Summary
Ингаляции блок описанный здесь, может генерировать, образец для определения характеристик, и равномерно депонировать аэрозоль лекарственного средства в легких грызунов. Это позволяет доклиническое определению эффективности и безопасности доз препаратов, депонированных в легких; Основные данные, позволяющие клиническое развитие ингаляционных наркотиков.
Abstract
Обструктивные заболевания дыхательных путей, такие как астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) в настоящее время лечат с помощью ингаляционных противовоспалительных и бронхолитических препаратов. Несмотря на наличие нескольких процедур, оба заболевания растут проблемы общественного здравоохранения. Большинство больной астмой хорошо контролируется на текущей ингаляционной терапии, но значительное число пациентов с тяжелой формами астмы не является. Астма поражает приблизительно 300 миллионов людей во всем мире, и примерно 20 процентов имеют тяжелую форму заболевания. В отличие от астмы, есть несколько эффективных методов лечения ХОБЛ. Оценкам, 10% населения имеет ХОЗЛ, и тенденции в показателях смертности возрастает при ХОБЛ, уменьшая для других серьезных заболеваний. Хотя развивающиеся препараты для ингаляционного доставки является сложной задачей, нос только блок ингаляции позволяет осуществлять прямую доставку новых лекарственных средств в легкие грызунов для предварительной клинической эффективности и безопасности / токсикологических исследований. Ингаляционные доставки лекарственных средствимеет несколько преимуществ для респираторных заболеваний, где высокая концентрация в легких повышает эффективность и сводит к минимуму системных побочных эффектов. Ингаляционные кортикостероиды и бронходилататоры извлечь выгоду из этих преимуществ и вдохнули доставки могут также держать потенциал для будущих биологических методов лечения. Ингаляции блок описанный здесь, может генерировать, образец для определения характеристик, и равномерно депонировать аэрозоль лекарственного средства в легких грызунов. Это позволяет доклиническое определению эффективности и безопасности доз препаратов, депонированных в легких грызунах, основные данные, необходимые до начала клинического развития.
Introduction
Есть много преимуществ для ингаляционного введения лекарственных средств для лечения заболеваний дыхательных путей. Ингаляционная доставка применяется терапевтический агент непосредственно к месту действия, легким. Высокая локальная концентрация лекарственного средства в легких дает значительное преимущество, что сводит к минимуму дозу и системное воздействие, и максимально увеличивает эффективность. Это важное преимущество, которое может значительно повысить терапевтический индекс (ТИ, соотношение дозы лекарственного средства, которое вызывает побочный эффект по сравнению с дозой препарата, который обеспечивает эффективность) лекарственное средство. Ингаляционные β 2 -адренергические агонисты, кортикостероиды и антихолинергические препараты доказали свою эффективность в улучшении функции легкой у пациентов с астмой и ХОБЛ, при минимизации системных побочных эффектов (тахикардия, иммуносупрессия и запоры) наблюдали , когда эти препараты принимают перорально. Новые классы лекарственных средств (например, ингибиторы PDE4 1 и ингибиторы BTK 2) недавнодоказали свою эффективность в улучшении функции легкой в доклинических моделях заболеваний животных , но, похожих на & beta ; 2 - агонистов, кортикостероиды и анти-холинергические препараты, страдают от системных побочных эффектов , которые могут быть сведены к минимуму путем вдыхаемой доставкой. Из-за дополнительными затраты на развитие ингаляционных по сравнению с пероральными препаратами, ингаляционный препарат следует рассматривать только для дыхательных показаний после успешного пероральное / системного введения показывает механизм ограничения дозы на основе системных побочных эффектов.
Предварительно клинический, ингаляционные соединения оптимизированы для увеличения TI, который требует Эффективность in vivo и побочного эффект измерений. Первоначально эти измерения могут быть выполнены в отдельных анализах, как правило, местно доставлены измерения эффективности и системно доставлены измерения побочный эффект, но по-настоящему сравнить соединений, эффективность и побочные эффекты должны быть измерены в одних и тех же животных после введения путем ингаляции. Это требует исследования дозы / ответ, что переменный токhieve достаточного количества соединения, вводимое в легких, чтобы вызвать измеримый побочный эффект. Единственный способ в настоящее время , чтобы равномерно распределить большие дозы препарата в легкие множества мелких животных одновременно является нос только ингаляции 3, 4, 5. Сильные и слабые стороны различных методов воздействия при вдыхании были недавно рассмотрены 6, 7, 8. Специализированное оборудование и большое количество исследуемого соединения (граммовые количества) необходимы для носа только вдыхаемого доставки лекарственных средств, но доказательство правильности концепции исследование может быть возможным с помощью других средств.
Когда количество препарата ограничено (мг количество), методы прямого введения являются вариантом, но все страдают от неоднородного осаждения, с большим количеством лекарственного средства сосредоточены вдоль центральных дыхательных путей и менее широко представлены в паренхиматозном / альвеолярногообласти 3, 4, 5. Эффективная доза доставляется путем прямого закапывания всегда выше , и никогда не может быть непосредственно по сравнению с дозами ингаляционных 4. Прямые методы инстилляции включая интраназальный 9, трахею жидкости 10, 11 и распылительной инстилляцию 12 или сухой порошок инсуффляцию 13, 14 может быть использованы в качестве инструмента скрининга , чтобы определить приблизительный диапазон доз для последующих носа только ингаляционных исследований, или для определения ранжирование эффективности / токсичности для ряда структурно аналогичных препаратов 15. Благодаря центральному шаблону осаждения в дыхательных путях, методы прямого введения, могут быть более полезными для определения эффектов соединений, которые действуют на центральных дыхательных путях (бронхолитические или ингибиторы тучных клеток), чем яп периферийный легкий (противовоспалительный).
В отличии от людей, которые могут вдыхать существенную дозу концентрированного аэрозоля из ингалятора в одном глубоком вдохе, непрерывное генерирование вдыхаемого (средний массовый аэродинамический диаметр 0,5-5 мкм, MMAD) аэрозоль, в течение часа, требуется депозит эффективная доза лекарственного препарата в легкой спонтанном дыхании грызуна в носе только в системе 16 ингаляции. Аэрозольные генераторы (струйный распылитель или 17 подачи пыли Wright) , который может непрерывно производить необходимый размер частиц аэрозоля и концентрацию для носа только ингаляционных исследований, не очень эффективны при генерации высокого качества (вдыхаемые) аэрозолей. Скорости подачи лекарственного средства в эти аэрозольных генераторы для сильнодействующего (IC 50 пМ до нМ в функциональных анализах , основанные клеток) соединения , как правило , в диапазоне от 1 до 10 мг / мин , и обычно меньше , чем 1% от этого лекарственного аэрозоля делает его в зону дыхания животных(Рисунок 1). Многие из частиц, генерируемых являются слишком большими (> 5 мкм), чтобы попасть в легких и удаляются с помощью аэрозольного классификатора (предварительного сепаратора или циклона с точкой среза 5 мкм), чтобы избежать большой дозы лекарственного средства в носе. Добавление к неэффективности носа только систем для ингаляции является небольшим диапазоном размеров частиц (от 0,5 до 5 мкм MMAD) для вдыхаемых частиц. Многие из аэрозольных частиц менее 0,5 мкм выдыхаются (например , сигаретный дым) , а не на хранение в легких 18. Кроме того , многие из «больших» аэрозольных частиц (~ 5 мкм) депозита в носе поглощается или транспортируется мукоцилиарным клиренсом по направлению к задней стенке глотки , где они проглатываются в желудок 19. При использовании только нос ингаляции, доза депонированы в нос всегда больше , чем доза , депонированной в легких и носовой дозы может способствовать системного воздействия и побочных эффектов 20. Неотъемлемо, вдохнул Druг дозы малы (в диапазоне микрограмм) минимизации любого системного побочного эффекта препарата потенциал поглощаемого носа, легких, желудочно-кишечного тракта или тканей. Даже тогда, когда размер частиц аэрозоля, подаваемого на животных находится в диапазоне вдыхаемых, в среднем только 4% аэрозольных частиц, которые делают его в зону дыхания месторождения животных в легких. Более эффективные аэрозольные генераторы доступны, но струйный распылитель и Райт подача пыли не имеет себе равные за их способность производить непрерывные аэрозоли из различных жидких и сухих порошковых композиций, соответственно.
Респирабельная аэрозоля из предварительного сепаратора переходит в носе только блок 21 вдыхания , который основан на проточном прошлом конструкции 22 носа. Блок ингаляции имеет 3 яруса (только два яруса, показаны на рисунке 1), и каждый ярус содержит 10 портов воздействия для животных и отбора проб аэрозоля. Эти порты расположены по периферии вокруг сntral камера статического давления аэрозоля. Сознательный мышей помещает в держатели удерживающего стекла (6 дюймов в длину и диаметр 1,2 дюйма) и дышать аэрозольное содержимое блока ингаляции. Мышей не приспособился к удерживающим устройствам 23. Предыдущий опыт показал , что мыши переносят выдержку трубки меньше , чем продолжительность часа аналогичным образом , с или без адаптации 2.
Устройство для ингаляции предназначено для доставки лекарственных аэрозолей непосредственно в легкие животных, избегая при этом воздействий на оператор. Эффективность / токсичность этих препаратов, как правило, неизвестно и несколько элементов управления инженерной безопасности используются, чтобы избежать воздействия на операторов. Операторы должны всегда носить средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторные халаты, респираторы и защитные очки). Внешняя камера статического давления блока ингаляции находится под отрицательным давлением в любое время во время работы, что позволяет для безопасного удаления одного или групп животных withoу отключая генератор аэрозоля. Устройство для ингаляции также содержатся во вторичном корпусе, поддерживаемого при отрицательном давлении с помощью выпускного отверстия в потолке, чтобы предотвратить любую утечку аэрозоля в помещение в случае неисправности. Весь выходящий поток воздуха из системы ингаляции фильтруют с помощью фильтра НЕРА до выпуска в окружающую среду. Носовая только система экспозиции , используемая в этой рукописи была приобретена у одного поставщика (см дополнительной таблицы материалов).
Protocol
Мыши , используемые в этих исследованиях , заботились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, восьмое издание 24. Мышей содержали группы на ассоциацию по оценке и аккредитации лабораторных животных (AAALAC) международного аккредитованы объекта в стерильном вентилируемом корпусе microisolator на кукурузных початках подстилки. При измерении бронхоспазм, мышей анестезировали 100 мг / кг внутрибрюшинно пентобарбиталом и глубины анестезии контролировали отсутствием ног пинч рефлекса и поддерживается внутрибрюшинно анестезии, как это необходимо. В конце эксперимента мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации после передозировки барбитуратов. Проверка эвтаназии была подтверждена отсутствием дыхания. Нет операции выживаемости не были проведены на мышах. Все протоколы исследований были одобрены Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) путем.
1. Формулирование и выбор устройства для генерации Pharmaceutical Аэрозоли
Примечание: Состав и выбор устройства зависит от физико - химических свойств индивидуального лекарственного средства , чтобы быть в виде аэрозоля, поэтому общие протоколы представлены ниже , и читатель отсылаются к обзорам Zeng 25 и 26 О'Риорданны.
- Сухие порошковые аэрозоли
- Измельчать препарат сухих порошков в шаровой мельнице, струйной мельнице или подобном устройстве 27 и обеспечивать микронизированный распределение частиц по размерам (PSD) содержит частицы вдыхаемых (мкм средний массовый аэродинамический диаметр, MMAD 0,5-5) размера частиц. Смешать мощные тестируемые соединения, которые требуют разбавления микронизированного лактозы.
Примечание: Если нет достаточного количества микронизированного порошка для определения PSD с каскадным импактором, СДП небольшого (суб-миллиграмм) образцом микронизированного порошка может быть измерен с помощью рассеяния света, чтобы подтвердить, что содержит мелкие / вдыхаемые частицы. - Генерирование сухого порошка аэрозоля с помощью подачи пыли генератора аэрозоля сухого порошка Райта. Упаковать / порошок лактозы микронизированного лекарственного средства в цилиндрический резервуар с помощью ручного гидравлического пресса при примерно 1000 фунтов на квадратный дюйм (фунты на квадратный дюйм) для получения спрессованных лепешки из порошка , используемого в качестве входных данных с помощью подачи пыли аэрозольного генератора 17 Wright.
- Винт цилиндрического резервуара на корм пыли Райта наступающого резервуар, пока лезвие скребки не находится в контакте с наркотиками тортом.
- Подключение выходного отверстия подачи пыли Райт циклона и вход к источнику сжатого воздуха, установленный до 15 л / мин скорости воздушного потока (максимальное давление 90 фунтов на квадратный дюйм).
- Установите регулятор скорости подачи до 0,7 оборотов в минуту (оборотов в минуту) и включите генератор подачи аэрозоля Райт пыли.
Примечание: 0,7 оборотов в минуте соответствует тестируемому образцу скорости подачи осадки 1 г / ч при использовании небольшой Райт пыли подачи цилиндрического резервуара. Подачи пыли Райта очищает тонкий слой уплотненного роwder от тестовой статьи торт, вращая резервуар. Воздух несет пыль из корма Райт пыли, через звуковое сопло для деагломерации, и в циклон для удаления не вдыхаемых частиц и агломератов. - Подключите выход циклона к центральной камере статического давления аэрозольного устройства для ингаляции (рисунок 1).
Примечание: Соединения могут быть сжаты от 300 до 1500 фунтов на квадратный дюйм в резервуаре подачи Wright пыли. Объект, чтобы сжать частицы достаточно, чтобы они будут сохранены в резервуаре, когда инвертированные, но не так сильно, что подача Райт пыли не может соскрести тонкий слой для повторного аэрозолизация. Следует помнить, что датчик на ручном гидравлическом прессе считывает в фунтах и поршень на небольшом резервуаре подачи пыли имеет площадь поверхности около 0,25 квадратного дюйма. Таким образом, 250 фунтов силы сжатия на 0,25 квадратном дюйме эквивалентны 1000 фунтов на квадратный дюйм.
- Измельчать препарат сухих порошков в шаровой мельнице, струйной мельнице или подобном устройстве 27 и обеспечивать микронизированный распределение частиц по размерам (PSD) содержит частицы вдыхаемых (мкм средний массовый аэродинамический диаметр, MMAD 0,5-5) размера частиц. Смешать мощные тестируемые соединения, которые требуют разбавления микронизированного лактозы.
- Распыленные жидкие аэрозоли
- Растворить препарат в 100 мл воды или физиологического раствора.
- Нагрузка 100 мл шприц с раствором лекарственного средства и поместить шприц в шприцевой насос со скоростью потока, установленной на 1 мл / мин.
- Подключение шприцевого насоса к струйному распылителю и очищать воздух от питающей линии, ведущей к небулайзеру.
- Подключение источника сжатого воздуха к струйным распылителем и установить расходомер воздуха до 10 л / мин.
- Вставьте распылитель в предварительно сепаратор. Предварительно Сепаратор соединяет распылитель к центральной камере статического давления аэрозольного устройства для ингаляции (Рисунок 1).
Примечание: Многие лекарственные соединения имеют ограниченную растворимость в воде и лучше приготовлены в виде сухих порошковых аэрозолей. Если стабильная суспензия может быть изготовлена из тонкоизмельченного соединения (MMAD <5 мкМ), он может быть использован со струйным распылителем. Осторожно следует использовать в качестве подвески может засорить распылитель. Небулайзер концентрации корма от 1 мг / мл для сильнодействующих соединений (таких как бронхолитическоеипратропия) до 40 мг / были использованы мл суспензии (для менее мощных соединений, таких как сульфат сальбутамола). Скорость подачи шприцевой насос установлен в 1 мл / мин для практических соображений; чтобы концентрация аэрозоля период уравновешивания и 45-мин-длительная экспозиция будут завершены без необходимости перезагрузки шприца.
2. Аэрозоль Настройка экспозиции Эксперимент
- Измерение концентрации лекарственного средства (путем сбора аэрозоля на абсолютном фильтре) и распределение частиц по размерам (путем сбора аэрозоля с использованием каскадного импактора) аэрозоля , который поступает в блок ингаляции после предварительного сепаратора / циклона. Используйте эти параметры вместе с минутной вентиляции животного, массы тела и время облучения для оценки дозы препарата , осажденного в легких.
- Взвесьте абсолютный фильтр и записать вес фильтра. Поместите фильтр в держатель фильтра и собрать держатель фильтра. Подключите вход абсолютного держателя фильтрак центральному аэрозольной камере статического давления образца порту и выходу к источнику вакуума, установленный для образца аэрозоля при скорости потока 1 л / мин в течение всего срока эксперимента.
Примечание: Масса препарата на фильтре после отбора проб в течение 45 мин может быть в диапазоне суб-микрограмм и / или смешивают с лактозой, NaCl, соли или другого транспортного средства. Микровесы, который читает до 0,1 микрограмм необходимы. Для того, чтобы получить точный вес препарата, нанесенный на фильтре, фильтр должен быть уравновешен и взвешивает в среде влажности контролируется. Масса лекарственного средства на фильтрах может быть использована только при расчете дозы, если нет транспортного средства в композиции или транспортное средство представляет собой вода. Когда есть транспортное средство, в композиции, кроме воды, вес вещества на фильтре только дает расчетную начальную точку для дальнейшего анализа содержания лекарственного средства с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). - Взвешивают и записывают вес стадии Ударный фильтров на 7 каскада и один последний «хвост» кусок; фильтр. Установить фильтр на каждом из семи этапов каскада ударника и собрать Mercer каскадного импактора 28. Подключение входа каскадного импактора к центральному аэрозольной камере статического давления образца порту и выходу к источнику вакуума, установленный для образца аэрозоля при скорости потока каскада Ударного откалиброван при температуре (обычно 0,5 или 1 л / мин) в течение срока действия эксперимент.
- Контролировать содержание аэрозоля устройства для ингаляции с аэрозольным монитором в режиме реального времени (см таблицы материалов и реактивов), чтобы подтвердить аэрозольные генераторы функциональны и получение стабильного аэрозоля в течение всего эксперимента. Подключение входного отверстия аэрозольного монитора в реальное время на центральный аэрозольной камеру статического давления образца порт и выход к источнику вакуума, установленный для образца аэрозоля при скорости потока 1 л / мин в течение всего срока эксперимента.
Примечание: Сигнал от реального времени аэрозольного монитора сообщается в мкг / л, но калибруется для дорожной пыли и должны быть откалиброватьдля каждого отдельного аэрозоля лекарственного средства с получением правильных значений концентрации аэрозолей. Калибровка не требуется использовать монитор, чтобы подтвердить наличие или отсутствие и временную стабильность концентрации аэрозолей. - Установка параметров управления технологическим процессом (поток воздуха, вакуум, давление, аэрозольный генератор энергии) до значений, требуемых, что зависит от количества животных, чтобы быть подключен к блоку ингаляции. Генераторы единичных ингаляций и аэрозольные непрерывно контролируется / отслеживается с помощью компьютеризированной системы управления процесса / сбора данных (DACO) от изготовителя (см Таблицы материалов и реагентов). Расход воздуха в устройство для ингаляции должен быть минимально приблизительно в 2 раза общей скорости минутной вентиляции всех животных в блоке ингаляции для того , чтобы избежать накоплений CO 2.
- Взвесьте абсолютный фильтр и записать вес фильтра. Поместите фильтр в держатель фильтра и собрать держатель фильтра. Подключите вход абсолютного держателя фильтрак центральному аэрозольной камере статического давления образца порту и выходу к источнику вакуума, установленный для образца аэрозоля при скорости потока 1 л / мин в течение всего срока эксперимента.
- Нагрузка мышей в нос только restrainers , прежде чем подвергать аэрозоля в нос только единицы ингаляции. Также сдерживающей нагрузки контроля напряжения животныхчтобы restrainers дышать комнатный воздух.
Примечание: эксперимент доза / ответ состоит из нескольких групп мышей, подвергнутых воздействию аэрозоля для различных количеств времени. Время экспозиции используется для контроля дозы каждая группа получает во время эксперимента доза / ответ.- Угол сдерживающей трубки к потолку при попытке загрузить животное, так как они имеют тенденцию бежать вверх, пытаясь убежать. Указав трубы вниз при загрузке будет способствовать оборачиваясь и вырваться из задней части трубки. Убедитесь, что нос мышей ориентирован на заостренный конец трубки и зафиксировать изменяемое положение плунжера в заднюю часть фиксатора.
Примечание: Поршень вылеплен, чтобы хвост мыши, чтобы выступать из держателя, что позволяет мыши, чтобы регулировать температуру тела, а в фиксатор. - Отрегулируйте плунжер, чтобы мыши, чтобы повернуть, но не повернуть голову к хвосту; чтобы обеспечить аэрозоль вдыхается.
- Постоянно следить зав то время как мыши, удерживающие трубки. После установки плунжера, маленький мышей (<20 г) часто пытается повернуть голова к хвосту в трубах и принять U-положение, в котором они имеют проблемы с дыханием. Это превращение поведение является самым распространенным в течение первых 5 минут сдержанности, после чего мыши редко пытаются повернуть голова к хвосту.
- Угол сдерживающей трубки к потолку при попытке загрузить животное, так как они имеют тенденцию бежать вверх, пытаясь убежать. Указав трубы вниз при загрузке будет способствовать оборачиваясь и вырваться из задней части трубки. Убедитесь, что нос мышей ориентирован на заостренный конец трубки и зафиксировать изменяемое положение плунжера в заднюю часть фиксатора.
3. Аэрозоль доставки
- Вставьте пробки для подключения к портам поставке блока для ингаляции и активировать генератор аэрозоля, сжатого воздуха, регулятор потока, а блок ингаляции вакуумный насос внутри программного обеспечения управления технологическим процессом.
- После того, как показания из аэрозольного монитора в режиме реального времени показывают , концентрация аэрозоля должен прийти к равновесию (~ 30 мин, рисунок 2), начать удаление пробки и вставить в нос только сдерживающие пробирки , содержащие мышей в устройство для ингаляции. Повторяйте, пока все мыши, чтобы выставляться препарат не подключены к устройству для ингаляции.
Примечание: Впример эксперимент, общий поток воздуха, подаваемый в блок для ингаляции с помощью аэрозольного генератора и разбавляющего воздуха устанавливается для подачи расхода / мин в 0,5 л на каждый из портов облучения животных в использовании. Так, например, 15 л / мин общий поток воздушный достаточно для снабжения каждого из 30 портов в блоке ингаляции. Это намного больше поток воздуха, чем требуется минутной вентиляции мышей, но больший поток воздуха, необходимо поставить (перепад давления на аэрозольный генератор) энергии для производства (атомизации / де-агломерат) аэрозоль. - После того, как все животные будут загружены в устройство экспонирования, включите насосы для отбора проб вакуума, которые подключены к абсолютному фильтра и каскадного импактору с использованием программного обеспечения управления процессом.
- Когда все экспозиции будут завершены, отключить генератор аэрозоля и удаление оставшегося мышея от блока ингаляции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные будут обработаны в изменении станции капоте или персонал носить маску. После завершения аэрозольной доставки, мыши являются гemoved от труб и трубок продезинфицировать после каждого использования.
4. Расчет наплавленного дозы
- Для расчета осажденной дозы 29 в мкг / кг (Уравнение 1) умножить концентрацию лекарственного средства в аэрозоле (мкг / л) х минут вентиляции (л / мин) х длительность экспозиции (мин) х вдыхаемой фракции х легочной фракции осаждения и разделить на вес тела (кг).
- Вычислить концентрацию аэрозолей (мкг / л) путем деления массы лекарственного средства от абсолютного фильтра (мкг) по скорости потока воздуха через фильтр (л / мин), умноженный на время выборки (мин). Расчетный минутную вентиляцию мышки с помощью аллометрическим уравнения в зависимости от веса тела 30. Ингаляционный фракция 1 , как аэрозоли пропускали через предварительный сепаратор для удаления не вдыхаемые частиц, и легочная фракция осаждения определяется из аэрозольного лекарственного средства MMAD (Рисунок 3) , с использованиемэкспериментальные калибровочные кривые из монодисперсных аэрозолей (Рисунок 4) 31.
Representative Results
Бромид ипратропии бронхолитической растворяли в 0,9% нормальном солевом растворе с концентрацией 1 мг / мл. 100 мл , шприц заполнен раствором рецептуры ипратропии и шприц был вставлен в шприце - насос , установленный для подачи струи распылителя (рисунок 1) при скорости потока 1 мл / мин. Активация системы управления для блока ингаляции инициирует 10 л / мин поток воздуха к струйным распылителем, 5 л / мин разбавления потока воздуха в камере растворения, и 15,5 л / мин потока вакуумного воздуха, чтобы привлечь аэрозоль лекарственного средства из ряда Устройство для ингаляции, как только она проходит нос мышей. Шприцевой насос и в режиме реального времени образец аэрозоля монитора насоса были активированы. Двадцать четыре мышей были вставлены в устройство для ингаляции аэрозоля после того , как монитор реального времени подтверждает , концентрация аэрозоля в блоке ингаляции пришла в равновесие (15-30 мин, Рисунок 2). Образец насосы для абсолютного фильтра (1 л / мин) и каскадаУдарный (0,5 л / мин) были включены, когда все мыши были подключены к блоку ингаляции. Первая группа из 8 мышей была удалена из устройства для ингаляции через 5 мин, во второй группе после 15 мин, и третьей группы после 45 мин. Бронхоконстрикция 32 была измерена как увеличение сопротивления дыхательной системы (РРП) в одной дозе распыленной метахолина (30 мг / мл) доставлены 2 ч после введения дозы ипратропий с помощью респиратора 33 грызуна. Процентное увеличение в РРПЕ для каждого животного, рассчитывается как максимальный RRS над 3-минутным интервалом после небулайзера метахолина (Rmax) минус величина РРПА от исходного измерения, прежде чем метахолин (Rbase), деленного на Rbase (увеличение в РРПЕ =% (Rmax -Rbase) / Rbase), был использован для количественного определения бронхоспазм.
Аэрозоль осаждается на каскадном импактор фильтрах и абсолютный фильтре в течение 45 мин аэрозольного воздействия растворяли в50% ацетонитрил и массу ипратропии количественно с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (таблица 1). Рассчитывалась СМАД х / GSD из ипратропий аэрозоля 1,7 х / 1,5 мкм (фиг.3) , и фракцию осаждения (DF) от 0,037 для мышей использовали для аэрозоля с MMAD 1,7 мкм (фиг.4). Вдыхаемой фракции (ИФ) был 1, как аэрозоль пропускали через предварительный сепаратор для удаления не вдыхаемых частиц. Средняя концентрация ипратропиума в аэрозоле (0,5 мкг / л) рассчитывали из массы ипратропия от абсолютного фильтра (22 мкг), деленный на скорость потока воздуха протягивается через фильтр (1 л / мин), умноженной на время выборки (45 мин). Средняя масса тела мышей был 0,019 кг и их предсказаны минутной вентиляции рассчитывали как 0,021 л / мин. Используя уравнение 1, осажденные дозы для 5, 15 и 45 мин экспозиции группы были 0,1, 0,3 и 0,9 мкг / кг; соответственно.
= «1»> Ипратропия ингибируется распыленной метахолина индуцированный бронхостеноз в возрасте 8 недель мышей C57BL / 6. Метахолин увеличилась РРП в течение нескольких секунд распыленного введения (рис 5, верхняя панель). РРП контрольной группы (контакт с воздухом помещения вместо ипратропий аэрозоля) увеличилась от исходного значения 0,62 ± 0,03 CMH 2 O * S / мл до максимального значения 1,66 ± 0,12 CMH 2 O * S / мл, что представляет собой увеличение 168 ± 9% в РРП, 70 лет после введения метахолина аэрозоля. Процентное увеличение сопротивления дыхательной системы ингибируется зависимым от дозы образом, с помощью ингаляционных доз ипратропиума. Процентное увеличение в РРП ингибируется на 51 ± 9%, 79 ± 14% и 89 ± 2% (рисунок 5, нижняя панель) при ингаляционных депонированных доз ипратропиума 0,1, 0,3 и 0,9 мкг / кг, соответственно.
г»/>
Рисунок 1: Блок ингаляции с аэрозольным генератором сухого порошка прилагается. Распылитель используется для генерирования аэрозоля из жидких композиций показан справа. 1) подача Райт пыли, 2) циклон, 3) шприцевой насос, 4) струйный распылитель вставляется в пресепаратор, 5) разбавляющий воздух смеситель. При доставке распыляемых аэрозолей, подача пыли и циклон заменены шприцевого насоса, / пресепаратором струйного распылителя, и воздушный смеситель для разбавления. Увеличенный вид (модифицированный из Oldham 21) показывает путь потока аэрозоля в зоне дыхания вокруг носа животного , который создается путем вставки сдерживающей трубки в блок ингаляции. Аэрозоль заполняет центральные аэрозольный (серый) Пленум устройства для ингаляции, вытекает к носу животного, где оно вытягивается назад под небольшим вакуумом во внешнем (белом) пленуме и в фильтры для сбора отходов (не показано). Plлегкость нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: в режиме реального времени измерения аэрозольного монитора подтверждают концентрация аэрозоля в блоке ингаляции достигает равновесия ~ 30 мин после включения генератора аэрозоля. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: ипратропий массу собирали на каждой стадии каскадного импактора (синие гистограммы) перекрывается подбора кривой (черная кривая) , используемой для расчета MMAD и GSD распределения размера аэрозольных частиц. пожалуйстаНажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Осаждение фракция для легких мышей в зависимости от MMAD для аэрозолей , поставляемых нос только ингаляции (как модифицированные из Се 31). Для частиц размером выдыхается менее 0,5 мкм большую часть аэрозоля и не осаждается в легких (например, сигаретный дым). Для частиц размером более 5 мкм, большая часть аэрозоля отфильтровывают через нос. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Быстрое увеличение сопротивления дыхательной системы , индуцированное распыленным метахолин administeкрасный до мышея заблокирована ипратропией выступила нос только ингаляция мышей (n = 8 на группу, верхнюю панель). Ипратропия ингибирует индуцированную метахолин увеличение сопротивления дыхательной системы с ED 50 0,1 мкг / кг наплавленной дозы (* р <0,05 по сравнению с контролем, нижняя панель). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Данные ИМПАКТОРА Cascade используются для расчета СМАДА и GSD | ||
| Этап Фильтр | Ipratropium на фильтре с помощью ВЭЖХ (мг) | Этап Cut Диаметр (мм) |
| 1 | 0,002 | 6 |
| 2 | 0,19 | 4.5 |
| 3 | 1,43 | 2.5 |
| 4 | 2,55 | 1,5 |
| 5 | 2,95 | 1.2 |
| 6 | 1,03 | 0.7 |
| 7 | 0,37 | 0,5 |
Таблица 1: Данные ИМПАКТОРА Cascade используются для расчета СМАДА и GSD
Discussion
Нос-единственная система для ингаляции и его работа для доставки фармацевтических аэрозолей в легкие грызунах были описаны. Удерживающие животных в нос только держатели является широко используемым методом для экспонирования животных в воздухе материала. Был проведен эксперимент демонстрирует антихолинергическим бронходилататоров ипратропия бромид 34 может мощно обратного метахолина индуцированного бронхоспазма при доставке нос только ингаляции мышам с ED 50 0,1 мкг / кг , осажденных дозу. Увеличение более чем в 10 раз в эффективной дозе ипратропиума требовалось для бронходилатации после внутритрахеальной доставки (ЭДЫ 50 интратрахеальных = 1,3 мкг / кг, данные не показаны) доставки. Это происходит из - за неоднородного рисунка осаждения лекарственного средства в легких , полученных путем внутритрахеальной дозирования 3, 5, 10. 10-кратный и более эффективная дозаРазличия между ингаляционным и интратрахеальным методов дозирования для других лекарственных средств были отмечены ранее другими 4.
Неоднородная картина осаждение лекарственного средства в легких , полученных путем внутритрахеальной дозирования также замедляет всасывание препарата в легкие 35, уменьшая скорость , с которой лекарственное средство поступает в системный кровоток и уменьшая вероятность видеть системные побочные эффекты. Поэтому, чтобы оптимизировать безопасность / эффективность (терапевтический индекс) 36 из новых ингаляционных препаратов, нос только поставку ингаляции следует использовать. Интратрахеальное осаждение даст неточную оценку TI пути генерации ошибочно высокие эффективные доз в легких и низких дозах в системный кровоток.
По мере появления новых препаратов доставленные ингаляционными разработаны, необходимо соответствующим образом перевести эффективную дозу лекарственного средства из доклинических исследований эффективности предсказать эффficacious человека доза для клинических испытаний. Позорная смерть Tusko слон 37 обычно цитируется в литературе , чтобы напомнить нам использовать Аллометрические масштабирование для прогнозирования доз межвидовых наркотиков и дозы межвидовых наркотиков не должны быть линейно экстраполированы на основе простого сравнения массы тела. Обычно использовать аллометрический подход с аллометрическим показателем б 0,67 для прогнозирования дозы препарата человека от доклинических исследований эффективности 38. С помощью мышей вдыхают ED 90 0,9 мкг / кг в течение ипратропии, с аллометрическим показателем 0,67, массы тела мыши 0,03 кг, и человек масса тела 60 кг; по оценкам , ЭД 90 человек 0,07 мкг / кг ((0,9 * (0,03 / 60) (1-0.67) = 0,07) может быть вычислена как предсказанного человека , осажденного дозы от наших данных мышей. Это прогнозируемое значение сопоставимо с фактическим человеком эффективна доза осаждается 0,26 мкг / кг, которые могут быть вычислены из доставленных сделатьсе 40 мкг 39 , разделенной на человека массой тела 60 кг , умноженное на человека пероральной ингаляции легких осаждения фракции 16 0,4 ((40/60) * 0,4 = 0,26). Оценка эффективной дозы ингаляционных осажденного человека также помогает планировать доставленные дозы , используемые в исследованиях ингаляции токсикологии , необходимые для проведения клинических испытаний 40.
Специализированное оборудование и большое количество исследуемого соединения (грамм) величины, необходимое для носа только вдыхаемого доставки лекарственного средства может быть значительными ограничения при разработке носа только техники ингаляции. Калибровочный прогон без настоящих животных необходимо, если конкретная доза требуется для (обычно токсикологии и не эффективность дозы / ответ) исследований, и эта калибровка перспектива потребует большего количества лекарственного средства должна быть доступны. Эта калибровка запуск необходим, так как физико-химические свойства каждой лекарственного средства / композиции могут варьироваться в достаточно, чтобы существенно повлиять на осажденную дозупрепарата в легких. Оптимизация воздуха и подачи лекарственного средства ставок генератора аэрозоля во время калибровки перспективы требуется для достижения размера частиц аэрозоля и концентрации для конкретной требуемой дозы. В то время как воздух и подачи лекарственного средства скорость аэрозольного генератора предлагаемая в способах является разумной отправной точкой, существует возможность, что для конкретного лекарственного препарата не-вдыхаемый (размера частиц> 5 мм) аэрозоль будет сгенерирован. На доклинической стадии, часто нет в наличии достаточно наркотиков, чтобы сделать калибровочный прогон, и невозможно знать априорно какие дозы (если таковые имеются) попадание в легкие. Кроме того, статическое электричество производится в процессе генерации аэрозоля и может влиять на время, необходимое для концентрации аэрозолей, чтобы уравновесить. Важно правильно заземлить оборудование для минимизации статического заряда. Другой вариант, чтобы минимизировать статическое электричество, чтобы добавить влажность воздуха, подаваемого в блок вдоха, чтобы увеличить проводимость ирассеивают электростатические заряды на частицах 25. Увлажнение воздуха, подаваемый в генератор аэрозоля не требуется для комфорта животных в течение коротких (<1 ч) дозировании сессий, но следует учитывать, если используются больше дозирования раз.
Препараты могут быть доставлены в легкие животных путем пассивного носа только ингаляцией или прямыми методами трахеи, которые обходят носоглотки осаждения. Нос-только поставка ингаляции обычно используется в области ингаляционной токсикологии 41 , но редко используется в начале процесса обнаружения наркотиков. Междисциплинарная исследовательская группа необходима для проведения носа только ингаляционные исследования в связи с: потребность в больших количествах лекарства, специализированные знания, необходимые для разработки, генерации и характеристики аэрозолей; эксплуатации сложного оборудования, а также измерить эффективность препарата на животных моделях заболеваний дыхательных путей. Способы доставки, описанные здесь, используются для разработки Smalл молекулы вдохнул препараты , но в будущем может быть применен для разработки ингаляционных биопрепаратов 42, 43. Надеюсь, что процедуры и рекомендации, представленные в этом манускрипте будет способствовать новые доклинические обнаружения наркотиков и токсикологии исследователей приобрести навыки, необходимые для доставки лекарственных средств для грызунов аэрозольной ингаляции.
Disclosures
Все авторы использовали на Amgen. Публикация платы за этого это видео-статьи оплачиваются Amgen.
Acknowledgments
Мы признаем: Д-р Томас Будиман на TSE Systems GmbH для его технической экспертизы и оборудования настройки. Джон Фрай (Battelle Inc.) и д-р Руди Йегер (CH Technologies Inc.) за полезное обсуждение. Тянь Ву, Сэм Mboggo, апрель Миллер и Шон Дэвис (Amgen) за помощь при проведении экспериментов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nose-only exposure inhalation unit | TSE systems | 700100-KNES-040-ss | Custom configurations available |
| DACO data acquisition system | TSE systems | 700400-PRO-C-D/1 | |
| MC One Jet Mill | Jetpharma | DEC MicroJet 10 | |
| Turbula Mixer | GlenMills Inc | T2F | |
| Micronized Lactose | DFE Pharma | Lactohale 200 | |
| Hydraulic press | Specac | GS15011 | |
| Cascade impactor filters | Pall Life Sciences | 7219 | Emfab filter |
| Absolute filters | Whatman | 10370302 | 5 cm diameter |
| Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor |
Casella | CEL-712 | |
| Ipratropium bromide | Spectrum Chemical | I1178 | pre-micronized |
| flexiVent FX1 system | scireq | FV-FXCS |
References
- Chapman, R. W., et al. Pharmacology of a potent and selective inhibitor of PDE4 for inhaled administration. Eur J Pharmacol. 643 (2-3), 274-281 (2010).
- Phillips, J. E., et al. Btk inhibitor RN983 delivered by dry powder nose-only aerosol inhalation inhibits bronchoconstriction and pulmonary inflammation in the ovalbumin allergic mouse model of asthma. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 29 (3), 233-241 (2016).
- Zecchi, R., et al. Impact of drug administration route on drug delivery and distribution into the lung: an imaging mass spectrometry approach. Eur J Mass Spectrom. 19 (6), 475-482 (2013).
- Cooper, A. E., Ferguson, D., Grime, K. Optimisation of DMPK by the inhaled route: challenges and approaches. Curr Drug Metab. 13 (4), 457-473 (2012).
- Leong, B. K., Coombs, J. K., Sabaitis, C. P., Rop, D. A., Aaron, C. S. Quantitative morphometric analysis of pulmonary deposition of aerosol particles inhaled via intratracheal nebulization, intratracheal instillation or nose-only inhalation in rats. J Appl Toxicol. 18 (2), 149-160 (1998).
- Pauluhn, J. Overview of inhalation exposure techniques: strengths and weaknesses. Exp Toxicol Pathol. 57 Suppl 1, 111-128 (2005).
- Wong, B. A. Inhalation exposure systems: design, methods and operation. Toxicol Pathol. 35 (1), 3-14 (2007).
- Phalen, R. F. Inhalation Studies Foundations and Techniques. , 2nd, Informa Healthcare. (2009).
- Siddiqui, S., et al. Pulmonary eosinophilia correlates with allergen deposition to the lower respiratory tract in a mouse model of asthma. Clin Exp Allergy. 38 (8), 1381-1390 (2008).
- Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur J Pharm Biopharm. 61 (3), 214-218 (2005).
- Morello, M., et al. Dry-powder pulmonary insufflation in the mouse for application to vaccine or drug studies. Tuberculosis (Edinb). 89 (5), 371-377 (2009).
- Guillon, A., et al. Pulmonary delivery of dry powders to rats: tolerability limits of an intra-tracheal administration model. Int J Pharm. 434 (1-2), 481-487 (2012).
- Pauluhn, J., Mohr, U. Inhalation studies in laboratory animals--current concepts and alternatives. Toxicol Pathol. 28 (5), 734-753 (2000).
- Snipes, M. B., McClellan, R. O., Mauderly, J. L., Wolff, R. K. Retention patterns for inhaled particles in the lung: Comparisons between laboratory animals and humans for chronic exposures. Health Phys. 57 (Sup 1), 69-78 (1989).
- Wright, B. M. A new dust-feed mechanism. J Sci Inst. 27, 12-15 (1950).
- Scheuch, G., Siekmeier, R. Novel approaches to enhance pulmonary delivery of proteins and peptides. J Physiol Pharmacol. 58 Suppl 5 (Pt 2), 615-625 (2007).
- Phillips, J. E., Ji, L., Rivelli, M. A., Chapman, R. W., Corboz, M. R. Three-dimensional analysis of rodent paranasal sinus cavities from X-ray computed tomography (CT) scans. Can J Vet Res. 73 (3), 205-211 (2009).
- Wolff, R. K. Toxicology studies for inhaled and nasal delivery. Mol Pharm. , (2015).
- Oldham, M. J., Phalen, R. F., Budiman, T. Comparison of predicted and experimentally measured aerosol deposition efficiency in BALB/c mice in a new nose-only exposure system. Aerosol Sci Technol. 43 (10), 970-977 (2009).
- Cannon, W. C., Blanton, E. F., McDonald, K. E. The flow-past chamber: an improved nose-only exposure system for rodents. Am Ind Hyg Assoc J. 44 (12), 923-928 (1983).
- Narciso, S. P., Nadziejko, E., Chen, L. C., Gordon, T., Nadziejko, C. Adaptation to stress induced by restraining rats and mice in nose-only inhalation holders. Inhal Toxicol. 15 (11), 1133-1143 (2003).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Zeng, X., Martin, G., Marriott, C. Particulate Interactions in Dry Powder Formulations for Inhalation. , Taylor & Francis. (2001).
- O'Riordan, T. G. Formulations and nebulizer performance. Respir Care. 47 (11), 1305-1313 (2002).
- Pilcer, G., Amighi, K. Formulation strategy and use of excipients in pulmonary drug delivery. Int J Pharm. 392 (1-2), 1-19 (2010).
- Mercer, T. T., Tillery, M. I., Newton, G. J. A multi-stage, low flow rate cascade impactor. J. Aerosol Sci. 1 (1), 9-15 (1970).
- Forbes, B., et al. Challenges in inhaled product development and opportunities for open innovation. Adv Drug Deliv Rev. 63 (1-2), 69-87 (2011).
- Alexander, D. J., et al. Association of inhalation toxicologists (AIT) working party recommendation for standard delivered dose calculation and expression in non-clinical aerosol inhalation toxicology studies with pharmaceuticals. Inhal Toxicol. 20 (13), 1179-1189 (2008).
- Hsieh, T. H., Yu, C. P., Oberdorster, G. Deposition and clearance models of Ni compounds in the mouse lung and comparisons with the rat models. Aerosol Sci Technol. 31 (5), 358-372 (1999).
- Phillips, J. E., et al. House dust mite models: will they translate clinically as a superior model of asthma. J Allergy Clin Immunol. 132 (1), 242-244 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. JoVE. (75), e50172 (2013).
- Storms, W. W., DoPico, G. A., Reed, C. E. Aerosol Sch 1000. An anticholinergic bronchodilator. Am Rev Respir Dis. 111 (4), 419-422 (1975).
- Schanker, L. S., Mitchell, E. W., Brown, R. A. Jr Species comparison of drug absorption from the lung after aerosol inhalation or intratracheal injection. Drug Metab Dispos. 14 (1), 79-88 (1986).
- Biju, P., et al. Steroidal C-21 mercapto derivatives as dissociated steroids: discovery of an inhaled dissociated steroid. Bioorg Med Chem Lett. 21 (21), 6343-6347 (2011).
- West, L. J., Pierce, C. M., Thomas, W. D. Lysergic acid diethylamide: Its effects on a male asiatic elephant. Science. 138 (3545), 1100-1103 (1962).
- Boxenbaum, H., DiLea, C. First-time-in-human dose selection: allometric thoughts and perspectives. J Clin Pharmacol. 35 (10), 957-966 (1995).
- Spina, D. Current and novel bronchodilators in respiratory disease. Curr Opin Pulm Med. 20 (1), 73-86 (2014).
- Degeorge, J. J., et al. Considerations for toxicology studies of respiratory drug products. Regul.Toxicol.Pharmacol. 25 (2), 189-193 (1997).
- McClellan, R. O., Henderson, R. F. Concepts in Inhalation Toxicology. , Taylor & Francis Group. (1989).
- Patton, J. S., et al. The particle has landed--characterizing the fate of inhaled pharmaceuticals. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 23 Suppl 2, S71-S87 (2010).
- Depreter, F., Pilcer, G., Amighi, K. Inhaled proteins: Challenges and perspectives. Int J Pharm. 447 (1-2), 251-280 (2013).
