Summary
La unidad de inhalación descrito en este documento puede generar, la muestra para la caracterización, y uniformemente depositar un medicamento en aerosol en los pulmones de los roedores. Esto permite la determinación pre-clínica de la eficacia y seguridad de dosis de los medicamentos depositados en los pulmones; los datos clave que permiten el desarrollo de fármacos inhalados clínica.
Abstract
enfermedades respiratorias obstructivas como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se tratan actualmente por los fármacos antiinflamatorios y broncodilatadores inhalados. A pesar de la disponibilidad de múltiples tratamientos, ambas enfermedades están creciendo preocupaciones de salud pública. La mayoría de los pacientes con asma están bien controlados en las terapias inhaladas actuales, pero un número considerable de pacientes con asma grave no lo son. El asma afecta a un estimado de 300 millones de personas en todo el mundo y aproximadamente el 20 por ciento tiene una forma grave de la enfermedad. En contraste con el asma, hay pocos tratamientos efectivos para la EPOC. Se estima que un 10% de la población tiene EPOC y la tendencia en las tasas de mortalidad está aumentando para la EPOC, mientras que la disminución de otras enfermedades graves. Aunque los fármacos en desarrollo para la entrega inhalado es un reto, la unidad de inhalación nariz de sólo permite la entrega directa de nuevos fármacos al pulmón de roedores para la eficacia y la seguridad / toxicología estudios pre-clínicos. administración de fármacos inhaladostiene múltiples ventajas para enfermedades respiratorias, donde la alta concentración en el pulmón mejora la eficacia y minimiza los efectos secundarios sistémicos. corticosteroides y broncodilatadores inhalados se benefician de estas ventajas y entrega inhalado también pueden tener potencial para futuras terapias biológicas. La unidad de inhalación descrito en este documento puede generar, la muestra para la caracterización, y uniformemente depositar un medicamento en aerosol en los pulmones de los roedores. Esto permite la determinación pre-clínica de la eficacia y seguridad de dosis fármaco depositado en los pulmones de los roedores, los datos clave necesarios antes de iniciar el desarrollo clínico.
Introduction
Hay muchas ventajas para la administración inhalada de fármacos para el tratamiento de la enfermedad respiratoria. entrega inhalado se aplica el agente terapéutico directamente en el sitio de acción, los pulmones. Una alta concentración local del fármaco en los pulmones ofrece una ventaja significativa que minimice la exposición sistémica de la dosis y, y maximiza la eficacia. Esto es una ventaja importante que se puede aumentar en gran medida el índice terapéutico (TI, proporción de dosis de fármaco que causa un efecto secundario sobre la dosis de fármaco que proporciona una eficacia) de un medicamento. Inhalados β 2 agonistas adrenérgicos, corticosteroides, y fármacos anti-colinérgicos han demostrado ser eficaces en la mejora de la función pulmonar en pacientes con asma y EPOC, al tiempo que minimiza los efectos secundarios sistémicos (taquicardia, inmunosupresión, y estreñimiento) observada cuando estos medicamentos se toman por vía oral. Nuevas clases de fármacos (por ejemplo, inhibidores de PDE4 1 y los inhibidores de BTK 2) tienen recientementedemostrado ser eficaz en la mejora de la función pulmonar en modelos de enfermedades de animales pre-clínicos, pero, similar a agonistas ß 2, corticosteroides, y fármacos anti-colinérgicos, sufren de efectos secundarios sistémicos que pueden minimizarse mediante la entrega inhalado. Debido al costo añadido de desarrollo de fármacos orales inhalados vs., una formulación inhalada sólo debe considerarse para indicaciones respiratorias después de la administración oral exitosa / sistémico revela limitante de la dosis efectos secundarios sistémicos basados en el mecanismo.
Pre-clínicamente, los compuestos inhalados se han optimizado para aumentar la TI, lo que requiere en las mediciones de la eficacia in vivo y de efectos secundarios. Inicialmente, estas mediciones se pueden realizar en ensayos separados, por lo general una medición tópicamente entregado eficacia y una medición de efectos secundarios sistémicamente entregado, pero para comparar verdaderamente compuestos, eficacia y efectos secundarios se deben medir en los mismos animales después de la administración inhalados. Esto requiere estudios de dosis / respuesta que achieve suficiente compuesto administrado a los pulmones para inducir un efecto secundario medible. La única manera actualmente para distribuir uniformemente grandes dosis de fármaco en los pulmones de varios animales pequeños simultáneamente es sólo para la nariz inhalación 3, 4, 5. Las fortalezas y debilidades de diferentes técnicas de exposición por inhalación Recientemente se han revisado 6, 7, 8. Se requieren equipo especializado y una gran cantidad de compuesto de ensayo (cantidades en gramos) para la nariz de sólo la administración de fármacos por inhalación, pero la prueba de concepto estudios pueden ser posibles por otros medios.
Cuando la cantidad de fármaco es limitada (cantidades mg), métodos de administración directos son una opción, pero todos sufren de deposición no homogénea, con más fármaco concentrado a lo largo de las vías aéreas centrales y menos bien representado en el parénquima / alveolarlas regiones 3, 4, 5. La dosis eficaz entregada por instilación directa es siempre superior y nunca puede ser directamente comparada con dosis inhaladas 4. Métodos instilación directa incluyendo intranasal 9, intratraqueal líquido 10, 11 y el aerosol de la instilación 12, o insuflación de polvo seco 13, 14 se pueden utilizar como una herramienta de detección para determinar el intervalo de dosis aproximada para estudios de inhalación sólo para la nariz posteriores, o para determinar la clasificación de la eficacia / toxicidad para una serie de estructuralmente medicamentos similares 15. Debido al patrón de deposición de la vía aérea central, los métodos de administración directos pueden ser más útiles para determinar los efectos de los compuestos que actúan sobre las vías aéreas centrales (broncodilatadores o inhibidores de mastocitos) que in el pulmón periférico (antiinflamatorios).
A diferencia de los humanos, que puede inhalar una dosis sustancial de aerosol concentrada de un inhalador en una sola respiración profunda, la generación continua de una respirable (0,5-5 m de diámetro aerodinámico mediano de masa, MMAD) aerosol, para un máximo de una hora, se requiere para depositar una dosis de fármaco eficaz en los pulmones de un roedor con respiración espontánea en un sistema de inhalación sólo para la nariz 16. Los generadores de aerosol (nebulizador de chorro o la alimentación de polvo Wright 17) que pueden producir de forma continua el tamaño de partícula de aerosol requerida y de concentración para los estudios de inhalación sólo para la nariz no son muy eficientes en la generación de aerosoles (respirable) de alta calidad. Las tasas de alimentación de fármaco a estos generadores de aerosoles para potente (IC 50 pM a nM en ensayos basados en células funcionales) compuestos son comúnmente en el intervalo / min 1 a 10 mg y por lo general menos de 1% de que el medicamento en aerosol hace que sea a la zona de respiración de los animales(Figura 1). Muchas de las partículas generadas son demasiado grandes (> 5 m) para entrar en los pulmones y se eliminan por un clasificador de aerosol (un pre-separador de ciclón o con un punto de corte 5 micras) para evitar una gran dosis de medicamento en la nariz. Agregando a la ineficiencia de los sistemas de inhalación sólo para la nariz es el rango de tamaño de partícula pequeño (0,5 a 5 micras MMAD) de las partículas respirables. Muchas de las partículas de aerosol de menos de 0,5 micras se exhalan (como el humo del cigarrillo) y no depositada en los pulmones 18. Además, muchas de las partículas de aerosol "más grandes" (~ 5 m) de depósito en la nariz se absorben o se transporta por el aclaramiento mucociliar hacia la parte posterior de la garganta donde son tragadas en el estómago 19. Cuando se utiliza la inhalación sólo para la nariz, la dosis depositada en la nariz es siempre mayor que la dosis depositada en los pulmones y la dosis nasal puede contribuir a la exposición sistémica y los efectos secundarios 20. Inherentemente, Dru inhaladog dosis son pequeñas (en el intervalo de microgramos) minimizar cualquier potencial efecto secundario sistémico de fármaco absorbido por el nasal, pulmonar, o en los tejidos gastrointestinales. Incluso cuando el tamaño de partícula del aerosol suministrado a los animales está en el rango respirable, un promedio de sólo el 4% de las partículas de aerosol que llegan a la zona de respiración del depósito de animales en los pulmones. generadores de aerosoles más eficientes están disponibles, pero el nebulizador de chorro y de alimentación de polvo Wright son incomparables por su capacidad para producir aerosoles continuos de diversas formulaciones de polvos líquidos y secos, respectivamente.
Aerosol respirable de la pre-separador pasa a la unidad de exposición a la inhalación sólo para la nariz 21 que se basa en un flujo-pasado el diseño nariz 22. La unidad de inhalación tiene 3 capas (sólo dos niveles se muestran en la Figura 1) y cada nivel contiene 10 puertos de exposición para los animales y muestreo de aerosol. Los puertos están situados periféricamente alrededor de la ceplenum de aerosol ntral. ratones conscientes se colocan en soportes de retención de vidrio (6 pulgadas de largo por 1,2 pulgadas de diámetro) y respiran el contenido de aerosol de la unidad de inhalación. Los ratones no se aclimataron a los dispositivos de retención 23. La experiencia previa ha demostrado que los ratones toleran restricción tubo de menos de una hora de duración de manera similar, con o sin adaptación 2.
La unidad de inhalación está diseñada para ofrecer aerosoles de medicamentos directamente a los pulmones de los animales, evitando la exposición a los operadores. La potencia / toxicidad de estos fármacos es generalmente controles de seguridad de ingeniería desconocidos y múltiples se utilizan para evitar la exposición a los operadores. Los operadores siempre deben llevar equipo de protección personal (guantes, batas de laboratorio, respiradores y gafas de seguridad). La cámara impelente exterior de la unidad de inhalación es bajo presión negativa en todo momento durante el funcionamiento, lo que permite la eliminación segura de simple o grupos de animales without apagar el generador de aerosol. La unidad de inhalación también está contenida en un recinto secundario mantenido a una presión negativa por un orificio de escape en el techo para evitar cualquier escape de aerosol en la habitación en caso de mal funcionamiento. Todo el aire efluente del sistema de inhalación es filtrada por un filtro HEPA antes de su liberación en el medio ambiente. El sistema de exposición sólo para la nariz utilizado en este manuscrito se adquirió de un único proveedor (véase la Tabla suplementaria de Materiales).
Protocol
Los ratones utilizados en estos estudios se cuidaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, octava edición 24. Los ratones fueron alojados grupo a una Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC) instalación acreditada internacional en la vivienda microaislador ventilado estéril en ropa de cama de la mazorca de maíz. Cuando se mide la broncoconstricción, los ratones fueron anestesiados con 100 mg / pentobarbital ip kg y la profundidad de la anestesia se controló por la falta de reflejo del dedo del pie de presión y mantenido por la anestesia ip como sea necesario. Al final de los experimentos, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical después de una sobredosis de barbitúricos. Verificación de la eutanasia fue confirmado por la falta de respiración. No hay cirugías de supervivencia se realizaron en los ratones. Todos los protocolos de investigación fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC).
1. Formulación y Selección del dispositivo para la generación de PharLos aerosoles far-
NOTA: Formulación y selección del dispositivo dependen de las propiedades fisicoquímicas del fármaco individual para ser aerosolizada, por lo tanto protocolos generales se presentan a continuación y se remite al lector a las críticas por Zeng 25 y O'Riordan 26.
- Aerosoles de polvo seco
- Micronizar fármaco polvos secos en un molino de bolas, molino de chorro o un dispositivo similar 27 y asegurar la distribución del tamaño de partícula micronizada (PSD) contiene partículas de respirable (m 0,5-5 masa diámetro aerodinámico de la mediana, MMAD) de tamaño de partícula. Mezclar los compuestos de prueba potentes que requieren dilución con lactosa micronizada.
NOTA: Si no hay suficiente polvo micronizado para determinar la PSD con un impactador de cascada, el PSD de una pequeña (sub-miligramo) muestra del polvo micronizado se puede medir mediante dispersión de luz para confirmar que contiene pequeñas partículas / respirables. - Generar el aerosol de polvo seco usando una alimentación de polvo generador de aerosol de polvo seco Wright. Empaque el polvo de fármaco micronizado / lactosa en el depósito cilíndrico usando una prensa hidráulica manual a aproximadamente 1000 libras por pulgada cuadrada (psi) para producir tortas compactadas de polvo utilizado como entrada por el generador de aerosol de alimentación de polvo Wright 17.
- Atornillar el depósito cilíndrico en la alimentación de polvo Wright avanzar el depósito hasta que la cuchilla rascadora está en contacto con la torta de drogas.
- Conectar la salida de la alimentación de polvo Wright a un ciclón y la entrada a una fuente de aire comprimido ajustado a tasa de flujo de aire 15 L / min (presión máxima 90 psi).
- Ajuste el control de velocidad de alimentación a 0,7 revoluciones por minuto (rpm) y encienda el generador de aerosol de alimentación de polvo Wright.
NOTA: 0,7 rpm corresponde a una velocidad de alimentación de la torta de artículo de prueba de 1 g / h cuando se utiliza el pequeño depósito cilíndrico de alimentación de polvo Wright. La alimentación de polvo Wright raspa una capa delgada de po compactadowder fuera de la torta de artículo de ensayo mediante el giro del depósito. Aire lleva el polvo fuera de la alimentación de polvo Wright, a través de una boquilla sónica para desaglomeración, y en un ciclón para eliminar las partículas y aglomerados no respirables. - Conectar la salida del ciclón a la cámara de aerosol central de la unidad de inhalación (Figura 1).
NOTA: Los compuestos se pueden comprimir 300-1500 psi en el depósito de la alimentación de polvo Wright. El objeto es comprimir las partículas suficiente para que serán retenidos en el depósito cuando se invierte, pero no tanto que la alimentación de polvo Wright no puede raspar una capa delgada para la re-aerosolización. Debe recordarse que el medidor en la prensa hidráulica manual lee en libras y el émbolo en la pequeña depósito de alimentación de polvo tiene un área superficial de aproximadamente 0,25 pulgada cuadrada. Por lo tanto, 250 libras de fuerza de compresión sobre 0,25 pulgada cuadrada es equivalente a 1000 psi.
- Micronizar fármaco polvos secos en un molino de bolas, molino de chorro o un dispositivo similar 27 y asegurar la distribución del tamaño de partícula micronizada (PSD) contiene partículas de respirable (m 0,5-5 masa diámetro aerodinámico de la mediana, MMAD) de tamaño de partícula. Mezclar los compuestos de prueba potentes que requieren dilución con lactosa micronizada.
- Aerosoles líquidos nebulizadas
- Disolver el fármaco en 100 ml de agua o solución salina fisiológica.
- Cargar un ml de la jeringa 100 con la solución de fármaco y coloque la jeringa en la bomba de jeringa con un caudal ajustado a 1 ml / min.
- Conectar la bomba de jeringa al nebulizador de chorro y purgar el aire de la línea de alimentación que conduce al nebulizador.
- Conectar la fuente de aire presurizado al nebulizador de chorro y ajustar el medidor de flujo de aire a 10 L / min.
- Insertar el nebulizador de chorro en el separador previo. El pre-separador se conecta el nebulizador a la cámara impelente aerosol central de la unidad de inhalación (Figura 1).
NOTA: Muchos compuestos de fármacos han limitado la solubilidad acuosa y están mejor formulados como aerosoles de polvo seco. Si una suspensión estable se puede hacer a partir del compuesto micronizado (MMAD <5? M), que se puede usar con el nebulizador de chorro. Se debe tener precaución ya que la suspensión pueden obstruir el nebulizador. concentraciones de alimentación Nebulizador de 1 mg / ml para los compuestos potentes (como el broncodilatadoripratropio) a 40 mg / suspensiones ml (para compuestos menos potentes como sulfato de salbutamol) se han utilizado. La velocidad de alimentación de la bomba de jeringa se ajusta a 1 ml / min por una razón práctica; para permitir que el periodo de equilibrio de concentración de aerosol y la exposición de 45 min de duración para ser completado sin la necesidad de recargar la jeringa.
2. Aerosol de configuración experimento de exposición
- Medir la concentración de fármaco (mediante la recopilación de aerosol sobre un filtro absoluto) y la distribución de tamaño de partícula (mediante la recopilación de aerosol usando un impactador de cascada) del aerosol que entra en la unidad de inhalación posterior pre-separador / ciclón. Use estos parámetros a lo largo con la ventilación del animal minutos, el peso corporal, y el tiempo de exposición para estimar la dosis de fármaco depositado en los pulmones.
- Pesar el filtro absoluto y registrar el peso del filtro. Coloque el filtro en el soporte del filtro y montar el soporte del filtro. Conectar la entrada del soporte del filtro absolutoa un puerto de muestra de aerosol plenum central y la salida a una fuente de vacío establecido para muestrear el aerosol a una velocidad de flujo de 1 L / min durante la duración del experimento.
NOTA: La masa de fármaco en el filtro después de probar durante 45 minutos puede ser en el rango de sub-microgramos y / o se mezcla con la lactosa, la sal NaCl, u otro vehículo. Una microbalanza que lee a 0,1 microgramo es necesario. Para obtener un peso preciso de fármaco depositado en el filtro, el filtro debe ser equilibró y se pesa en un entorno de humedad controlada. El peso de fármaco en los filtros sólo se puede utilizar en el cálculo de la dosis si no hay vehículo en la formulación o el vehículo es agua. Cuando hay un vehículo en la formulación que no sea agua, el peso de la sustancia en el filtro sólo da un punto de partida estimada para el análisis adicional de contenido de fármaco por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). - Pesar y registrar el peso de los filtros de etapa impactador de cascada 7 y una "pieza de cola" definitiva; filtrar. Colocar un filtro en cada una de las siete etapas del impactador de cascada y montar el Mercer impactador de cascada 28. Conectar la entrada del impactador de cascada a un puerto de muestra plenum aerosol central y la salida a una fuente de vacío establecido para muestrear el aerosol a la velocidad de flujo del impactador de cascada se calibra en (por lo general 0,5 o 1 L / min) para la duración de la experimentar.
- Monitorear el contenido de aerosol de la unidad de inhalación con el monitor de aerosol en tiempo real (véase la Tabla de Materiales y Reactivos) para confirmar los generadores de aerosoles son funcionales y la producción de un aerosol estable durante todo el experimento. Conectar la entrada del monitor de aerosol tiempo real a un puerto de la muestra aerosol plenum central y la salida a una fuente de vacío establecido para muestrear el aerosol a una velocidad de flujo de 1 L / min durante la duración del experimento.
NOTA: La señal del monitor en tiempo real de aerosol se reporta en mg / l, pero está calibrado para el polvo del camino y debe ser recalibradopara cada medicamento en aerosol individuo para producir valores de concentración de aerosol correctos. La calibración no es necesario para usar el monitor para confirmar la presencia o ausencia y la estabilidad temporal de la concentración de aerosol. - Ajuste los parámetros de control de procesos (flujo de aire, vacío, presión, aerosol potencia del generador) a los valores requeridos que depende del número de animales para ser conectado a la unidad de inhalación. Los generadores de la unidad de inhalación y aerosol se controlan continuamente / monitoreado por un sistema de control / adquisición de datos de proceso computarizado (DACO) suministrado por el fabricante (véase la Tabla de Materiales y Reactivos). Tasa de flujo de aire en la unidad de inhalación debe ser mínimamente aproximadamente 2 veces la tasa total de ventilación por minuto de todos los animales en la unidad de inhalación a fin de evitar una acumulación de CO 2.
- Pesar el filtro absoluto y registrar el peso del filtro. Coloque el filtro en el soporte del filtro y montar el soporte del filtro. Conectar la entrada del soporte del filtro absolutoa un puerto de muestra de aerosol plenum central y la salida a una fuente de vacío establecido para muestrear el aerosol a una velocidad de flujo de 1 L / min durante la duración del experimento.
- Ratones de carga en restrainers sólo para la nariz antes de exponer al aerosol en la unidad de inhalación sólo para la nariz. También cargar los animales de control la tensión de retención ende inmovilización de respirar aire de la habitación.
NOTA: Un experimento de dosis / respuesta se compone de varios grupos de ratones expuestos a aerosol para diferentes cantidades de tiempo. Tiempo de exposición se utiliza para controlar la dosis de cada grupo recibe durante un experimento de dosis / respuesta.- Ángulo del tubo de alejamiento hacia el techo al intentar cargar los animales, ya que tienden a correr hacia arriba, tratando de escapar. Señalando los tubos descendentes durante la carga animará a dar la vuelta y escapar por la parte trasera del tubo. Asegúrese de la nariz del ratón está orientado en el extremo en punta del tubo y fijar el émbolo-posición variable en el extremo posterior de la inmovilización.
NOTA: El émbolo se forma para permitir que la cola del ratón sobresalga del soporte, lo que permite que el ratón para regular su temperatura corporal, mientras que en el que lo detiene. - Ajuste el émbolo para permitir que los ratones para girar, pero no girar la cabeza a la cola; para asegurar el aerosol se inhala.
- Un seguimiento continuo de laratones, mientras que en los tubos de restricción. Después de colocar el émbolo, pequeña ratones (<20 gramos) a menudo intentan girar la cabeza a la cola en los tubos y adoptan una U-posición en la que tienen dificultad para respirar. Este comportamiento de giro es más frecuente en los primeros 5 minutos de restricción, después de que los ratones rara vez intentan girar la cabeza hasta la cola.
- Ángulo del tubo de alejamiento hacia el techo al intentar cargar los animales, ya que tienden a correr hacia arriba, tratando de escapar. Señalando los tubos descendentes durante la carga animará a dar la vuelta y escapar por la parte trasera del tubo. Asegúrese de la nariz del ratón está orientado en el extremo en punta del tubo y fijar el émbolo-posición variable en el extremo posterior de la inmovilización.
3. El suministro de aerosol
- Inserte tapones para tapar los orificios de suministro de la unidad de inhalación y activar el generador de aerosol, controlador de flujo de aire comprimido, y la bomba de vacío unidad de inhalación desde el software de control de procesos.
- Una vez que las lecturas del monitor de aerosol en tiempo real demuestran la concentración de aerosol tiene que llegar al equilibrio (~ 30 min, la figura 2), comienzan la eliminación de los tapones y la inserción de los tubos sólo para la nariz de restricción que contienen los ratones en la unidad de inhalación. Repetir hasta que todos los ratones para ser expuestos a drogas están conectados a la unidad de inhalación.
NOTA: Enel experimento ejemplo, el flujo total de aire suministrado a la unidad de inhalación a través del aire del generador de aerosol y la dilución se ajusta para suministrar una velocidad de flujo / min 0,5 L a cada uno de los puertos de exposición de los animales en uso. Por ejemplo, un flujo de 15 L / min de aire total es suficiente para suministrar cada uno de los 30 puertos en la unidad de inhalación. Esto es mucho más flujo de aire que el requerido por la ventilación minuto de los ratones, pero es necesario un flujo de aire más grande para suministrar el (caída de presión en el generador de aerosol) energía para producir (atomizar / de-aglomerado) el aerosol. - Una vez que todos los animales se cargan en la unidad de exposición, encender las bombas de muestreo de vacío que están conectados al filtro y impactador de cascada absoluta usando el software de control de procesos.
- Cuando se hayan completado todas las exposiciones, apagar el generador de aerosol y eliminar ratones restantes de la unidad de inhalación.
NOTA: Los animales serán tratados en una campana de la estación de cambio o por personal que lleve una mascarilla. Después de la conclusión de la administración en aerosol, los ratones son removed de los tubos y los tubos se desinfectan después de cada uso.
4. Cálculo de la dosis depositada
- Para calcular la dosis depositada 29 en mg / kg (Ecuación 1), multiplicar la concentración del medicamento en el aerosol (g / L) de ventilación x minuto (L / min) x duración de la exposición (min) x fracción inhalable x fracción deposición pulmonar y dividir por el peso corporal (kg).
- Calcular la concentración de aerosol (g / L) dividiendo la masa de fármaco en el filtro absoluto (g) por el caudal de aire a través del filtro (L / min) multiplicado por el tiempo de muestreo (min). Estimar la ventilación minuto del ratón por una ecuación alométrica basado en el peso corporal 30. La fracción inhalable es 1 como el aerosol se pasó a través de un pre-separador para eliminar las partículas no respirables, y la fracción de la deposición pulmonar se determina a partir del MMAD del aerosol del fármaco (Figura 3) usandocurvas de calibración experimentales de aerosoles monodispersos (Figura 4) 31.
Representative Results
El bromuro de ipratropio broncodilatador se disolvió en solución salina normal al 0,9% a una concentración de 1 mg / mL. Una jeringa de 100 ml se llenó con la solución de la formulación de ipratropio y la jeringa se insertó en una bomba de jeringa configurar para alimentar el nebulizador de chorro (Figura 1) a una velocidad de flujo de 1 ml / min. Activación del sistema de control para la unidad de inhalación inicia un flujo de aire de 10 l / min para el nebulizador de chorro, 5 L / min de caudal de aire de dilución a la cámara de dilución, y 15,5 L / min de flujo de aire de vacío para dibujar el aerosol fármaco fuera del unidad de inhalación una vez que pasa la nariz de los ratones. La bomba de jeringa y la bomba de muestra de monitor de aerosol en tiempo real se activaron. Veinticuatro ratones se insertan en la unidad de inhalación después de que el monitor de aerosol en tiempo real confirma la concentración de aerosol en la unidad de inhalación había llegado al equilibrio (15-30 min, Figura 2). Las bombas de la muestra para el filtro absoluto (1 L / min) y en cascadaimpactador (0,5 L / min) se enciende una vez que todos los ratones estaban conectados a la unidad de inhalación. El primer grupo de 8 ratones fue retirado de la unidad de inhalación después de 5 min, el segundo grupo después de 15 min, y el tercer grupo después de 45 min. Broncoconstricción 32 se midió como el aumento de la resistencia respiratoria del sistema (RRS) a una sola dosis nebulizada de metacolina (30 mg / ml) entregado 2 h después de la dosificación de ipratropio usando el respirador de roedores 33. El porcentaje de incremento en Rrs para cada animal, calculado como el máximo Rrs durante el intervalo de 3-min después de metacolina nebulizada (Rmax) menos el valor Rrs de la medición de línea de base antes de metacolina (Rbase) dividido por Rbase (% de aumento en Rrs = (Rmax -Rbase) / Rbase), se utilizó para cuantificar la broncoconstricción.
El aerosol depositado sobre los filtros impactador de cascada y filtro absoluto durante los 45 min de exposición a aerosol se disolvió en50% de acetonitrilo y la masa de ipratropio se cuantificó mediante HPLC (Tabla 1). El MMAD x / GSD del aerosol de ipratropio se calculó que era 1,7 x / 1,5 m (figura 3) y una fracción de deposición (DF) de 0.037 para los ratones se utilizó para un aerosol con un MMAD de 1,7 m (Figura 4). La fracción inhalable (IF) fue de 1 como el aerosol se pasó a través de un pre-separador para eliminar las partículas no respirables. La concentración media de ipratropio en el aerosol (0,5 g / L) se calculó a partir de masas de ipratropio en el filtro absoluto (22 mg) dividida por la velocidad de flujo de aire aspirado a través del filtro (1 L / min) multiplicado por el tiempo de muestreo (45 min). El peso corporal medio de los ratones era 0.019 kg y su ventilación predicho minutos se calculó como 0.021 L / min. Utilizando la ecuación 1, las dosis depositadas para el 5, 15, y 45 grupos de exposición min fueron 0,1, 0,3 y 0,9 g / kg; respectivamente.
= "1"> Ipratropium inhibió la broncoconstricción inducida por metacolina nebulizada en 8 semanas de edad C57BL / 6 ratones. Metacolina aumentó Rrs en cuestión de segundos de la administración nebulizada (Figura 5, panel superior). Los Rrs del grupo de control (expuestas al aire ambiente en lugar de aerosol de ipratropio) aumentó de un valor basal de 0,62 ± 0,03 cm de H 2 O * s / ml a un valor máximo de 1,66 ± 0,12 cm de H 2 O * s / ml, lo que representa una aumento 168 ± 9% en Rrs, 70 s después de la administración de metacolina aerosol. El porcentaje de incremento en la resistencia del sistema respiratorio se inhibió de una manera dependiente de la dosis por dosis inhalada de ipratropio. El porcentaje de incremento en Rrs se inhibió por 51 ± 9%, 79 ± 14%, y 89 ± 2% (Figura 5, panel inferior) a dosis depositados inhalada de ipratropio de 0,1, 0,3, y 0,9 mg / kg, respectivamente.
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Figura 1: unidad de inhalación con el generador de aerosol de polvo seco adjunta. El nebulizador utilizado para generar aerosol a partir de formulaciones líquidas se muestra a la derecha. 1) de alimentación de polvo Wright, 2) ciclón, 3) de la bomba de jeringa, 4) de chorro nebulizador insertado en pre-separador, 5) mezclador de aire de dilución. Cuando la entrega de aerosoles nebulizados, la alimentación de polvo y el ciclón se sustituyen por la bomba de jeringa, jet nebulizador / pre-separador, y un mezclador de aire de dilución. La vista ampliada (modificado de Oldham 21) muestra la trayectoria de flujo de aerosol en la zona de respiración alrededor de la nariz del animal que se crea mediante la inserción del tubo de restricción en la unidad de inhalación. El aerosol llena el aerosol central de plenum (gris) de la unidad de inhalación, fluye hacia fuera a la nariz del animal en el que se tira hacia atrás por un ligero vacío en el (blanco) impelente exterior y en los filtros de recogida de residuos (no mostrado). plaliviar clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: las mediciones del monitor aerosol en tiempo real confirmar la concentración de aerosol en la unidad de inhalación alcanza el equilibrio ~ 30 min después de encender el generador de aerosol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: masa Ipratropium recogida en cada etapa del impactador de cascada (gráfico de barras azul) cubrió de ajuste de curva (curva negro) utilizado para calcular el MMAD y GSD de la distribución del tamaño de partícula de aerosol. Por favorclic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: fracción de deposición para los pulmones del ratón como una función de MMAD para aerosoles suministrados por inhalación sólo para la nariz (como se modificó a partir de Hsieh 31). Para tamaños de partículas menores de 0,5 micras mayor parte del aerosol se exhala y no se deposita en los pulmones (como el humo del cigarrillo). Para tamaños de partícula mayor que 5 m, la mayor parte del aerosol se filtra a cabo por la nariz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El rápido aumento de la resistencia del sistema respiratorio inducida por metacolina nebulizada administerojo a ratones es bloqueado por ipratropio entregado por inhalación sólo para la nariz a ratones (n = 8 por grupo, panel superior). Ipratropium inhibió el aumento inducido por metacolina en resistencia del sistema respiratorio con un ED 50 de 0,1 g / kg dosis depositada (* p <0,05 frente al control, panel inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| impactador de cascada de datos utilizados para calcular MMAD y GSD | ||
| filtro de una etapa | Ipratropio en el filtro por HPLC (mg) | etapa Cut Diámetro (mm) |
| 1 | 0,002 | 6 |
| 2 | 0,19 | 4.5 |
| 3 | 1.43 | 2.5 |
| 4 | 2.55 | 1.5 |
| 5 | 2.95 | 1.2 |
| 6 | 1.03 | 0.7 |
| 7 | 0.37 | 0.5 |
Tabla 1: Datos de impacto en cascada utiliza para calcular MMAD y GSD
Discussion
Un sistema de inhalación sólo para la nariz y su funcionamiento para suministrar aerosoles farmacéuticos a los pulmones de los roedores se ha descrito. Sujeción de los animales en los titulares de la nariz de sólo es un método utilizado comúnmente para exponer a los animales a los materiales en el aire. Se realizó un experimento que demuestra la anticolinérgico broncodilatador bromuro de ipratropio 34 puede revertir potentemente la broncoconstricción inducida por metacolina cuando se entrega por inhalación sólo para la nariz a los ratones con un ED50 de 0,1 g / kg dosis depositadas. Se requirió un aumento mayor de 10 veces en la dosis eficaz de ipratropio para broncodilatación después de la administración intratraqueal (ED 50 intratraqueal = 1,3 g / kg, datos no mostrados) de entrega. Esto es debido al patrón de deposición no homogénea de fármaco en los pulmones producidos por dosificación intratraqueal 3, 5, 10. De 10 veces y una mayor dosis efectivadiferenciales entre las técnicas de dosificación inhalados y intratraqueal para otros fármacos se han observado previamente por otros 4.
El patrón de deposición no homogénea de fármaco en los pulmones producidos por dosificación intratraqueal también retrasa la absorción del fármaco por el pulmón 35, disminuyendo la velocidad a la que entra el fármaco a la circulación sistémica y la disminución de las posibilidades de ver los efectos secundarios sistémicos. Por lo tanto, para optimizar la seguridad / eficacia (índice terapéutico) 36 de nuevos fármacos inhalados, sólo para la nariz administración por inhalación se debe utilizar. deposición intratraqueal dará una estimación inexacta de la TI mediante la generación de dosis erróneamente altos eficaces en las dosis de pulmón y baja a la circulación sistémica.
Como se desarrollan nuevos fármacos suministrados por la vía inhalada, es esencial para traducir adecuadamente la dosis de fármaco eficaz de los estudios de eficacia preclínicos para predecir un efdosis humana ficacious para ensayos clínicos. La muerte infame de Tusko el elefante 37 es comúnmente citado en la literatura para recordarnos a utilizar el escalamiento alométrico para predecir las dosis entre especies de drogas y que las dosis entre especies de drogas no debe extrapolarse linealmente sobre la base de una simple comparación de masas corporales. Es común el uso de un enfoque alométrico con un exponente alométrico b de 0,67 para predecir dosis de los fármacos humanos de eficacia preclínica estudia 38. Con el ratón inhalado ED 90 de 0,9 mg / kg para ipratropio, un exponente alométrico de 0,67, una masa corporal de ratón de 0,03 kg, y una masa cuerpo humano de 60 kg; una ED humana estimada 90 de 0,07 g / kg ((0,9 * (0,03 / 60 ) (1-0.67) = 0,07) se puede calcular como la dosis depositada humana predicha a partir de nuestros datos del ratón. Este valor predicho es comparable a la humana real dosis depositada eficaz de 0,26 mg / kg, que se puede calcular a partir de la entregado hacerSE de 40 g 39 dividida por la masa del cuerpo humano de 60 kg multiplicado por una fracción de inhalación deposición pulmonar oral humana 16 de 0.4 ((40/60) * 0,4 = 0,26). Una estimación de la dosis depositada inhalado humano eficaz también ayuda a planificar las dosis suministradas utilizados en los estudios de toxicología de inhalación requeridos para los ensayos clínicos 40.
El equipo especializado y gran cantidad de compuesto de ensayo (cantidades en gramos) requerida para la nariz de sólo la administración de fármacos inhalados pueden ser limitaciones significativas en el desarrollo de la técnica de inhalación sólo para la nariz. Una carrera de calibración sin animales presentes es necesario si se requiere una dosis específica para un estudio (por lo general toxicología y no una eficacia de dosis / respuesta), y esta calibración de ejecución se requiere más fármaco que esté disponible. Esta ejecución de la calibración es necesaria debido a que las propiedades fisicoquímicas de cada fármaco / formulación puede variar suficiente para afectar en gran medida la dosis depositadade fármaco en los pulmones. se requiere optimización de los tipos de aire y de alimentación de fármaco al generador de aerosol durante la ejecución de la calibración para conseguir un tamaño de partícula de aerosol y la concentración de la dosis específica requerida. Mientras que las tasas de aire y de alimentación de fármaco generador de aerosol que se sugieren en los métodos son un punto de partida razonable, existe un potencial de que para una formulación específica de drogas se generará un (tamaño de partícula> 5 mm) de aerosol no respirable. En la etapa preclínica, a menudo no es suficiente medicamento disponible para hacer una carrera de calibración y es imposible saber a priori qué dosis (si los hay) se llegue a los pulmones. También, la electricidad estática se produce durante el proceso de generación de aerosol y puede influir en el tiempo requerido para que la concentración de aerosol que se equilibre. Es importante para conectar a tierra correctamente el equipo para minimizar la carga estática. Otra opción para minimizar la electricidad estática es añadir humedad al aire suministrado a la unidad de inhalación, para aumentar la conductividad ydisipar las cargas electrostáticas en partículas 25. La humidificación del aire suministrado al generador de aerosol no se requiere para la comodidad de los animales durante (<1 h) sesiones de dosificación cortos pero se debe considerar si se utilizan tiempos de dosificación más largo.
Los medicamentos pueden ser entregados a los pulmones de los animales por inhalación sólo para la nariz pasiva o métodos de administración intratraqueal directos que omiten deposición nasofaríngeo. Administración por inhalación sólo para la nariz se utiliza comúnmente en el campo de la toxicología de inhalación 41, pero se usa con moderación temprano en el proceso de descubrimiento de fármacos. Un equipo multidisciplinario de investigación es necesaria para la realización de estudios de inhalación sólo para la nariz debido a la: necesidad de grandes cantidades de drogas, el conocimiento especializado necesario para formular, generar y caracterizar los aerosoles; operar equipo complejo, y medir la eficacia del fármaco en modelos animales de enfermedad respiratoria. Las técnicas de administración descritas en este documento se utilizan para desarrollar small molécula de fármacos inhalados pero en el futuro se puede aplicar a desarrollar productos biológicos inhalados 42, 43. Con suerte los procedimientos documentados y sugerencias en este manuscrito facilitarán nuevo descubrimiento de drogas y toxicología investigadores preclínicos para adquirir las habilidades necesarias para administrar medicamentos a los roedores por inhalación de aerosoles.
Disclosures
Todos los autores emplearon por Amgen. las tasas de publicación de este artículo, el vídeo se pagan por Amgen.
Acknowledgments
Reconocemos: Dr. Thomas Budiman al TSE Systems GmbH para su personalización experiencia y el equipo técnico. John Fry (Battelle Inc.) y el Dr. Rudy Jaeger (CH Technologies Inc.) para sus debates. Tian Wu, Sam Mboggo, April Miller, y Sean Davis (Amgen) para obtener ayuda con los experimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nose-only exposure inhalation unit | TSE systems | 700100-KNES-040-ss | Custom configurations available |
| DACO data acquisition system | TSE systems | 700400-PRO-C-D/1 | |
| MC One Jet Mill | Jetpharma | DEC MicroJet 10 | |
| Turbula Mixer | GlenMills Inc | T2F | |
| Micronized Lactose | DFE Pharma | Lactohale 200 | |
| Hydraulic press | Specac | GS15011 | |
| Cascade impactor filters | Pall Life Sciences | 7219 | Emfab filter |
| Absolute filters | Whatman | 10370302 | 5 cm diameter |
| Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor |
Casella | CEL-712 | |
| Ipratropium bromide | Spectrum Chemical | I1178 | pre-micronized |
| flexiVent FX1 system | scireq | FV-FXCS |
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