle Mäuse Droge ausgesetzt werden, um das Inhalationsgerät verbunden sind.
HINWEIS:Das Beispiel Experiment wird die Gesamtluftströmung des Inhalationsgerät über den Aerosolgenerator und Verdünnungsluft zugeführt wird eine 0,5 l / min Durchflussrate zu jedem des Tierexpositions Ports in Gebrauch zu liefern. Zum Beispiel wird eine 15 l / min Gesamtluftströmung reicht jeden der Anschlüsse 30 in der Inhalationseinheit zu liefern. Dies ist viel mehr Luftströmung als durch die Minutenventilation der Mäuse erforderlich, aber eine größere Luftströmung ist notwendig, den Energie (Druckabfall über den Aerosolgenerator) zu liefern (zerstäuben / de-Agglomerates), um das Aerosol zu erzeugen. - Sobald alle Tiere in die Belichtungseinheit geladen sind, schalten die Vakuumprobennahme-Pumpen, die mit dem Absolutfilter und Kaskadenimpaktor verbunden sind, um die Prozesssteuerungssoftware.
- Wenn alle Aufnahmen abgeschlossen sind, dreht die Aerosolerzeuger und entfernen restliche Mäuse von Inhalationsgerät aus.
HINWEIS: Die Tiere werden in einer Wechselstation Haube oder durch Personal einen facemask trägt behandelt werden. Nach Abschluß der Aerosolabgabe werden die Mäuse removed aus den Rohren und sind die Rohre nach jedem Gebrauch desinfiziert.
4. Berechnung der deponierten Dosis
- Die abgelagerte Dosis 29 in & mgr; g / kg (Gleichung 1) multiplizieren , um die Konzentration des Wirkstoffs in dem Aerosol (ug / L) x Minutenventilation (L / min) x Expositionsdauer (min) x einatembare Fraktion x pulmonale Abscheidungsfraktion zu berechnen und dividieren durch das Körpergewicht (kg).
- Berechnen Sie die Aerosolkonzentration (ug / L) durch die Masse des Medikaments auf dem absoluten Filter Dividieren (ug) von der Luftströmungsrate durch die Filter (L / min), multipliziert mit der Probenentnahmezeit (min). Abschätzen , ob die Minutenventilation der Maus durch eine allometric Gleichung basierend auf dem Körpergewicht 30. Die einatembare Fraktion 1 ist, wie das Aerosol durch einen Vorabscheider geleitet wurde nicht-respirablen Partikel zu entfernen, und die pulmonale Abscheidungsfraktion wird aus dem Arzneimittelaerosol MMAD bestimmt (Figur 3) unter Verwendung vonexperimentelle Kalibrierkurven von monodisperse Aerosole (Abbildung 4) 31.
Representative Results
Der Bronchodilatator Ipratropiumbromid wurde in 0,9% physiologische Kochsalzlösung bei einer Konzentration von 1 mg / ml gelöst. Eine 100 - ml - Spritze wurde mit der Ipratropium Formulierungslösung gefüllt , und die Spritze wurde in eine Spritzenpumpe eingesetzt , die eingestellt Düsenvernebler (Bild 1) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml / min zuzuführen. Aktivieren des Steuersystems für die Inhalationseinheit einen 10 L / min Luftströmung zu dem Düsenzerstäuber, 5 l / min Verdünnungsluftströmung zu der Verdünnungskammer und 15,5 L / min von Vakuumluftstrom einleitet, die Droge Aerosol aus dem ziehen Inhalationsgerät, wenn es passiert die Nase der Mäuse. Die Spritzenpumpe und Echtzeit-Aerosolmonitor Pumpe Probe wurden aktiviert. Vierundzwanzig - Mäuse wurden in die Inhalationseinheit eingeführt , nachdem der Echtzeit - Aerosolmonitor die Aerosolkonzentration in der Inhalationseinheit bestätigt zum Gleichgewicht gekommen war (15-30 min, Abbildung 2). Die Probe Pumpen für den Absolutfilter (1 l / min) und KaskadeImpaktor (0,5 l / min) wurde eingeschaltet, sobald alle Mäuse wurden mit dem Inhalationsgerät verbunden. Die erste Gruppe von 8 Mäusen wurde aus dem Inhalationsgerät nach 5 min, die zweite Gruppe nach 15 min, und die dritte Gruppe nach 45 min entfernt. Bronchokonstriktion 32 als Zunahme der Atmungsorgane Widerstand (RRS) auf eine einzige Dosis von Methacholin nebulized gemessen wurde (30 mg / mL) lieferten 2 h nach der Dosierung von 33 Ipratropium des Nagetier Respirator verwendet wird . Die prozentuale Zunahme der Rrs für jedes Tier, berechnet als die maximale Rrs über das 3-Minuten-Intervall nach dem zerstäubten Methacholin (Rmax) minus dem RRS Wert der Ausgangsmessung vor Methacholin (Rbase) dividiert durch Rbase (% Erhöhung der Rrs = (Rmax -Rbase) / Rbase) wurde verwendet, um die Bronchokonstriktion zu quantifizieren.
Das Aerosol auf der Impaktor-Filter-Kaskade abgelagert und Absolutfilter während der 45 min der Aerosol-Exposition wurde gelöst in50% Acetonitril und die Masse des Ipratropium quantitativ bestimmt durch HPLC (Tabelle 1). Die MMAD x / GSD des Ipratropium Aerosols wurde berechnet 1,7 x / 1,5 um (Figur 3) und eine Abscheidungs Fraktion (DF) von 0,037 zu sein für Mäuse für ein Aerosol mit einem MMAD von 1,7 um (Figur 4) verwendet wurden. Die einatembare Fraktion (IF) betrug 1 als das Aerosol durch einen Vorabscheider geleitet wurde nicht einatembaren Partikel zu entfernen. Die durchschnittliche Konzentration von Ipratropium im Aerosol (0,5 & mgr; g / L) wurde von Masse von Ipratropium auf dem Absolutfilter (22 & mgr; g) berechnet, indem die Strömungsgeschwindigkeit der Luft geteilt gezogen durch den Filter (1 l / min) durch die Abtastzeit vervielfachte (45 min). Das durchschnittliche Körpergewicht der Mäuse war 0,019 kg und ihre vorhergesagten Atemminutenvolumen wurden als 0,021 L / min berechnet. Unter Verwendung von Gleichung 1, die abgelagerten Dosen für die 5, 15 und 45 min Exposition Gruppen waren 0,1, 0,3 und 0,9 ug / kg; beziehungsweise.
= "1"> Ipratropium gehemmt vernebelten methacholine induzierte Bronchokonstriktion in 8 Wochen alte C57BL / 6-Mäuse. Methacholin erhöhte Rrs innerhalb von Sekunden vernebelt Verabreichung (Abbildung 5, oberes Feld). Die Rrs von der Kontrollgruppe (Raumluft ausgesetzt anstelle von Ipratropium aerosol) erhöhte sich von einem Ausgangswert von 0,62 ± 0,03 cm H 2 O * s / mL auf einen Maximalwert von 1,66 ± 0,12 cm H 2 O * s / ml, was einem 168 ± 9% ige Zunahme der Rrs, 70 s nach dem Methacholin Aerosolverabreichung. Die prozentuale Zunahme der Atmungsorgane Beständigkeit wurde in einer dosisabhängigen Weise durch inhalierten Dosen von Ipratropium gehemmt. Die prozentuale Zunahme der Rrs wurde um 51 ± 9% inhibiert, 79 ± 14% und 89 ± 2% (Abbildung 5, unteres Feld) bei inhaliertem abgelagerten Dosen von Ipratropium von 0,1, 0,3 und 0,9 ug / kg.
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Abbildung 1: Inhalationsgerät mit Trockenpulver - Aerosolgenerator befestigt. Der Vernebler zur Erzeugung von Aerosol aus flüssigen Formulierungen verwendet wird, auf der rechten Seite gezeigt. 1) Wright Staubzuführung, 2) Zyklon, 3) Spritzenpumpe, 4) Düsenvernebler eingefügt in Vorabscheider, 5) Verdünnungsluftmischer. Wenn zerstäubte Aerosole liefern, der Staub Zuführ- und Zyklon sind durch die Spritzenpumpe, Düsenvernebler / Vorabscheider ersetzt und Luftmischer Verdünnung. Die vergrößerte Ansicht (modifiziert nach Oldham 21) den Aerosolströmungspfad an der Atmungszone um Tieres Nase , die durch Einführen des Halterohr in die Inhalationseinheit erstellt wird. Das Aerosol füllt das zentrale Aerosol (grau) plenum der Inhalationseinheit fließt, um das Nase des Tieres, wenn es gezogen wird, durch ein leichtes Vakuum in dem äußeren (weiß) Plenum und in die Abfallsammelfilter (nicht dargestellt) zurück. Plerleichtern klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Echtzeit - Aerosolmonitor Messungen bestätigen die Aerosolkonzentration in der Inhalationseinheit Gleichgewicht erreicht ~ 30 min nach dem Einschalten des Aerosolgenerators dreht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Ipratropium Masse gesammelt auf jeder Stufe des Kaskadenimpaktor (blau Bargraph) überlagerte mit Kurvenanpassung (schwarze Kurve) verwendet , um den MMAD und GSD der Aerosolpartikelgrößenverteilung zu berechnen. Bittehier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Deposition Fraktion zur Mauslungen als Funktion der MMAD für Aerosole durch nasen nur Inhalation (wie von Hsieh modifizierten 31). Für Teilchengrßen von weniger als 0,5 um die meisten der ausgeatmeten Aerosols und abzuscheiden nicht in der Lunge (wie Zigarettenrauch). Für Teilchen grßer als 5 um Größen wird der größte Teil des Aerosols durch die Nase herausgefiltert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Die rasche Zunahme der Atmungsorgane Widerstand durch nebulized Methacholin induzierte administerot an Mäusen durch Ipratropium geliefert durch nasen nur Inhalation an Mäusen (n = 8 pro Gruppe, oberes Feld) blockiert. Ipratropium hemmte die Methacholin induzierten Anstieg des Atmungsorgan Widerstand mit einem ED 50 von 0,1 & mgr; g / kg abgelagerter Dosis (* p <0,05 gegenüber Kontrolle, unteres Feld). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Kaskadenimpaktor Daten verwendet MMAD und GSD zu berechnen | ||
| Bühne Filter | Ipratropium auf Filter durch HPLC (mg) | Stage-Cut Durchmesser (mm) |
| 1 | 0,002 | 6 |
| 2 | 0,19 | 4.5 |
| 3 | 1,43 | 2.5 |
| 4 | 2,55 | 1.5 |
| 5 | 2.95 | 1.2 |
| 6 | 1,03 | 0,7 |
| 7 | 0,37 | 0,5 |
Tabelle 1: Cascade Impactor Daten verwendet MMAD und GSD zu berechnen
Discussion
Ein Nasen nur Inhalationssystem und dessen Betrieb pharmazeutische Aerosole zu liefern in die Lungen von Nagetieren beschrieben worden. Fesselung Tiere in nasen nur Halter ist ein gebräuchliches Verfahren für Tiere airborne Material auszusetzen. Ein Experiment wurde durchgeführt , 34 , um den anticholinergen Bronchodilatator Ipratropiumbromid demonstrieren kann potently Methacholin induzierte Bronchokonstriktion umkehren , wenn sie durch die Nase nur Inhalation an Mäusen mit einem ED 50 von 0,1 & mgr; g / kg deponierten Dosis geliefert. Ein mehr als 10-fachen Anstieg der effektive Dosis von Ipratropium wurde für Bronchodilatation nach intratrachealer Lieferung erforderlich (ED 50 = 1,3 & mgr; g intratrachealen / kg, Daten nicht gezeigt) Lieferung. Dies ist aufgrund der inhomogenen Ablagerungsmuster des Arzneimittels in den durch intratracheale Verabreichung hergestellt Lungen 3, 5, 10. 10-fach und mehr wirksame DosisUnterschiede zwischen inhalativen und intratracheale Dosiertechniken für andere Medikamente werden von anderen 4 beobachtet zuvor.
Die inhomogene Ablagerungsmuster des Arzneimittels in der durch intratracheale Verabreichung hergestellt Lungen verlangsamt auch die Resorption des Wirkstoffs durch die Lunge 35, um die Rate abnimmt , bei der das Medikament den systemischen Kreislauf eintritt , und verringert die Chancen der systemischen Nebenwirkungen zu sehen. Daher die Sicherheit / Wirksamkeit (therapeutischer Index) 36 neuartiger inhalativen Medikamenten zu optimieren, nasen nur sollte Inhalation Lieferung verwendet werden. Intratracheale Abscheidung wird durch die Erzeugung fälschlicherweise hohe wirksame Dosen in der Lunge und geringen Dosen in die systemische Zirkulation eine ungenaue Schätzung des TI geben.
Als neue Medikamente durch die inhalierten Route geliefert entwickelt werden, ist es wichtig, die wirksame Arzneimitteldosis aus präklinischen Studien zur Wirksamkeit angemessen übersetzt eine ef vorherzuzusagenficacious Humandosis für klinische Studien. Der berüchtigte Tod von Tusko 37 der Elefant häufig in der Literatur zitiert wird uns daran zu erinnern , allometric Skalierung zu verwenden zwischenartliche Arzneimitteldosen zur Vorhersage und dass Interarzneimitteldosen sollten nicht linear auf der Grundlage eines einfachen Vergleichs von Körpermassen hochgerechnet werden. Es ist üblich , einen allometric Ansatz mit einem allometric Exponenten b von 0,67 zu verwenden menschlichen Arzneimitteldosen zur Vorhersage von präklinischen Wirksamkeits 38 studiert. Mit der Maus inhalierte ED 90 von 0,9 & mgr; g / kg für Ipratropium, einen allometric Exponenten von 0,67, eine Maus Körpermasse von 0,03 kg, und einer menschlichen Körpermasse von 60 kg; ein geschätzter menschlicher ED 90 von 0,07 & mgr; g / kg ((0,9 * (0,03 / 60) (1-0,67) = 0,07) als die vorhergesagten menschlichen abgelagerten Dosis von unseren Mausdatum berechnet werden. Dieser Wert vorhergesagt ist vergleichbar mit dem tatsächlichen menschlichen wirksam abgelagerte Dosis von 0,26 ug / kg, die von dem zuge berechnet werden kann tunse von 40 & mgr; g 39 durch die menschliche Körpermasse von 60 kg geteilt durch eine menschliche orale Inhalation pulmonale Abscheidungsfraktion multipliziert 16 von 0,4 ((40/60) * 0,4 = 0,26). Eine Schätzung der effektiven menschlichen inhalierte deponierten Dosis hilft auch , die gelieferten Dosen in den Inhalationstoxikologiestudien für klinische Studien 40 erforderlich verwendet zu planen.
Die spezielle Ausrüstung und eine große Menge an Testverbindung (Gramm-Mengen), die für die Nase nur inhalierte Arzneimittelabgabe kann erhebliche Einschränkungen, wenn die Nase nur Inhalationstechnik zu entwickeln. vorhanden ist, ein Kalibrierungslauf ohne Tiere notwendig, wenn eine bestimmte Dosis für eine (in der Regel Toxikologie und keiner Wirksamkeit Dosis / Reaktion) erforderlich Studie, und dieser Kalibrierungslauf wird mehr Arzneimittel benötigt zur Verfügung steht. Dieser Kalibrierungslauf ist notwendig, da die physikalisch-chemischen Eigenschaften der einzelnen Arzneimittel / Formulierung genug variieren können stark die deponierten Dosis beeinflussendes Arzneimittels in der Lunge. Optimierung der Luft und Medikament Vorschübe an dem Aerosolgenerator während des Kalibrierungsdurchlauf erforderlich ist erforderlich, um eine Aerosol-Teilchengrße und Konzentration für die spezifische Dosis zu erreichen. Während die Aerosolgenerator Luft und Medikament-Feed in den Methoden vorgeschlagen Raten Punkt ein angemessener Ausgangs sind, gibt es für eine bestimmte Medikamentenformulierung eines nicht-respirablen (Partikelgröße> 5 mm) Aerosol erzeugt wird, dass potenziell. In der präklinischen Phase, gibt es oft nicht genug Medikament zur Verfügung eines Kalibrierungslauf zu tun, und es ist unmöglich, a priori welche Dosen (falls vorhanden) zu wissen, werden immer in die Lunge. Auch statische Elektrizität während der Aerosolerzeugung Verfahren hergestellt und kann die Zeit für die Aerosolkonzentration äquilibrieren erforderlich beeinflussen. Es ist wichtig, richtig, das Gerät zu erden statische Aufladung zu minimieren. Eine weitere Option statische Elektrizität zu minimieren, ist Feuchtigkeit in der das Inhalationsgerät zugeführten Luft an, die Leitfähigkeit zu erhöhen undabführen elektrostatische Ladungen auf den Partikeln 25. bei kurzen (<1 h) Dosierung Sitzungen Befeuchten der Luft zum Aerosolgenerator zugeführt wird, für den Tierkomfort nicht erforderlich, soll aber, wenn längeren Dosierungszeiten verwendet werden, in Betracht gezogen werden.
Medikamente können durch passive Nasen nur Inhalation oder direkte intratracheale Verabreichung Methoden in die Lungen der Tiere abgegeben werden, die Nasen-Rachen-Ablagerung umgehen. Nasen nur Inhalation Lieferung wird allgemein auf dem Gebiet der Inhalationstoxikologie 41 verwendet , ist aber sparsam früh in dem Drug Discovery - Prozess verwendet. Ein interdisziplinäres Forscherteam ist für die Durchführung von nasen nur Inhalationsstudien erforderlich aufgrund des: Bedarf an großen Mengen von Drogen, Fachkenntnisse zu formulieren, erzeugen und charakterisieren Aerosole erforderlich; betreiben komplexe Ausrüstung und Arzneimittelwirksamkeit in Tiermodellen von Erkrankungen der Atemwege misst. Die Liefer hierin beschriebenen Techniken verwendet werden, Smal zu entwickelnl Molekül Drogen inhaliert aber in Zukunft angewendet werden können inhalierte Biologika 42 zu entwickeln, 43. Hoffentlich werden die Verfahren und in diesem Manuskript dokumentiert Tipps werden neue präklinische Forscher Wirkstoffforschung und Toxikologie erleichtern, die Fähigkeiten zu erwerben notwendigen Medikamente zu Nagetieren durch Aerosolinhalation zu liefern.
Disclosures
Alle Autoren von Amgen beschäftigt. Publikationsgebühren für dieses Video-Artikel werden von Amgen bezahlt.
Acknowledgments
Wir erkennen an: Dr. Thomas Budiman bei TSE Systems GmbH für seine technische Kompetenz und Ausrüstung Anpassung. John Fry (Battelle Inc.) und Dr. Rudy Jaeger (CH Technologies Inc.) für ihre hilfreichen Diskussionen. Tian Wu, Sam Mboggo, April Miller und Sean Davis (Amgen), um Hilfe bei den Experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nose-only exposure inhalation unit | TSE systems | 700100-KNES-040-ss | Custom configurations available |
| DACO data acquisition system | TSE systems | 700400-PRO-C-D/1 | |
| MC One Jet Mill | Jetpharma | DEC MicroJet 10 | |
| Turbula Mixer | GlenMills Inc | T2F | |
| Micronized Lactose | DFE Pharma | Lactohale 200 | |
| Hydraulic press | Specac | GS15011 | |
| Cascade impactor filters | Pall Life Sciences | 7219 | Emfab filter |
| Absolute filters | Whatman | 10370302 | 5 cm diameter |
| Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor |
Casella | CEL-712 | |
| Ipratropium bromide | Spectrum Chemical | I1178 | pre-micronized |
| flexiVent FX1 system | scireq | FV-FXCS |
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