Introduction
Hjärtat är den första fungerande organ att utvecklas i embryot en, två. I samband med cirkulationssystemet levererar det syre, näringsämnen och en avfallsmekanismen under utveckling. Tre veckor efter befruktningen, slår det mänskliga hjärtat för första gången och dess lämplig reglering upprätthålls av kardiomyocyter (CMS). Den oåterkalleliga förlusten av dessa specialiserade celler är därför den grundläggande frågan bakom progressiv hjärtsvikt. Medan vissa organismer som zebrafisk och Xenopus har potential för hjärt förnyelse, är hjärtat vuxna däggdjur mer begränsad 3, 5, 6. Således, med tanke på den kritiska funktionen av hjärtat, är det inte förvånande att hjärtsjukdom är den vanligaste dödsorsaken i världen och står för 600.000 dödsfall i USA ensam 7. Derefore, cellbaserade terapier för att effektivt reparera eller byta ut den skadade hjärtmuskeln är av stort kliniskt intresse.
Seminal studie av Yamanaka och kollegor 8 visade att tvångs uttryck av fyra transkriptionsfaktorer är tillräcklig för att omvandla fullt differentierade fibroblastceller till pluripotenta stamceller. Emellertid har tumörframkallande förmåga alla pluripotenta stamceller strategier varit en kritisk angelägenhet i deras användning i terapeutiska syften. Detta motiverade det vetenskapliga området för att söka efter alternativa metoder för att transdifferentiera celler samtidigt som man undviker en pluripotent skede. Nyligen har flera grupper visat genomförbarheten av denna strategi genom att visa direkt omvandling av musfibroblaster till inducerade cardiomyocyte liknande celler (iCLMs) med ektopiskt uttryck av transkriptionsfaktorer GATA4, Mef2c, Tbx5, och senare, Hand2 (GMT och GHMT , respektive) 9, 10. furthermore, kan samma strategi utföras in vivo och i humana härledda vävnader 9, 11, 12. Nyligen genomförda studier har visat ytterligare faktorer eller signalvägar som kan moduleras för att ytterligare förbättra hjärt omprogrammering effektivitet 13, 14, 15. Sammantaget visar dessa studier visar potentialen för riktad transdifferentiering för regenerativa terapier. Men den låga effektiviteten i CM omprogrammering, de okända molekylära mekanismer, inkonsekvent reproducerbarhet på grund av metodskillnader 16, och den heterogena karaktären hos iCLMs stillas.
I syfte att direkt utvärdera iCLM heterogenitet utformade vi en diskret och robust single-cellanalys för identifiering av sarcomere utveckling och hjärt härstamning Specification-två nödvändiga egenskaper funktionella cardiomyocytes. Det finns åtminstone tre huvudsakliga typer av CM i hjärtat som definieras av deras placering och unika elektriska egenskaper: atrial (AM), kammar (VM) och pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. I en iscensatt kombination, de tillåter korrekt pumpning av blod. Under hjärtskada, kan en eller alla subtyper påverkas, och vilken typ av cellterapi skulle behöva lösas från fall till fall. För närvarande är de flesta strategier fokusera på den övergripande generationen kardiomyocyter, medan lite arbete som görs för att studera de molekylära mekanismer som reglerar subtyp specifikation.
Följande studie beskriver hur man korrekt kvantifiera välorganiserade sarkomerer och identifiera en mångfald av cardiomyocyte subtyper. Med hjälp av en pacemaker (PM) specifik reporter mus, vi kan tillämpa en immunocytochemical metod för att särskilja inducerad förmaksliknande myocyter (IAM), inducerade ventrikulära liknande myocyter (IVM) och inducerade PM-liknande myocyter (IPMS) 21. Baserat på våra observationer, endast celler som uppvisar sarcomere organisation är i stånd att spontant stryk. Denna unika omprogrammering plattform gör det möjligt att bedöma vilken roll av vissa parametrar i sarcomere organisation, subtyp specifikation, och effektiviteten av CM omprogrammering på encelliga upplösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer som involverar djur praxis har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid UT Southwestern Medical Center.
1. Isolering av Hcn4-GFP E12.5 Mouse embryonala fibroblast (MEF)
- Ställ in tids parningar mellan homozygota Hcn4-GFP män och CD-1 honor.
- Offra gravid kvinna vid E12.5 med koldioxid dödshjälp och efterföljande halsdislokation.
- Ta bort livmoderhornen med dissekera pincett som beskrivits tidigare 22, 23, och placera dem i en petriskål på is med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan Ca 2 + eller Mg 2 +.
- Utför alla efterföljande steg i vävnadsodling huva med hjälp av steril teknik.
- Ta bort embryon från livmodern och fostersäcken med hjälp av sax och dissekera pincett. Håll moderkakan bifogas för bättre hantering. pregnant CD-1 honor ger vanligtvis upphov till mellan 10 och 14 valpar.
- Med hjälp av dissekera pincett, ta de isolerade embryon och snabbt skölja dem två gånger i 70% (v / v) EtOH.
OBS: De tvättar bör vara snabb för att minimera celldöd. - Ta bort huvudet, armar och ben, svans, och inre organ, inklusive hjärtat från de isolerade embryon.
- Placera den återstående vävnaden i en 10-cm skål med 1 ml 1 x PBS och fint färs med en steril rakblad till cirka 1 mm 3 i storlek.
- Överföra malda vävnaden i ett 50 ml koniskt rör med PBS.
- Snurra vid 300 xg under 3 min. Försiktigt aspirera överskott PBS.
- Tillsätt 1 ml steril 0,25% trypsin-EDTA per embryo. Inkubera celler i ett 37 ° C vattenbad i 15 min. Blanda försiktigt röret var 4 min. Över nedbrytning av vävnaden kommer att avsevärt sänka utbytet.
- Vortex cellblandningen vid maximal hastighet (3200 rpm) under 4 s.
- Tillsätt 2 ml av fibroblast media per embryo och blanda. filter through en 100 | j, m cellfilter med användning av en pipett för att hjälpa cellerna genom silen. Se tabell 1 för utformningen av alla efterföljande medier.
- Snurra vid 300 xg under 4 minuter. Försiktigt aspirera supernatanten.
- Tillsätt 10 ml av färskt fibroblast media per 3 embryon och finfördela 6-10 gånger.
- Plate cellerna i en 15-cm vävnadsodlingsskål för varje 3 embryon framställda. Kultur över natten i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Efter inkubation över natten, byt media med färska 30 ml av media per platta. Placera celler tillbaka i inkubatorn över natt.
OBS: Kontrollera om Hcn4-GFP + cellerna kontamineras under ett fluorescerande mikroskop. Kulturen bör vara GFP - och bara blir GFP + vid omprogrammering. - Nästa dag, skörd celler med 3 ml av färskt förvärmda 0,25% trypsin-EDTA. Räkna och frysa celler. Typiskt frysa cellerna vid 3 x 10 6 celler per ml. Den förväntade Yield bör vara 3 x 10 6 celler per embryo.
2. Retrovirus Produktion och Omprogrammering
Varning: Följande protokoll kräver produktion och hantering av smittsamma retrovirus. Utför följande steg i en biosäkerhetsnivå 2 skåp under BSL-2 riktlinjer och steril teknik. Använd 10% blekmedel att avyttra alla material som utsätts för retrovirus.
- Retrovirus produktion och MEF beredning
OBSERVERA: Följande protokoll är för retroviral produktion i 6-brunnars plattor och MEF-infektion i 24-brunnsplattor. För andra format, se tabell 2. MEFs är pläterade på dag -1, så tidpunkten måste samordnas på lämpligt sätt för varje experiment (se avsnitt 2.3 och figur 2).- Upprätthålla Plat-E (PE) celler enligt tillverkarens rekommendationer. I korthet, kultur PE celler i DMEM kompletterat med 10% FBS, 1 mikrogram / ml puromycin, 10 | ig / ml blasticidin, penicillin och streptomycin. Passage celler 1: 4 varannan dag när kulturen når 70-90% konfluens.
- Dag -2: Dagen före transfektion, utsäde Plat-E-celler vid 1 x 10 6 celler / brunn på en 6-brunnsplatta i transfektion media. Celler bör vara 70-80% sammanflytande vid tiden för transfektion.
- Transfektion med användning av ett kommersiellt transfektion agent.
OBS: De kommersiella reagens bör vara vid rumstemperatur (RT) innan transfektion. För DNA-transfektion, lägga till varje retrovirala plasmid-DNA individuellt (G, H, M och T) för att bilda en GHMT cocktail 9.- Dag 1: I en 15 ml koniskt polystyrenrör, blanda 60 mikroliter av minskade serum media med 6 mikroliter av transfektion reagens per reaktion för en 6-brunnar format. Inkubera blandningen under fem minuter vid rumstemperatur.
OBS: Eftersom transfektionsreagens användas här binder till plast, endd direkt till den minskade serum media för att undvika minskning av transfektion effektivitet. - Lägg totalt 2 pg GHMT cocktail per reaktion och knacka försiktigt för att blanda det. Inte virvel. Inkubera reaktionen under 15 min vid RT.
- Tillsätt blandningen från steg 2.2.3 till PE celler i ett droppvis sätt.
- Inkubera de transfekterade Plat-E-celler över natt i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Registrera tiden för transfektion.
- Dag 1: I en 15 ml koniskt polystyrenrör, blanda 60 mikroliter av minskade serum media med 6 mikroliter av transfektion reagens per reaktion för en 6-brunnar format. Inkubera blandningen under fem minuter vid rumstemperatur.
- Sådd av Hcn4-GFP mus embryonala fibroblaster.
- 1 timme innan plätering MEF, förbereda en 24-brunnar för immunocytokemi.
- Lägg till en 12 mm fibronektin täck per brunn.
- Coat brunnar med 300 mikroliter av bovint kollagen-lösning (t.ex. surecoat) och inkubera i ett 37 ° C inkubator under 1 h.
- Aspirera beläggningslösning omedelbart före MEF plätering.
- Tina en fryst ampull av Hcn4-GFP MEF och tvätta x1 med förvärmda fibroblast medier vid 500 xg under 5 min.
- Bestäm cellviabiliteten med hjälp av trypanblått uteslutning eller liknande färgämnen. Beräkna antalet viabla celler per ml odling med användning av följande formel:
% levande celler = [1,00 - (Antal blå celler / Totala antalet celler)] x 100- Beräkna totala antalet livskraftiga celler med användning av följande formel:
Livsdugliga celler =% levande celler x utspädningsfaktor x 10.000 x totala volymen av cellsuspension
- Beräkna totala antalet livskraftiga celler med användning av följande formel:
- Seed 3 x 10 4 celler per brunn på en 24-brunnsplatta med tidigare beredd bovint kollagenlösning-fibronektin täckglas.
- 1 timme innan plätering MEF, förbereda en 24-brunnar för immunocytokemi.
- Överföring och omprogrammering av MEF
OBS: Enligt tillverkarens anvisningar, gott skick Plat-E celler producerar en genomsnittlig titer av 1 x 10 7 infektion enheter / ml. Även om titern inte mäts direkt för varje experiment, är en GFP kontroll alltid ingår som ett surrogat för infektionseffektivitet.Hög GFP uttryck och intensitet (GFP +> 95%) korrelerar vanligtvis med framgångsrika GHMT-medierad generation iCLMs.- Dag 0: 24 h post-transfektion, filtrera PE retrovirala medium genom ett 0,45 ^ m-porstorlek ytaktivt fritt cellulosaacetatfilter och överför till en 15 ml koniska rör. Lägg polybren till en slutlig koncentration av 8 | ig / ml. Noggrant fylla celler med 2 ml färskt transfektion medium.
OBS: Celler lätt lossna från plattan om media förändras alltför snabbt. - Aspirera mediet av odlade MEF och lägga till nyligen uppsamlat retroviral medium; det bör ge 1,7 ml av media per brunn i en 6-brunnsplatta. Lägga ~ 800 mikroliter per brunn av en 24-brunnars platta. Återgå MEF plattan till inkubatorn och inkubera över natten.
- Dag 1: Upprepa steg 2.4.1 och 2.4.2. Kasta celler efter 2: a virus samling. Återgå infekterade MEF till inkubatorn och låt dem vila över natten.
- Dag 2: 48 timmar efter induktion, aspirera cellkonditionerat media och tvätta x1 med 1x PBS. Tillsätt 500 mikroliter förvärmas iCLM media per brunn i en platta med 24 brunnar.
- Byt iCLM media varje 2 - 3 dagar. Scen 14 dagar efter viral induktion för immuncytokemi (ICC) analys av hjärt omprogrammering.
- Dag 0: 24 h post-transfektion, filtrera PE retrovirala medium genom ett 0,45 ^ m-porstorlek ytaktivt fritt cellulosaacetatfilter och överför till en 15 ml koniska rör. Lägg polybren till en slutlig koncentration av 8 | ig / ml. Noggrant fylla celler med 2 ml färskt transfektion medium.
3. Immunfärgning av omprogrammerade MEF
- 14-dagar efter induktion, noggrant suga ut mediet.
- Skölj varje brunn med 300 mikroliter av iskall 1x PBS. Aspirera överflödig lösning.
- Fixera cellerna med 250 mikroliter av 4% paraformaldehyd (PFA) lösning per brunn i en 24 brunnars platta. Inkubera 15 min vid RT.
OBS: Fast celler kan lagras i PBS vid 4 ° C under 1 - 2 veckor före färgning. - Permeabilize celler genom tvättning brunnar x3 med 300 mikroliter 0,1% PBS-TritonX 100 (PBST). Inkubera 5 minuter vid RT mellan tvättar. Aspirera överflödig lösning efter den sista tvättningen.
- Block för 10min vid RT med 1x Universal Block Buffer på 300 mikroliter / brunn.
- Förbered (ICC) färgning buffert: Tillsätt 1: 1 av 1 x PBS och 1x Universal blockerande buffert. Späd primära antikroppar i ICC färgningsbuffert och inkubera antikroppar över natten vid 4 ° C. Se till material sektionen för rekommenderade späd.
- Färga ett par bilder med mus α-actinin, kyckling αGFP och kanin NPPA för integrerat växtskydd och iam identifiering.
- Färga ett par bilder med mus α-actinin, kyckling αGFP och kanin Myl2 IPM och IVM identifiering.
- Följande dag, tvätta brunnar x3 med 300 mikroliter 0,1% PBST. Inkubera 5 minuter vid RT mellan tvättar. Aspirera överflödig lösning efter den sista tvättningen.
- Förbered sekundär antikropp utspädningar i ICC färgning buffert. Se till material sektionen för rekommenderade späd. Inkubera sekundära antikroppar 1 timme vid RT, skyddad från ljus.
- Färgar alla bilder med följande sekundära antibodies: mus Alexa-555, kyckling Alexa-488, och kanin Alexa-647.
- Tvätta brunnar x3 med 300 mikroliter 0,1% PBST. Inkubera 5 minuter vid RT mellan tvättar. Skyddas från ljus.
- Lägga 2,4 mikroliter av monterings media innehållande 1,5 | ig / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) till en glasmikroskopskiva. Försiktigt bort täck från brunn i 24-brunnar, ta bort överskottslösning, och överföra till glasskiva med monterings media. Tryck försiktigt täck att avlägsna överskottsvolym och luft.
- Seal glider med dras nagellack eller plast tätningsmedel. Store monterade diabilder vid 4 ° C skyddade från ljus.
4. Identifiering av hjärt subtyper Använda konfokalmikroskopi
OBS: För avbildning, en konfokalmikroskop utrustad med minst 2 fluorescerande detektorer kan spektral detektion vid 405, 488, 555 och 639 nm våglängder är nödvändig för att identifiera IPMS, Iams, och IVMS. image celler med användning av en plan-Apochromat 20X / 0.75 objektiv eller bättre. Använda tillverkarens bildanalysmjukvara, skanna zoom bilder kan uppnå 40X olje nedsänkning bildkvalitet.
- Bildbibliotek: ta 8-bitarsbilder med DAPI, Alexa-488, Alexa-555, och Alexa-647 kanaler (CH.). Pixel uppehållstid av 6 s, 1024 ramstorlek, linje steg vid två, och utjämning av två är tillräckligt för högupplösta bilder.
- För varje bild, startar från en kant och börja skanna upp och ner i den röda fluorescerande kanal (CH.) För α-actinin + sarcomere + celler (se figur 3 och figur 5A för exempel). Sarcomere strimmor är lättare att identifiera visuellt i 555 nm våglängd.
- När har identifierat ett α-actinin + sarcomere + cell, byta till den gröna ch. och hålla notera om det är positivt (IPM). Växla till datorn för att bedöma långt röda 647 ch. (IAM eller IVM).
OBS: Celler som ärα-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - betecknas som IPMS. GFP-uttryck kommer att ses i hela cellen (figur 4A). - Stain glider med α-actinin (mus-Alexa555), Hcn4-GFP (kyckling-Alexa488), NPPA (kanin-Alexa647) och DAPI. Celler som är α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / NPPA + är IAM. NPPA färgning visas perinukleära och punktat (Figur 4B).
- Stain glider med α-actinin (mus-Alexa555), Hcn4-GFP (kyckling-Alexa488), Myl2 (kanin-Alexa647). Celler positiva för α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / Myl2 + är IVMS. Myl2 färgning kommer att uppvisa ett strimmigt form tillsammans sarcomere filament. På grund av variationer i kvaliteten på färgningen och Z-planet, kan strimmor inte alltid vara väl synlig (Figur 4C).
- När har identifierat ett α-actinin + sarcomere + cell, byta till den gröna ch. och hålla notera om det är positivt (IPM). Växla till datorn för att bedöma långt röda 647 ch. (IAM eller IVM).
OBS: För att kunna bedöma det faktiska antalet potentiellt omprogrammerade MEF är 2 brunnar i en 24-brunnar ympades parallellt med de experimentella brunnarna och skördas en dag efter plätering. Det totala antalet celler utstrukna bestäms sedan genom medelvärdesbildning av två brunnar. Detta blir den faktiska totala celler pläterade (aTotal).
- sarcomere +
- Inspektera varje cell på en täck för korrekt α-actinin + / sarcomere + (höger paneler Figur 3) och spela in (figur 5B-i).
- Tabulera det totala antalet α-actinin + / sarcomere + på varje täckglas och dividera med den verkliga totala celler pläterade (aTotal) (figur 5B-iii). Till exempel om aTotal = 12.500 celler och 100-celler a-actinin + / sarcomere + då, 0,8% av de pläterade MEFs var omprogrammeras. Ett genomsnittreprograming experiment kommer att ge ett% a-actinin + / sarcomere + celler (Figur 5C).
- subtyp +
OBS: För följande steg, se figur 5B / C för en representativ iCLM kvantifiering arbetsflöde. I korthet, för varje sarkomeren + cell, tabu om det är unikt för antingen subtyp (figur 5B-i). Beräkna% Undertyp (figur 5B-iii) genom att dividera antalet subtyp + celler över den genomsnittliga sarcomere + celler x 100 (figur 5B-i). Att beräkna den absoluta% subtyp effektivitet (figur 5B-iv), dela upp subtyp + cellantalet från figur 5B-i med det totala antalet celler sådda x 100 (figur 5B-ii).- För vardera av α-actinin + / sarcomere + -celler, bedöma om de är GFP +, NPPA +, eller Myl2
- Tabulate totala antalet α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / NPPA +, och α-actinin + / sarcomere + / Hnc4-GFP - / Myl2 + celler (figur 5B-I).
- För att beräkna den procentuella andelen av varje subtyp, dividera antalet av subtyp + celler med det totala antalet α-actinin + / sarcomere + celler i den brunn och multiplicera med 100. GHMT genererar IPMS, Iams, och IVMS på ungefär lika förhållanden (Figur 5B-iii).
- Att beräkna det absoluta antalet av subtyp + celler, dividera det totala antalet av subtyp + celler för det experimentella tillståndet genom aTotal och multiplicera med 100 (figur 5B-ii). I genomsnitt IPMS representerar 0,3% av den totala infekterade cellpopulationen, Iams 0,3%, ochIVMS 0,25% (figur 5B-iv).
- För vardera av α-actinin + / sarcomere + -celler, bedöma om de är GFP +, NPPA +, eller Myl2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med utnyttjande av PM-specifika reporter mus, utvecklade vi en multiplex immunfärgning strategi för att identifiera olika endogena myocyter som visas i figur 1. Efter de omprogrammeringar stegen som visas i figur 2, kan induktion av subtyp specifika CM upptäckas så tidigt som dag 4 21, om än på en låg ränta. På dagen 14, kan försöket stoppas och utvärderas för sarcomere organisation (Figur 3) och subtyp-specifikation (Figur 4). Figur 5 sammanfattar arbetsflödet för glaspreparering för ICC (figur 5 Panel A), och kvantifiering av iCLM subtypspecifika celler (Figur 5 Panel B / C).
Figur 1: Undertyp mångfald av endogenKardiomyocyter. (AB) Immuncytokemi (ICC) färgning av neonatala förmaks kardiomyocyter från Hcn4-GFP reporter möss för α-actinin (sarcomere markör, röd), Hcn4-GFP (PM markör, grön), och NPPA (förmaks markör, orange). (C) Immuncytokemi färgning av neonatala ventrikulära kardiomyocyter från Hcn4-GFP reporter möss för α-actinin (sarcomere markör, röd), Hcn4-GFP (PM markör, grön), och Myl2 (kammar markör, orange). DAPI (blå): nukleär färgning. Skalstrecken: 20 ^ M. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: odlingsmedium. översiktstabell för framställning av flera medier som används under GHMT-inducerad omprogrammering. Tabell 2: sådd, transfektion och induktions format.(A) Sammanfattande tabell för plätering och transfektion av celler. (B) såddtäthet och ungefärlig infektion enheter (eller viral supernatant) som krävs för att framkalla MEFs till cardiomyocyte liknande celler. 
Figur 2: Omprogrammering Tidslinje Schematisk. Schematisk bild av GHMT-inducerade Hcn4-GFP MEF. De tre viktigaste stegen avbildas. 
Figur 3: Grad av sarcomere organisationen. ICC-färgning av Hcn4-GFP MEF 14 dagar efter GHMT överföring för α-actinin (sarcomere markör, röd) visar ett varierat utbud av sarcomere organisation. Organisationsgraden ökar från vänster till höger sida. Representativa bilder på varje nivå (n = 3). Skala bar: 20 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 4: Subtype specifika omprogrammeras Cardiomyo cyter. (AC) ICC-färgning av GHMT-transducerade Hcn4-GFP MEF för α-actinin (sarcomere markör, röd), Hcn4-GFP (PM markör, grönt), NPPA (förmaks markör, orange), eller Myl2 (kammar markör, orange) . DAPI (blå): nukleär färgning. Skalstrecken: 20 ^ M. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 5: Bild och analys arbetsflöde. Schematisk representation för bildanalys. Panel A visar prioritetsordning tilldela sarcomere + och subtyp-specificitet till en cell. Panel B (i-iv) och C visar de förväntade resultaten från ett genomsnitts GHMT-iCLM experimentet. Huvudpunkter och formler visas i grönt.om / filer / ftp_upload / 55.456 / 55456fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra. iCLM media Komponent Volym (ml) slutkoncentration DMEM 270 Medium 199 90 FBS 50 10% Insulin-Transferrin-Selenium G 2,5 0,50% MEM vitaminlösning 10 2% MEM aminosyror 20 4% Icke-essentiella aminosyror 10 2% Antibiotika Antimykotika 10 2% B-27 tillägg 10 2% Värmeinaktiverat hästserum 25 5% Na-pyruvat 2,5 1,5 mM Plat-E-media (PE) Komponent Volym (ml) slutkoncentration DMEM 450 FBS 50 10% Penicillin / streptomycin 5 1% puromycin 0,05 1 | j, g / ml blasticidin 0,5 10 | j, g / ml Fibroblast medium (FB) Komponent0; Volym (ml) slutkoncentration DMEM 450 FBS 50 10% Penicillin / streptomycin 5 1% glutamax 5 1% Transfektion medium (TxF) - Filtrerad (0,45 ^ m) Komponent Volym (ml) slutkoncentration DMEM 450 FBS 50 10% Immunocytokemi (ICC) färgning buffert Komponent Volym (ml) slutkoncentration 1x PBS 5 1x Universal blockeringsbuffert 5 A) cellsådd och transfektion Plåt / Dish Ytarea (cm 2) Såddtäthet (celler) Tillväxtmedium (ml) Total DNA belopp för att transfektera (^ g) Transfektionsreagens (il) Minskad Serum Media (pl) 15 cm platta 152 1.00E + 06 20 25 75 600 10 cm platta 55 5.50E + 06 10 9 27 300 6 cm platta 21 2.20E + 06 4 3,5 10,5 105 6 väl / x1 9 1.00E + 06 2 2 6 60 12 brunn / x1 4 4.00E + 05 1 0,5 1,5 15 24 brunnar / x1 2 2,00E + 05 0,5 0,3 0,9 9 48 brunn / x1 1 1.70E + 05 0,25 0,15 0,45 4,5 B) Fibroblast sådd och induktion Plåt / Dish Fibroblast såddtäthet (miljoner) Ungefärliga infektion enheter för iCLM 6 cm platta 0,22-0,33 5,00E + 7 (~ 5 ml) 6 väl / x1 0,1-0,15 3,00E + 7 (~ 3 ml) 12 brunn / x1 0,04 till 0,06 1.30E + 7 (~ 1 ml) 24 brunnar / x1 0,02-0,03 6.50E + 6 (~ 0,8 ml) 48 brunn 0,001-0,015 3,00E + 6 (~ 0,4 ml)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den aktuella studien ger en direkt omprogrammering strategi för omvandling av MEF i en mångfald av hjärt subtyper via retrovirus-medierad uttryck av hjärttranskriptionsfaktorer GATA4, Mef2c, Tbx5 och Hand2 (GHMT). Med hjälp av en multiplex immunfärgning metod i kombination med ett PM-specifik reporter mus, vi kan identifiera IAM, IVMS och IPMS på en enda cell upplösning. En sådan analys möjliggör en experimentell in vitro-system kan isolera bidrag enskilda transkriptionsfaktorer mot subtyp mångfald och sarcomere utveckling. Parallellt kan detta få insikt till nya transkriptionsfaktorer eller små molekyler som förspänner iCLMs mot en viss härstamning. Det finns dock flera viktiga steg för ett framgångsrikt slutförande av denna analys. Nedan vi ta itu med effekterna av virustiter, fibroblast kvalitet, och bildanalys i en allmän iCLM experiment.
I vår studie vi EmpLoy ekotropa-retrovirus att programmera E12.5 MEFs. Vi märkte retroviral titer är direkt relaterad till kvaliteten på cellerna. Hög passagenummer (> 35) och fattiga odlingstekniker allvarligt påverka kvaliteten på de retrovirala partiklarna; Därför finns det flera faktorer att tänka på. Plat-E-celler producerar inte VSV-G pseudotypade virus, och är således inte att motstå ultracentrifugering eller frysning cykler 24, 25. För att bevara livslängden för cellerna, är det absolut nödvändigt att bibehålla lager med antibiotikaselektion. Emellertid bör de bevaras i antibiotikafritt medium under viral produktion. I vår erfarenhet, den transfektionsreagens användas här ger de högsta transfektionseffektiviteten i celler. Om andra transfektion metoder ska användas, att jämföra virustitrar som produceras är väsentlig 26. Även om det finns rekommendationer av tillverkaren för att skördavirusvätskan 48 timmar efter transfektion, observerade vi att två 24-h skörd rundor ger högre omprogrammering effektivitet samtidigt som man undviker toxiska effekter som vanligtvis förknippas med högre titer virala preps. Dessutom, även om flera studier har visat möjligheten att kommersiella virala supernatanten anriknings 27, vi har inte anställda dessa i vår vanliga protokoll för att upprätthålla en högre genomströmning.
Förutom hög titer virala drinkar, är fibroblast kvalitet av avgörande betydelse för en framgångsrik omprogrammering analys 28. Om tidsinställda korrekt, bör nyisolerade MEF utnyttjas på grund av deras högre effektivitet jämfört med frysta lager. Detta kan vara relaterat till den typ av retrovirus, eftersom de behöver en i hög grad-proliferativ värd för att integrera 29. Dessutom spelar MEF såddtäthet en avgörande roll. Vi har inkluderat en tabell med seedning densitet anställdai våra experiment (tabell 2). Dessutom passage av MEF kommer också att avsevärt minska omprogrammering effektivitet.
Immunocytokemi (ICC) är vår standardteknik för analys av sarcomere organisation och subtyp specifikation. Med hjälp av en PM-GFP reporter mus, kunde vi bilda en antikropp panel för detektion av tre stora hjärt subtyper (AM, VM, och PM). Men på grund av begränsningar av antikroppsarter tillgänglighet och begränsning av 4-kanaler på en vanlig konfokalmikroskop set-up, två täck per subtyp som behövs för att kvantifiera förekomsten av alla tre subtyper. En täck färgar för α-actinin / GFP (Hcn4) / Myl2, och en för α-actinin / GFP (Hcn4) / NPPA. Baserat på våra tidigare observationer att sarcomeric struktur är en vanlig egenskap hos alla CMS och en potentiell förutsättning för subtyp specifikation 21, det första steget i vår analys är att bestämma sarcomere +celler. Men på grund av sin subjektiva karaktär, fastställa nivån på sarcomere organisation är kanske den svåraste delen av denna analys; detta kan begränsas genom att ta medelvärdet flera Observers kvantifieringar eller genom att utveckla beräknings cell segmente programvara för att automatisera processen 30. Använda endogena celler som en referenspunkt, upptäckte vi en tröskel för välorganiserad sarcomere + och utnyttjas som att göra mål iCLMs (Figur 3). Med tanke på dessa parametrar, kommer ett genomsnittligt experiment ger upphov till 20-30% a-actinin + celler men endast 1% är a-actinin + / sarcomere +. Av de 1% sarcomere + celler, ~ 30% kommer att vara NPPA +, Myl2 +, eller Hcn4-GFP +.
Med tanke på att kardiomyocyter är strukturellt komplexa, populationsbaserad genuttryck (t.ex. QRT-PCR) eller flödescytometri analyser kan inte fånga de intrikata morfologiska lmAnges som inträffar under iCLM omprogrammering. Däremot patch fastspänning och kalcium övergående avbildning är mycket stränga encelliga funktionella analyser, men specialiserade kompetens och utrustning som krävs för att genomföra dessa experiment. Således är den metod som beskrivs unikt genom att det ger en enkel metod för att studera viktiga strukturella och funktionella parametrar iCLM omprogrammering utan att signifikant äventyra genomströmning.
Trots de många senaste framstegen inom direkt omprogrammering, återstår mycket arbete att göra för att bättre förstå de molekylära mekanismer som reglerar hjärt omprogrammering, och mer specifikt, subtyp specifikation. Dessa mekanismer blir särskilt viktigt att översätta direkt omprogrammering för kliniska tillämpningar. Som sådan, i denna studie beskriver vi en plattform som kan direkt modulera diskreta parametrar för att bedöma bidrag till sarcomere utveckling, subtyp specifikation, och iCLM mognad. Moreover, kan detta system vidareutvecklas för att arbeta i en hög genomströmning format möjliggör komplexa screening av små molekyler eller extracellulära matriser för nästa steg i regenerativ kardiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L.
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
