Introduction
दिल भ्रूण 1, 2 में विकसित करने के लिए पहले कार्यात्मक अंग है। संचार प्रणाली के साथ संयोजन के रूप में, यह ऑक्सीजन, पोषक तत्वों, और विकास के दौरान एक अपशिष्ट निपटान तंत्र आपूर्ति करती है। तीन हफ्ते निषेचन के बाद, मानव हृदय पहली बार के लिए धड़क रहा है और इसके समुचित नियमन cardiomyocytes (सीएम) द्वारा बनाए रखा है। इन विशेष कोशिकाओं के अपरिवर्तनीय नुकसान इसलिए मूलभूत मुद्दे प्रगतिशील दिल की विफलता अंतर्निहित है। ऐसे zebrafish और Xenopus के रूप में कुछ जीवों के हृदय उत्थान के लिए क्षमता है, वहीं वयस्क स्तनधारी दिल और अधिक सीमित 3, 5, 6 है। इस प्रकार, दिल का महत्वपूर्ण कार्य को देखते हुए यह नहीं आश्चर्यजनक है कि हृदय रोग दुनिया में मौत का प्रमुख कारण है, संयुक्त राज्य अमेरिका अकेले 7 में 600,000 से होने वाली मौतों के लिए लेखांकन।refore, सेल आधारित चिकित्सा कुशलता से मरम्मत या घायल मायोकार्डियम को बदलने के लिए महान नैदानिक रुचि के हैं।
यामानाका और उनके सहयोगियों 8 की मौलिक अध्ययन से पता चला है कि चार प्रतिलेखन कारक के लिए मजबूर अभिव्यक्ति स्टेम कोशिकाओं को पूरी तरह से विभेदित fibroblast कोशिकाओं में परिवर्तित करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, सभी स्टेम सेल रणनीतियों के tumorigenic क्षमता चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए उनके उपयोग में एक गंभीर चिंता का विषय रहा है। यह वैकल्पिक तरीकों कोशिकाओं transdifferentiate करने के लिए, जबकि एक pluripotent चरण परहेज खोज करने के लिए वैज्ञानिक क्षेत्र प्रेरित किया। हाल ही में, कई समूहों के प्रतिलेखन के अस्थानिक अभिव्यक्ति के साथ प्रेरित cardiomyocyte कोशिकाओं की तरह (iCLMs) करने के लिए माउस fibroblasts की प्रत्यक्ष रूपांतरण प्रदर्शित करके इस रणनीति की व्यवहार्यता का पता चला है कारकों Gata4, Mef2c, Tbx5, और बाद में, Hand2 (जीएमटी और GHMT , क्रमशः) 9, 10। furthermore, एक ही रणनीति विवो में और मानव व्युत्पन्न ऊतकों 9, 11, 12 में किया जा सकता है। हाल के अध्ययनों से अतिरिक्त कारकों या संकेत दे रास्ते कि आगे हृदय reprogramming दक्षता 13, 14, 15 में सुधार के लिए संग्राहक जा सकता है पर प्रकाश डाला है। साथ में ले ली, इन अध्ययनों पुनर्योजी उपचार के लिए निर्देशित transdifferentiation की क्षमता प्रदर्शित करता है। हालांकि, methodological मतभेद के कारण 16 मुख्यमंत्री reprogramming, अज्ञात आणविक तंत्र, असंगत reproducibility की कम क्षमता, और iCLMs की विषम प्रकृति unaddressed रहते हैं।
आदेश सीधे iCLM विविधता का मूल्यांकन करने के लिए हम sarcomere विकास और हृदय वंश specificatio की पहचान के लिए एक असतत और मजबूत एकल कोशिका परख के लिए बनाया गयाएन-दो कार्यात्मक cardiomyocytes के लिए आवश्यक विशेषताओं। आलिंद (एएम), निलय (वीएम) और पेसमेकर (प्रधानमंत्री) 17, 18, 19, 20: के रूप में उनके स्थान और अद्वितीय बिजली के गुणों से परिभाषित दिल में मुख्यमंत्री के कम से कम तीन प्रमुख प्रकार के होते हैं। एक करवाया संयोजन में, वे खून के समुचित पंप अनुमति देते हैं। दिल की चोट के दौरान, एक या सभी उपप्रकार को प्रभावित किया जा सकता है, और सेल थेरेपी के प्रकार के एक मामले दर मामले के आधार पर समाधान किए जाने की आवश्यकता होगी। वर्तमान में, सबसे रणनीतियों, cardiomyocytes के समग्र पीढ़ी पर ध्यान केंद्रित करते हुए छोटे से काम के आणविक तंत्र है कि उप प्रकार विनिर्देश का नियमन का अध्ययन करने के लिए किया जा रहा है।
निम्नलिखित अध्ययन विवरण कैसे ठीक से अच्छी तरह से संगठित sarcomeres यों और cardiomyocyte उपप्रकार की एक विविध सेट की पहचान। एक पेसमेकर (प्रधानमंत्री) विशिष्ट संवाददाता माउस का प्रयोग, हम एक मैं लागू करने में सक्षम हैंmmunocytochemical दृष्टिकोण प्रेरित आलिंद की तरह myocytes (आई ए एम), प्रेरित वेंट्रिकुलर-तरह myocytes (Ivm), और प्रेरित PM-तरह myocytes (IPMS) 21 भेद करने के लिए। हमारी टिप्पणियों के आधार पर, केवल कोशिकाओं है कि sarcomere संगठन का प्रदर्शन सहज पिटाई करने में सक्षम हैं। इस अनूठी reprogramming मंच भूमिका का आकलन करने के लिए अनुमति देता है एकल कोशिका संकल्प पर sarcomere संगठन, उप प्रकार विनिर्देश, और मुख्यमंत्री reprogramming की दक्षता में से कुछ मापदंडों।
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Protocol
सभी प्रयोगात्मक पशु प्रथाओं को शामिल प्रक्रियाओं UT दक्षिण मेडिकल सेंटर में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. Hcn4-GFP E12.5 माउस भ्रूण fibroblast के अलगाव (MEFs)
- homozygous Hcn4-GFP पुरुषों और CD-1 महिलाओं के बीच समय matings सेट करें।
- कार्बन डाइऑक्साइड इच्छामृत्यु और बाद में ग्रीवा अव्यवस्था से E12.5 में गर्भवती महिला बलिदान।
- के रूप में पहले 22 में वर्णित है, 23 विदारक संदंश के साथ गर्भाशय सींग निकालें, और उन्हें सीए 2 या मिलीग्राम बिना 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ बर्फ पर एक पेट्री डिश 2+ में जगह है।
- बाँझ तकनीक का उपयोग टिशू कल्चर हुड में बाद के सभी चरणों का प्रदर्शन।
- कैंची का उपयोग और संदंश विदारक थैली गर्भाशय और एमनियोटिक से भ्रूण निकालें। नाल बेहतर हैंडलिंग के लिए संलग्न रखें। pregnaNT CD-1 महिलाओं को आम तौर पर 10 से 14 के बीच है और पिल्ले को जन्म देते हैं।
- संदंश विदारक का उपयोग करना, पृथक भ्रूण लेते हैं और उन्हें जल्दी से 70% (वी / वी) EtOH में दो बार कुल्ला।
ध्यान दें: washes कोशिका मृत्यु को कम करने के लिए तेजी से होना चाहिए। - सिर, हाथ-पैर, पूंछ, और आंतरिक अंगों निकालें, पृथक भ्रूण से दिल भी शामिल है।
- लगभग 1 मिमी 3 आकार में करने के लिए एक बाँझ धार का उपयोग 1x पीबीएस और पतले कीमा के 1 एमएल के साथ एक 10 सेमी डिश में शेष ऊतक रखें।
- पीबीएस के साथ एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण।
- 3 मिनट के लिए 300 XG पर स्पिन। ध्यान से अतिरिक्त पीबीएस aspirate।
- भ्रूण प्रति बाँझ 0.25% trypsin EDTA के 1 एमएल जोड़ें। 15 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं को सेते हैं। धीरे ट्यूब मिश्रण हर 4 मिनट। ओवर-पाचन ऊतक की काफी पैदावार कम होगी।
- 4 एस के लिए अधिकतम गति (3200 आरपीएम) पर भंवर सेल मिश्रण।
- fibroblast मीडिया के 2 मिलीलीटर भ्रूण प्रति और मिश्रण जोड़ें। फ़िल्टर टीएक 100 माइक्रोन सेल एक पिपेट का उपयोग झरनी के माध्यम से कोशिकाओं को सहायता करने के लिए झरनी hrough। बाद के सभी माध्यमों के निर्माण के लिए 1 तालिका को देखें।
- 4 मिनट के लिए 300 XG पर स्पिन। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate।
- ताजा fibroblast मीडिया के 10 एमएल 3 भ्रूण प्रति जोड़ें और 6-10 बार triturate।
- तैयार हर 3 भ्रूण के लिए 1 15 सेमी टिशू कल्चर डिश में कोशिकाओं थाली। एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में संस्कृति रात भर।
- रात ऊष्मायन के बाद, प्लेट प्रति मीडिया की ताजा 30 एमएल के साथ मीडिया की जगह। कोशिकाओं इनक्यूबेटर में वापस रात भर रखें।
नोट: Hcn4-+ GFP एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे सेल संदूषण के लिए जाँच करें। संस्कृति GFP होना चाहिए - और केवल reprogramming पर + GFP हो जाते हैं। - अगले दिन, ताजा पूर्व गर्म 0.25% trypsin EDTA के 3 एमएल के साथ फसल कोशिकाओं। गणना और कोशिकाओं फ्रीज। आमतौर पर, एमएल प्रति 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं में कोशिकाओं को फ्रीज। उम्मीद Yieएलडी भ्रूण प्रति 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं होना चाहिए।
2. Retrovirus उत्पादन और Reprogramming
सावधानी: निम्नलिखित प्रोटोकॉल उत्पादन और संक्रामक रेट्रोवायरस के निपटने की आवश्यकता है। बीएसएल -2 दिशा निर्देशों और बाँझ तकनीक के तहत एक जैव सुरक्षा स्तर 2 कैबिनेट में निम्न चरणों का प्रदर्शन। रेट्रोवायरस के संपर्क में सभी सामग्री के निपटान के लिए 10% ब्लीच का प्रयोग करें।
- Retrovirus उत्पादन और MEFs तैयारी
नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल 24 अच्छी तरह प्लेटें में 6 अच्छी तरह प्लेटों में रेट्रोवायरल उत्पादन और MEF संक्रमण के लिए है। अन्य प्रारूपों के लिए, 2 टेबल को देखें। MEFs, डे -1 पर चढ़ाया तो समय एक प्रयोग के लिए उचित रूप से समन्वित करने (धारा 2.3 और चित्रा 2 देखें) की आवश्यकता होगी रहे हैं।- बेनी-ई (पीई) निर्माता की सिफारिशों के अनुसार कोशिकाओं को बनाए रखें। संक्षेप में, DMEM में संस्कृति पीई कोशिकाओं 10% FBS, 1 माइक्रोग्राम / एमएल puromy के साथ पूरकसीआईएन, 10 माइक्रोग्राम / एमएल blasticidin, पेनिसिलिन, और स्ट्रेप्टोमाइसिन। पारित होने कोशिकाओं 1: 4 हर दो दिन में जब संस्कृति 70-90% confluency तक पहुँचता है।
- डे -2: दिन अभिकर्मक पहले, अभिकर्मक मीडिया में 6 अच्छी तरह से थाली पर अच्छी तरह / 1 x 10 6 कोशिकाओं पर बेनी-ई कोशिकाओं बीज। कोशिकाओं अभिकर्मक के समय में 70-80% मिला हुआ होना चाहिए।
- अभिकर्मक अभिकर्मक एक वाणिज्यिक एजेंट का उपयोग कर।
नोट: वाणिज्यिक अभिकर्मकों अभिकर्मक से पहले कमरे के तापमान (आरटी) पर होना चाहिए। डीएनए अभिकर्मक के लिए, एक GHMT कॉकटेल 9 फार्म के लिए प्रत्येक रेट्रोवायरल प्लास्मिड डीएनए को व्यक्तिगत रूप से (जी, एच, एम, और टी) जोड़ें।- डे -1: 15 एमएल शंक्वाकार polystyrene ट्यूब में 60 μL कम हो सीरम मीडिया की प्रतिक्रिया प्रति अभिकर्मक अभिकर्मक के 6 μL के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली प्रारूप के लिए मिश्रण। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
नोट: अभिकर्मक अभिकर्मक यहां इस्तेमाल प्लास्टिक को बांधता है के बाद से, एकसीधे कम हो सीरम मीडिया के लिए अभिकर्मक दक्षता में किसी भी कमी से बचने के लिए डीडी। - प्रतिक्रिया प्रति GHMT कॉकटेल के 2 माइक्रोग्राम की कुल जोड़ें और धीरे यह मिश्रण करने के लिए नल। भंवर मत करो। आरटी पर 15 मिनट के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं।
- एक बूंद बुद्धिमान तरीके से पीई कोशिकाओं के लिए कदम 2.2.3 से मिश्रण जोड़ें।
- एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रात भर ट्रांसफ़ेक्ट बेनी-ई कोशिकाओं को सेते हैं। अभिकर्मक के समय रिकॉर्ड।
- डे -1: 15 एमएल शंक्वाकार polystyrene ट्यूब में 60 μL कम हो सीरम मीडिया की प्रतिक्रिया प्रति अभिकर्मक अभिकर्मक के 6 μL के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली प्रारूप के लिए मिश्रण। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
- Hcn4-GFP माउस भ्रूण fibroblasts की सीडिंग।
- 1 घंटे MEFs चढ़ाना पहले, immunocytochemistry के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली तैयार करते हैं।
- अच्छी तरह से प्रति एक 12 मिमी फ़ाइब्रोनेक्टिन coverslip जोड़ें।
- गोजातीय कोलेजन समाधान के 300 μL (जैसे, SureCoat) और साथ कोट कुओं 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं।
- महाप्राण कोटिंग समाधान तुरंत MEF चढ़ाना पहले।
- Hcn4-GFP MEFs के एक जमे हुए शीशी पिघलना और पूर्व गर्म fibrobl साथ X1 धोने5 मिनट के लिए 500 XG पर एएसटी मीडिया।
- trypan नीले बहिष्कार या इसी तरह के रंगों का उपयोग सेल व्यवहार्यता का निर्धारण। निम्न सूत्र का उपयोग संस्कृति के एमएल प्रति व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना:
% व्यवहार्य कोशिकाओं = [1.00 - (नीली कोशिकाओं की संख्या / कुल कोशिकाओं की संख्या)] x 100- निम्न सूत्र का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना:
व्यवहार्य कोशिकाओं =% व्यवहार्य कोशिकाओं x कमजोर पड़ने कारक x 10,000 एक्स सेल निलंबन की कुल मात्रा
- निम्न सूत्र का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना:
- बीज 3 एक्स 10 4 पहले से तैयार गोजातीय कोलेजन समाधान-फ़ाइब्रोनेक्टिन coverslip के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली पर अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं।
- 1 घंटे MEFs चढ़ाना पहले, immunocytochemistry के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली तैयार करते हैं।
- पारगमन और MEFs के reprogramming
नोट: निर्माता के नोट्स के अनुसार, ठीक से बनाए रखा बेनी-ई कोशिकाओं 1 10 x 7 संक्रमण इकाइयों / एमएल के एक औसत अनुमापांक का उत्पादन। हालांकि अनुमापांक सीधे एक प्रयोग के लिए मापा नहीं है, एक GFP नियंत्रण हमेशा संक्रमण दक्षता के लिए एक किराए के रूप में शामिल किया गया है।उच्च GFP अभिव्यक्ति और तीव्रता (+ GFP> 95%) आम तौर पर iCLMs के सफल GHMT की मध्यस्थता पीढ़ी के साथ संबद्ध।- दिवस 0: 24 घंटे बाद अभिकर्मक, एक 0.45 माइक्रोन ताकना आकार surfactant मुक्त सेलूलोज एसीटेट फिल्टर के माध्यम से पीई रेट्रोवायरल मध्यम फिल्टर और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण। 8 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए polybrene जोड़ें। ध्यान से ताजा अभिकर्मक के माध्यम से 2 एमएल के साथ कोशिकाओं की भरपाई होगी।
नोट: कोशिकाओं को आसानी से थाली से अलग करता है, तो मीडिया भी तेजी से बदल रहा है। - सुसंस्कृत MEFs का माध्यम Aspirate और हौसले से एकत्र रेट्रोवायरल मध्यम जोड़ने; यह 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से मीडिया के 1.7 एमएल उपज चाहिए। 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से ~ 800 μL जोड़ें। इनक्यूबेटर MEF थाली लौटें और रातोंरात सेते हैं।
- दिन 1: दोहराएँ 2.4.1 और 2.4.2 कदम। 2 एन डी वायरस संग्रह के बाद कोशिकाओं को त्यागें। इनक्यूबेटर संक्रमित MEFs लौटें और उन्हें रात भर आराम करते हैं।
- दिन 2: 48 घंटे के बाद प्रेरण, 1x पीबीएस के साथ सेल वातानुकूलित मीडिया और धोने X1 aspirate। एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 500 μL पूर्व गरम iCLM मीडिया जोड़ें।
- iCLM मीडिया बदलें हर 2 - 3 दिनों के लिए। प्रक्रिया प्लेट 14 दिनों immunocytochemistry (आईसीसी) हृदय reprogramming के विश्लेषण के लिए वायरल शामिल होने के बाद।
- दिवस 0: 24 घंटे बाद अभिकर्मक, एक 0.45 माइक्रोन ताकना आकार surfactant मुक्त सेलूलोज एसीटेट फिल्टर के माध्यम से पीई रेट्रोवायरल मध्यम फिल्टर और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण। 8 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए polybrene जोड़ें। ध्यान से ताजा अभिकर्मक के माध्यम से 2 एमएल के साथ कोशिकाओं की भरपाई होगी।
3. reprogrammed MEFs की Immunostaining
- 14 दिनों के बाद प्रेरण, ध्यान से मीडिया aspirate।
- ठंडा 1x पीबीएस के 300 μL के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक कुल्ला। अतिरिक्त समाधान aspirate।
- 4% paraformaldehyde (पीएफए) अच्छी तरह से प्रति एक 24 अच्छी तरह से थाली के समाधान के 250 μL के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। आरटी पर 15 मिनट सेते हैं।
नोट: - धुंधला से पहले 2 हफ्तों के फिक्स्ड कोशिकाओं 1 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है। - 300 μL 0.1% पीबीएस TritonX 100 (PBST) के साथ कपड़े धोने कुओं X3 द्वारा Permeabilize कोशिकाओं। washes के बीच आरटी पर 5 मिनट सेते हैं। पिछले धोने के बाद अतिरिक्त समाधान aspirate।
- 10 के लिए ब्लॉक300 μL / अच्छी तरह से 1x यूनिवर्सल ब्लॉक बफर के साथ आरटी पर मिनट।
- (आईसीसी) धुंधला बफर तैयार: 1x पीबीएस और 1x यूनिवर्सल के 1 बफर अवरुद्ध: 1 जोड़ें। आईसीसी धुंधला बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एंटीबॉडी सेते हैं। सिफारिश dilutions के लिए सामग्री अनुभाग का संदर्भ लें।
- माउस α-actinin, चिकन αGFP, और खरगोश आईपीएम और आई ए एम पहचान के लिए एनपीपीए के साथ स्लाइड्स की एक जोड़ी दाग।
- माउस α-actinin, चिकन αGFP, और आईपीएम और Ivm पहचान के लिए खरगोश Myl2 के साथ स्लाइड्स की एक जोड़ी दाग।
- अगले दिन, 300 μL 0.1% PBST के साथ कुओं X3 धो लें। washes के बीच आरटी पर 5 मिनट सेते हैं। पिछले धोने के बाद अतिरिक्त समाधान aspirate।
- आईसीसी धुंधला बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी dilutions तैयार करें। सिफारिश dilutions के लिए सामग्री अनुभाग का संदर्भ लें। माध्यमिक एंटीबॉडी सेते आरटी पर 1 घंटे, प्रकाश से रक्षा की।
- निम्न माध्यमिक antibodie के साथ सभी स्लाइड दागएस: माउस एलेक्सा-555, चिकन एलेक्सा-488, और खरगोश एलेक्सा-647।
- 300 μL 0.1% PBST के साथ कुओं X3 धो लें। washes के बीच आरटी पर 5 मिनट सेते हैं। लाइट से बचाएँ।
- बढ़ते मीडिया एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड करने के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के 1.5 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त 2.4 μL जोड़ें। ध्यान से, 24 अच्छी तरह से थाली का अच्छी तरह से coverslip हटाने के अतिरिक्त समाधान निकालें, और बढ़ते मीडिया के साथ गिलास स्लाइड के लिए स्थानांतरण। धीरे अतिरिक्त मात्रा और हवा निकालने के लिए coverslip दबाएँ।
- प्राथमिकता दी नेल पॉलिश या प्लास्टिक की सीलेंट के साथ सील स्लाइड। स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड प्रकाश से सुरक्षित रखा होगा।
4. कार्डिएक Subtypes की पहचान confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग
नोट: इमेजिंग के लिए, एक confocal खुर्दबीन 405 पर वर्णक्रम का पता लगाने में सक्षम कम से कम 2 फ्लोरोसेंट डिटेक्टरों, 488, 555, और 639 एनएम तरंग दैर्ध्य के साथ सुसज्जित आदेश की पहचान करने के IPMS, Iams, और iVMs में आवश्यक है। imagई कोशिकाओं को एक योजना Apochromat 20X / 0.75 उद्देश्य या बेहतर इस्तेमाल करते हैं। , निर्माता की छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग ज़ूम छवियों स्कैनिंग 40X-तेल विसर्जन गुणवत्ता छवियों को प्राप्त कर सकते हैं।
- छवि पुस्तकालय: DAPI, एलेक्सा-488, एलेक्सा-555, और एलेक्सा-647 चैनलों के साथ 8 बिट चित्र लेने (सीएच।)। पिक्सेल 2 पर 6 रों, 1024 फ्रेम आकार, लाइन कदम के समय ध्यान केन्द्रित करना है, और 2 की औसत उच्च संकल्प छवियों के लिए पर्याप्त है।
- प्रत्येक स्लाइड के लिए, एक किनारे से शुरू और स्कैनिंग शुरू और α-actinin + sarcomere + कोशिकाओं के लिए लाल फ्लोरोसेंट चैनल (सीएच।) में नीचे (3 चित्रा का संदर्भ लें और उदाहरण के लिए चित्रा 5 ए)। Sarcomere स्त्रिअतिओन्स 555 एनएम तरंगदैर्ध्य में नेत्रहीन की पहचान करने के लिए आसान कर रहे हैं।
- एक बार एक α-actinin + sarcomere + सेल पहचान की गई है, हरे रंग की चर्चा करने के लिए स्विच। और नोट रखने के लिए अगर यह सकारात्मक है (आईपीएम)। कंप्यूटर के लिए स्विच दूर लाल 647 CH आकलन करने के लिए। (आई ए एम या Ivm)।
नोट: कोशिकाओं रहे हैं किα-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP + / एनपीपीए - / Myl2 - IPMS के रूप में नामित कर रहे हैं। GFP अभिव्यक्ति सेल (चित्रा -4 ए) भर में देखा जाएगा। - α-actinin (माउस Alexa555), Hcn4-GFP (चिकन-Alexa488) के साथ दाग स्लाइड, एनपीपीए (खरगोश-Alexa647), और DAPI। प्रकोष्ठों कि α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP हैं - / एनपीपीए + Iam कर रहे हैं। एनपीपीए धुंधला दिखाई देगी perinuclear और कबरा (चित्रा 4 बी)।
- α-actinin (माउस Alexa555) के साथ दाग स्लाइड, Hcn4-GFP (चिकन-Alexa488), Myl2 (खरगोश-Alexa647)। प्रकोष्ठों α-actinin के लिए सकारात्मक + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / Myl2 + iVMs हैं। Myl2 धुंधला sarcomere रेशा के साथ एक धारीदार प्रपत्र प्रदर्शन करेंगे। धुंधला और जेड विमान की गुणवत्ता में बदलाव के कारण, स्त्रिअतिओन्स हमेशा आसानी से दिखाई (चित्रा 4C) नहीं हो सकता।
- एक बार एक α-actinin + sarcomere + सेल पहचान की गई है, हरे रंग की चर्चा करने के लिए स्विच। और नोट रखने के लिए अगर यह सकारात्मक है (आईपीएम)। कंप्यूटर के लिए स्विच दूर लाल 647 CH आकलन करने के लिए। (आई ए एम या Ivm)।
नोट: आदेश में संभावित reprogrammed MEFs की वास्तविक संख्या का आकलन करने के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली के 2 कुओं प्रयोगात्मक कुओं के समानांतर में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और चढ़ाना के बाद एक दिन काटा जाता है। चढ़ाया कोशिकाओं की कुल संख्या तो दो कुओं के औसत से निर्धारित होता है। यह वास्तविक कुल कोशिकाओं चढ़ाया (aTotal) हो जाता है।
- sarcomere +
- दिखने में उचित α-actinin + / sarcomere + (सही पैनल चित्रा 3) और रिकॉर्ड (चित्रा 5 ब-आई) के लिए एक coverslip पर प्रत्येक कोशिका का निरीक्षण किया।
- चढ़ाया वास्तविक कुल कोशिकाओं (aTotal) द्वारा α-actinin प्रत्येक coverslip और विभाजन पर + / sarcomere + की कुल संख्या सारणीबद्ध (चित्रा 5 ब-iii)। उदाहरण के लिए, यदि aTotal = 12,500 कोशिकाओं, और 100 कोशिकाओं अल्फा-actinin थे + / sarcomere + फिर, चढ़ाया MEFs की 0.8% reprogrammed किया गया। एक औसतreprograming प्रयोग 1% α-actinin + / sarcomere + कोशिकाओं (चित्रा 5C) निकलेगा।
- उपप्रकार +
नोट: निम्न चरणों के लिए, एक प्रतिनिधि iCLM मात्रा का ठहराव कार्यप्रवाह के लिए 5 ब / सी चित्रा को देखें। संक्षेप में, प्रत्येक sarcomere + सेल के लिए, सारणीबद्ध अगर यह या तो उप प्रकार (चित्रा 5 ब-आई) के लिए अद्वितीय है। औसत sarcomere + कोशिकाओं x 100 (चित्रा 5 ब-मैं) पर उप प्रकार + कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करके% उपप्रकार (चित्रा 5 ब-III) की गणना। पूर्ण% उप प्रकार दक्षता (चित्रा 5 ब-चतुर्थ) की गणना करने के लिए, वरीयता प्राप्त x 100 (चित्रा 5 ब-II) कोशिकाओं की कुल संख्या से चित्रा से उपप्रकार + सेल नंबर विभाजित 5 ब-मैं।- Α-actinin के प्रत्येक + / sarcomere + कोशिकाओं के लिए, आकलन अगर वे कर रहे हैं + GFP, एनपीपीए +, या Myl2
- / Myl2 - -, actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / एनपीपीए +, और α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP + / एनपीपीए की कुल संख्या सारणीबद्ध - / Myl2 + कोशिकाओं (चित्रा 5 ब-आई)।
- प्रत्येक उप प्रकार के प्रतिशत की गणना करने के लिए, + / sarcomere + अच्छी तरह से है कि कोशिकाओं में α-actinin की कुल संख्या से उपप्रकार + कोशिकाओं की संख्या में विभाजित और 100 से गुणा GHMT उत्पन्न IPMS, Iams, और iVMs पर लगभग बराबर अनुपात (चित्रा 5 ब-iii)।
- उप प्रकार + कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करने के लिए, aTotal द्वारा प्रयोगात्मक हालत के लिए उप प्रकार + कोशिकाओं की कुल संख्या को विभाजित और 100 (चित्रा 5 ब-II) से गुणा करें। औसत पर IPMS कुल संक्रमित सेल की आबादी का 0.3%, Iams 0.3%, प्रतिनिधित्व करते हैं औरiVMs 0.25% (चित्रा 5 ब-iv)।
- Α-actinin के प्रत्येक + / sarcomere + कोशिकाओं के लिए, आकलन अगर वे कर रहे हैं + GFP, एनपीपीए +, या Myl2
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Representative Results
प्रधानमंत्री के विशेष संवाददाता माउस का लाभ उठाते हुए, हम एक मल्टीप्लेक्स immunostaining रणनीति के रूप में चित्र 1 में दर्शाया विविध अंतर्जात myocytes की पहचान करने के लिए विकसित की है। चित्रा 2 में दिखाया गया है reprogramming कदम के बाद, उप प्रकार विशेष के मुख्यमंत्रियों की प्रेरण यद्यपि एक कम दर पर के रूप में जल्दी दिन 4 21 के रूप में पता लगाया जा सकता है। 14 दिन तक, प्रयोग बंद कर दिया और sarcomere संगठन (चित्रा 3) और उप प्रकार विनिर्देश (चित्रा 4) के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। चित्रा 5 आईसीसी (चित्रा 5 एक पैनल) के लिए स्लाइड तैयार करने के कार्यप्रवाह, और iCLM उपप्रकार-विशिष्ट कोशिकाओं (चित्रा 5 पैनल बी / सी) की मात्रा का ठहराव का सार।
चित्रा 1: अंतर्जात के उपप्रकार विविधताCardiomyocytes। (एबी) Immunocytochemistry (आईसीसी) α-actinin के लिए Hcn4-GFP संवाददाता चूहों से नवजात आलिंद cardiomyocytes (sarcomere मार्कर, लाल), Hcn4-GFP (प्रधानमंत्री मार्कर, हरा), और एनपीपीए (आलिंद मार्कर, नारंगी) का धुंधला हो जाना। (सी) α-actinin के लिए Hcn4-GFP संवाददाता चूहों से नवजात वेंट्रिकुलर cardiomyocytes (sarcomere मार्कर, लाल), Hcn4-GFP (प्रधानमंत्री मार्कर, हरा), और Myl2 (वेंट्रिकुलर मार्कर, नारंगी) के Immunocytochemistry धुंधला हो जाना। DAPI (नीला): परमाणु धुंधला। स्केल सलाखों: 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1: संस्कृति मध्यम। कई GHMT प्रेरित reprogramming के दौरान इस्तेमाल माध्यमों की तैयारी के लिए टेबल सारांश। तालिका 2: बोने, अभिकर्मक और प्रेरण प्रारूप।(ए) चढ़ाना और कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए तालिका सारांश। (बी) बोने घनत्व और अनुमानित संक्रमण इकाइयों (या वायरल सतह पर तैरनेवाला) cardiomyocyte-तरह की कोशिकाओं में MEFs के लिए प्रेरित करने की जरूरत है। 
चित्रा 2: इस समय योजनाबद्ध Reprogramming। GHMT प्रेरित Hcn4-GFP MEFs की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। तीन प्रमुख चरणों चित्रित कर रहे हैं। 
चित्रा 3: sarcomere संगठन की डिग्री। α-actinin (sarcomere मार्कर, लाल) के लिए Hcn4-GFP MEFs 14 दिनों के बाद GHMT पारगमन की आईसीसी धुंधला sarcomere संगठन की एक विविध रेंज से पता चलता है। संगठन बढ़ जाती है की डिग्री से सही पैनल के लिए छोड़ दिया। प्रत्येक स्तर के प्रतिनिधि चित्रों (एन = 3)। स्केल पट्टी: 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 
चित्रा 4: उपप्रकार विशेष reprogrammed Cardiomyo cytes। (एसी) आईसीसी α-actinin (sarcomere मार्कर, लाल) के लिए GHMT-transduced Hcn4-GFP MEFs का धुंधला, Hcn4-GFP (प्रधानमंत्री मार्कर, हरा), एनपीपीए (आलिंद मार्कर, नारंगी), या Myl2 (वेंट्रिकुलर मार्कर, नारंगी) । DAPI (नीला): परमाणु धुंधला। स्केल सलाखों: 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 
चित्रा 5: छवि अधिग्रहण और विश्लेषण कार्यप्रवाह। छवि विश्लेषण के लिए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। पैनल एक सेल को sarcomere + और उप प्रकार विशिष्टता बताए की प्राथमिकता क्रम को दर्शाया गया है। पैनल बी (मैं-चतुर्थ) और सी औसत GHMT-iCLM प्रयोग से अपेक्षित परिणाम दिखा। प्रमुख बिंदु और सूत्रों हरे रंग में दिखाया गया है।ओम / फ़ाइलें / ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। iCLM मीडिया अंग वॉल्यूम (एमएल) अंतिम एकाग्रता DMEM 270 मीडियम 199 90 FBS 50 10% इंसुलिन Transferrin-सेलेनियम जी 2.5 0.50% सदस्य विटामिन समाधान 10 2% सदस्य एमिनो एसिड 20 4% गैर आवश्यक अमीनो एसिड 10 2% एंटीबायोटिक antimycotics 10 2% B-27 के पूरक 10 2% गर्मी निष्क्रिय हार्स सीरम 25 5% ना-पाइरूवेट 2.5 1.5 मिमी बेनी-ई मीडिया (पीई) अंग वॉल्यूम (एमएल) अंतिम एकाग्रता DMEM 450 FBS 50 10% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 5 1% puromycin 0.05 1 माइक्रोग्राम / एमएल Blasticidin 0.5 10 माइक्रोग्राम / एमएल Fibroblast मध्यम (एफबी) अंग0; वॉल्यूम (एमएल) अंतिम एकाग्रता DMEM 450 FBS 50 10% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 5 1% Glutamax 5 1% अभिकर्मक मध्यम (TxF) - छानने (0.45 माइक्रोन) अंग वॉल्यूम (एमएल) अंतिम एकाग्रता DMEM 450 FBS 50 10% Immunocytochemistry (आईसीसी) के बफर धुंधला अंग वॉल्यूम (एमएल) अंतिम एकाग्रता 1x पीबीएस 5 1x यूनिवर्सल अवरुद्ध बफर 5 ए) सेल बोने और अभिकर्मक प्लेटभर भोजन सतह क्षेत्र (2 सेमी) बोने घनत्व (कोशिकाओं) मध्यम विकास (एमएल) कुल डीएनए राशि transfect करने के लिए (माइक्रोग्राम) अभिकर्मक अभिकर्मक (μL) कम सीरम मीडिया (μL) 15 सेमी की थाली 152 1.00E + 06 20 25 75 600 10 सेमी की थाली 55 5.50E + 06 10 9 27 300 6 सेमी की थाली 21 2.20E + 06 4 3.5 10.5 105 अच्छी तरह से 6 / X1 9 1.00E + 06 2 2 6 60 12 अच्छी तरह से / X1 4 4.00E + 05 1 0.5 1.5 15 24 अच्छी तरह से / X1 2 2.00E + 05 0.5 0.3 0.9 9 48 अच्छी तरह से / X1 1 1.70E + 05 0.25 0.15 0.45 4.5 बी) तंतुकोशिका बोने और प्रेरण प्लेटभर भोजन Fibroblast बोने घनत्व (लाखों) ICLM के लिए लगभग संक्रमण इकाइयों 6 सेमी की थाली 0.22-0.33 5.00E + 7 (~ 5 एमएल) अच्छी तरह से 6 / X1 0.1-0.15 3.00E + 7 (~ 3 एमएल) 12 अच्छी तरह से / X1 0.04-0.06 1.30E + 7 (~ 1 एमएल) 24 अच्छी तरह से / X1 0.02-0.03 6.50E + 6 (~ 0.8 एमएल) 48 अच्छी तरह से 0.001-.015 3.00E + 6 (~ 0.4 एमएल)
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Discussion
वर्तमान अध्ययन हृदय प्रतिलेखन के रेट्रोवायरस की मध्यस्थता अभिव्यक्ति के माध्यम से हृदय उपप्रकार की एक विविध सेट में MEFs के रूपांतरण के लिए एक सीधा-reprogramming रणनीति प्रदान करता है Gata4, Mef2c, Tbx5, और Hand2 (GHMT) कारकों। एक प्रधानमंत्री के विशेष संवाददाता माउस के साथ संयोजन में एक मल्टीप्लेक्स immunostaining दृष्टिकोण का प्रयोग, हम एकल कोशिका संकल्प पर Iam, iVMs, और IPMS की पहचान करने में सक्षम हैं। इस तरह की एक परख इन विट्रो प्रणाली उप प्रकार विविधता और sarcomere विकास की दिशा में अलग-अलग प्रतिलेखन कारक के योगदान को अलग-थलग करने में सक्षम में एक प्रयोगात्मक के लिए अनुमति देता है। समानांतर में, इस नए प्रतिलेखन कारक या छोटे अणुओं है कि एक विशेष वंश के प्रति पूर्वाग्रह से iCLMs अंतर्दृष्टि ला सकता है। फिर भी, वहाँ इस परख के सफल समापन के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। नीचे, हम एक सामान्य iCLM प्रयोग में वायरल अनुमापांक, fibroblast गुणवत्ता, और इमेजिंग विश्लेषण के प्रभाव का पता।
हमारे अध्ययन में, हम है EMPलॉय ecotropic-रेट्रोवायरस E12.5 MEFs reprogram करने के लिए। हमने देखा है रेट्रोवायरल अनुमापांक सीधे कोशिकाओं की गुणवत्ता से संबंधित है। उच्च मार्ग संख्या (> 35) और गरीब संवर्धन तकनीक गंभीर रूप से रेट्रोवायरल कणों की गुणवत्ता को प्रभावित; इसलिए, वहाँ कई बातों को ध्यान में रख रहे हैं। बेनी-ई कोशिकाओं VSV जी छद्म वायरस की उपज नहीं है, और इस तरह ultracentrifugation या ठंड चक्र 24, 25 सामना करने में असमर्थ हैं। आदेश कोशिकाओं की दीर्घायु की रक्षा के लिए, यह एंटीबायोटिक चयन के साथ शेयर को बनाए रखने के लिए जरूरी है। हालांकि, वे वायरल उत्पादन के दौरान एंटीबायोटिक मुक्त मीडिया में बनाए रखा जाना चाहिए। हमारे अनुभव में, अभिकर्मक यहां इस्तेमाल किया अभिकर्मक कोशिकाओं में उच्चतम अभिकर्मक क्षमता प्रदान करता है। अन्य अभिकर्मक तरीकों का इस्तेमाल किया जा करने के लिए उत्पादित वायरल titers तुलना कर रहे हैं आवश्यक 26 है। फसल के लिए हालांकि वहाँ निर्माता द्वारा सिफारिशें की हैंवायरल सतह पर तैरनेवाला 48 घंटे अभिकर्मक के बाद, हमने देखा है कि दो 24-एच कटाई दौर उच्च reprogramming क्षमता उपज है, जबकि आम तौर पर उच्च अनुमापांक वायरल preps के साथ जुड़े विषाक्त प्रभाव से परहेज। इसके अलावा, हालांकि कई अध्ययनों वाणिज्यिक वायरल सतह पर तैरनेवाला concentrators 27 की व्यवहार्यता का पता चला है, हम ये हमारे नियमित प्रोटोकॉल में आदेश में एक उच्च throughput बनाए रखने के लिए नियोजित नहीं किया है।
उच्च अनुमापांक वायरल कॉकटेल के अलावा, fibroblast गुणवत्ता एक सफल reprogramming परख 28 के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है। यदि सही ढंग से समय पर, हौसले से पृथक MEFs जमी शेयरों की तुलना में अपनी उच्च क्षमता के कारण उपयोग किया जाना चाहिए। यह रेट्रोवायरस की प्रकृति से संबंधित हो सकता है के रूप में वे आदेश 29 को एकीकृत करने में एक उच्च-proliferative मेजबान की जरूरत है। इसके अतिरिक्त, MEF बोने घनत्व एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हम एक टेबल को शामिल किया है बोने घनत्व के साथ कार्यरतहमारे प्रयोगों में (तालिका 2)। इसके अलावा, MEFs passaging भी काफी reprogramming दक्षता में कमी होगी।
Immunocytochemistry (आईसीसी) sarcomere संगठन और उप प्रकार विनिर्देश के विश्लेषण के लिए हमारे मानक तकनीक है। एक प्रधानमंत्री-GFP संवाददाता माउस की मदद से, हम तीन प्रमुख हृदय उपप्रकार (AM, वीएम, और प्रधानमंत्री) का पता लगाने के लिए एक एंटीबॉडी पैनल बनाने में सक्षम थे। हालांकि, एंटीबॉडी प्रजातियों की उपलब्धता और एक मानक confocal खुर्दबीन सेट-अप पर 4-चैनलों की सीमा की कमी के कारण, उप प्रकार प्रति दो coverslips सभी तीन उपप्रकार के प्रसार यों की जरूरत है। एक coverslip α-actinin / GFP (Hcn4) के लिए दाग होगा / Myl2, और α-actinin / GFP के लिए एक (Hcn4) / एनपीपीए। हमारे पिछले प्रेक्षण के आधार पर कि sarcomeric संरचना सभी मुख्यमंत्रियों की एक आम लक्षण और उप प्रकार विनिर्देश 21 के लिए एक संभावित शर्त, हमारे विश्लेषण में पहला कदम sarcomere का निर्धारण किया जाता है +कोशिकाओं। फिर भी, अपने व्यक्तिपरक प्रकृति के कारण, sarcomere संगठन के स्तर पर स्थापित करने के लिए शायद इस परख का सबसे कठिन हिस्सा है; यह कई पर्यवेक्षक की quantifications के औसत से या कम्प्यूटेशनल सेल विभाजन सॉफ्टवेयर को विकसित करने की प्रक्रिया 30 को स्वचालित करने के द्वारा सीमित किया जा सकता है। संदर्भ का एक बिंदु के रूप में अंतर्जात कोशिकाओं का उपयोग करना, हम के लिए अच्छी तरह से संगठित sarcomere + एक सीमा की खोज की और iCLMs (चित्रा 3) स्कोर करने के लिए उपयोग किया जाता है। इन मानकों को देखते हुए, एक औसत प्रयोग 20 को जन्म देगा - 30% α-actinin + कोशिकाओं लेकिन केवल 1% अल्फा-actinin कर रहे हैं + / sarcomere +। 1% sarcomere + कोशिकाओं की, ~ 30% एनपीपीए +, Myl2 +, या Hcn4-+ GFP होगा।
यह देखते हुए कि cardiomyocytes संरचनात्मक रूप से जटिल हैं, जनसंख्या के आधार पर जीन अभिव्यक्ति (जैसे QRT- पीसीआर) या प्रवाह cytometry विश्लेषण जटिल रूपात्मक CH कब्जा नहीं कर सकतेAnges कि iCLM reprogramming दौरान होते हैं। इसके विपरीत, पैच clamping और कैल्शियम क्षणिक इमेजिंग अत्यधिक कड़े एकल कोशिका कार्यात्मक assays हैं, लेकिन विशेष कौशल और उपकरणों के इन प्रयोगों का संचालन करने के लिए आवश्यक हैं। इस प्रकार, वर्णित कार्यप्रणाली में यह काफी throughput समझौता किए बिना iCLM reprogramming के प्रमुख संरचनात्मक और कार्यात्मक मापदंडों का अध्ययन करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है कि अद्वितीय है।
प्रत्यक्ष reprogramming में हाल ही में कई प्रगति के बावजूद, बहुत काम बेहतर आणविक तंत्र है कि हृदय reprogramming, और अधिक विशेष रूप से, उप प्रकार विनिर्देश को नियंत्रित करता है समझने के लिए किया जाना बना रहता है। ये तंत्र नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए प्रत्यक्ष reprogramming अनुवाद करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाएगा। जैसे, इस अध्ययन में हम एक मंच सीधे sarcomere विकास, उप प्रकार विनिर्देश, और iCLM परिपक्वता की ओर योगदान का आकलन करने के लिए असतत मापदंडों का नियमन करने में सक्षम का वर्णन है। Moreoदेखें, इस प्रणाली के आगे एक उच्च throughput प्रारूप छोटे अणुओं या पुनर्जन्म का कार्डियोलॉजी में अगले कदम के लिए बाह्य matrixes के जटिल स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देने में काम करने के लिए विकसित किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
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