Introduction
心臓は胚1、2に開発した最初の機能的器官です。循環器系に関連して、開発中に、酸素、栄養素、および廃棄物処理機構に供給する。三週間受精後、人間の心は初めて打つとその適切な規制は、心筋細胞（のCM）によって維持されています。これらの特殊化した細胞の不可逆的損失は、したがって、進行性の心不全の根底にある基本的な問題です。このようなゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルのようないくつかの生物は、心臓の再生の可能性を有しているが、大人の哺乳類の心臓は3、5、6、より限定されています。このように、心の重要な機能を考えると、心臓病は米国だけで60万人が死亡7を占め、世界における死亡の主な原因であることは驚くべきではありません。ザrefore、効率的に負傷した心筋を修理または交換するために、細胞ベースの治療は臨床上非常に興味深いものです。
山中ら8の精液の研究は、4つの転写因子の強制発現は、多能性幹細胞に完全に分化した線維芽細胞に変換するのに十分であることを示しました。しかし、すべての多能性幹細胞戦略の腫瘍形成能力は、治療目的のためのそれらの使用における重大な関心事となっています。これは、多能性段階を回避しながら細胞を分化転換するための代替方法を検索するための科学的なフィールドをやる気。最近、いくつかのグループは、転写の異所性発現は、GATA4、MEF2C、TBX5、および後に、Hand2（GMTとGHMT因子を用いて誘導心筋細胞様細胞（iCLMs）にマウス線維芽細胞の直接変換を表示することにより、この戦略の実現可能性を示していますそれぞれ）9,10。 Furthermore、同じ戦略は、 インビボおよびヒト由来の組織9、11、12で行うことができます。最近の研究では、追加の因子またはさらなる心臓再プログラミング効率13、14、15を改善するために調節することができるシグナル伝達経路を強調しています。まとめると、これらの研究は、再生治療のために向かう分化転換の可能性を示します。しかし、方法論的差異16にCMの再プログラミング、未知の分子機構、一貫性のない再現性の低効率、およびiCLMsの不均一な性質は、アドレス指定されないままです。
直接iCLM不均一性を評価するために、我々は、サルコメアの開発および心臓系統specificatioの同定のために離散的で堅牢な単一細胞アッセイを設計しましたn-2の機能的心筋細胞の必要な特性。それらの場所でユニークな電気的特性によって定義されたCMの少なくとも三つの主要なタイプは、心臓である：心房（AM）は、心室（VM）及びペースメーカー（PM）17、18、19、20。オーケストレーションの組み合わせで、それらは、血液の適切なポンピングを可能にします。心臓損傷の間、一つまたはすべてのサブタイプが影響を受ける可能性があり、および細胞治療のタイプは、ケースバイケースで対処する必要があります。少し作業は、サブタイプの仕様を調節する分子メカニズムを研究するために行われている間、現在、ほとんどの戦略は、心筋細胞の全体的な世代に焦点を当てています。
以下の研究は、適切によく組織サルコメアを定量化し、心筋細胞のサブタイプの多様なセットを識別する方法について詳しく説明します。ペースメーカー（PM）特異的レポーターマウスを用いて、Iを適用することができます誘導された心房のような筋細胞（IAM）、誘導された心室のような筋細胞（IVM）、および誘導されたPM-様筋細胞（IPMS）21を区別するためにmmunocytochemicalアプローチ。我々の観察に基づいて、サルコメア組織を示す細胞のみが自発的な拍動することが可能です。このユニークな再プログラミングプラットフォームは役割を評価することができます サルコメア組織、サブタイプの仕様、および単一セルの解像度でCMの再プログラミングの効率の特定のパラメータの。
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Protocol
動物プラクティスを含む全ての実験手順は、UTサウスウェスタン医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
HCN4-GFP E12.5マウス胚線維芽細胞（MEFの）の1の単離
- ホモ接合HCN4-GFPの雄とCD-1雌との間の時限交配を設定します。
- 二酸化炭素安楽死とその後の頸椎脱臼によりE12.5で妊娠中の女性を生け贄に捧げます。
- 2+、以前22記載されているように鉗子を解剖して子宮角を取り除き23、およびCa 2+又はMgなしの1xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で氷上でペトリ皿に入れます。
- 無菌技術を用いて組織培養フード内のすべての後続の手順を実行します。
- はさみを使用して鉗子を解剖SAC子宮と羊膜から胚を削除します。よりよい処理のために取り付けられた胎盤を保管してください。プレグナNT CD-1雌は一般的に10〜14の仔を出産します。
- 鉗子を用いて解剖、単離された胚を取り出し、すぐに70％（v / v）のエタノールで二回それをすすぎます。
注：洗浄は、細胞死を最小にするために高速である必要があります。 - 孤立した胚からの心臓を含む、頭部、四肢、尾、と内臓を取り除きます。
- 約1mm 3サイズのに滅菌カミソリの刃を使用して、1×PBSと細かくミンチ1mLの10 cmディッシュに残っている組織を置きます。
- PBSで50 mLコニカルチューブにみじん切りの組織を転送します。
- 3分間300×gでスピン。慎重に過剰のPBSを吸引します。
- 胚あたりの滅菌0.25％トリプシンEDTAの1 mLを加え。 15分間37℃の水浴中で細胞をインキュベートします。優しくチューブごとに4分を混ぜます。組織の過消化は大幅に歩留まりを低下させるであろう。
- 4秒、最高速度（3,200 rpm）で渦細胞混合物。
- 胚あたりの線維芽細胞の培地2 mLを加え、混合します。フィルタートンストレーナーを通して細胞を補助するために、ピペットを用いて100μmの細胞ストレーナーhrough。後続のすべての媒体の製剤については、 表1を参照してください。
- 4分間300×gでスピン。注意深く上清を吸引。
- 3胚あたりの新鮮な線維芽細胞培地を10mLを加え、6-10回粉砕します。
- 調製したすべての3胚1 15 cmの組織培養皿において細胞をプレート。 37°C、5％CO 2インキュベーター内で培養一晩。
- 一晩のインキュベーションの後、プレート当たりメディアの新鮮な30mLでメディアを交換。一晩バックインキュベーターにセルを配置します。
注：蛍光顕微鏡下でHCN4-GFP +細胞の混入を確認してください。文化はGFPであるべき-とのみ再プログラミングの際にGFP +になります。 - 翌日、新鮮予め温めておいた0.25％トリプシンEDTA 3mlで収穫細胞。細胞を計数し、凍結。一般的に、ミリリットル当たり3×10 6個の細胞で細胞を凍結します。予想yieldは胚あたり3×10 6個の細胞でなければなりません。
2.レトロウイルス生産とリプログラミング
注意：以下のプロトコルは、感染性レトロウイルスの生産と処理が必要です。 BSL-2ガイドラインおよび滅菌技術の下でバイオセーフティレベル2キャビネットには、次の手順を実行します。レトロウイルスに暴露され、すべての材料を処分するために10％の漂白剤を使用してください。
- レトロウイルスの生産とMEFの準備
注：以下のプロトコルは、24ウェルプレートにおけるレトロウイルス6ウェルプレートの生産とMEFの感染症のためのものです。他のフォーマットについては、 表2を参照してください。 MEFのは、1日目でプレーティングされているので、タイミングが（セクション2.3と図2を参照してください）各実験のために適切に調整される必要があります。- ぷらっと-E（PE）製造者の推奨に従って細胞を維持します。簡潔には、DMEMで培養PE細胞を、10％FBS、を1μg/ mLのpuromyを補充しますCIN、を10μg/ mLのブラストサイジン、ペニシリン、およびストレプトマイシン。継代細胞1：4の文化は百分の70から90までの密集度に達するごとに2日。
- 日-2：トランスフェクションの前日に、トランスフェクション培地中で1×10で6個の細胞/ウェルで6ウェルプレート上のPlat-E細胞を播種します。細胞は、トランスフェクション時の百分の70から80までのコンフルエントであるべきです。
- 商業トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクション。
注：市販の試薬は、トランスフェクション前に室温（RT）であるべきです。 DNAトランスフェクションのために、GHMTカクテル9を形成する個々のレトロウイルスプラスミドDNA（G、H、M、およびT）を加えます。- 1日目は：15 mLコニカルポリスチレンチューブでは、6ウェルプレートフォーマットのための反応当たりのトランスフェクション試薬の6μLで還元血清培地の60μLを混ぜます。室温で5分間混合物をインキュベートします。
注：ここで使用されるトランスフェクション試薬は、プラスチックに結合するので、A直接低血清培地をトランスフェクション効率の低下を避けるためにDD。 - 反応あたりGHMTカクテル2μgの合計を加え、穏やかにそれをミックスするタップします。ボルテックスしないでください。室温で15分間、反応をインキュベートします。
- ステップ2.2.3からの滴下方法で、PE細胞に混合物を追加します。
- 37℃、5％CO 2インキュベーター中で一晩トランスフェクトのPlat-E細胞をインキュベートします。トランスフェクションの時間を記録します。
- 1日目は：15 mLコニカルポリスチレンチューブでは、6ウェルプレートフォーマットのための反応当たりのトランスフェクション試薬の6μLで還元血清培地の60μLを混ぜます。室温で5分間混合物をインキュベートします。
- HCN4-GFPマウス胚線維芽細胞の播種。
- 1時間のMEFをメッキする前に、免疫細胞化学のための24ウェルプレートを準備します。
- ウェル当たり12ミリメートルのフィブロネクチンカバースリップを追加します。
- ウシコラーゲン溶液の300μL（ 例えば 、SureCoat）でコートウェルと1時間37℃のインキュベーターでインキュベートします。
- すぐにMEFメッキの前に吸引するコーティング液。
- HCN4-GFPのMEFの凍結バイアルを解凍し、予め温めておいfibroblとX1を洗います5分間、500×gでのASTメディア。
- トリパンブルー排除または類似の色素を用いて細胞生存率を決定します。以下の式を用いて培養物1mL当たりの生存細胞の数を計算します。
％生存細胞は= [1.00 - （総細胞の青色細胞の数/数）]×100- 以下の式を用いて、生存細胞の総数を計算します。
細胞懸濁液の生存細胞=％生存細胞のX希釈係数は、x万X全体積
- 以下の式を用いて、生存細胞の総数を計算します。
- 先に調製したウシコラーゲン溶液フィブロネクチンカバーガラスと、24ウェルプレート上にウェルあたりシード3×10 4細胞。
- 1時間のMEFをメッキする前に、免疫細胞化学のための24ウェルプレートを準備します。
- 形質導入とのMEFの再プログラミング
注：メーカーのノートによると、適切ぷらっと-E細胞は、1×10 7感染単位/ mLの平均力価を生成維持しました。力価は直接各実験について測定されていないが、GFPコントロールは、常に感染効率の代理として含まれています。高いGFP発現と強度（GFP +> 95％）は、典型的には、iCLMsの成功GHMT媒介世代と相関します。- 0日目：24時間トランスフェクション後は、0.45μmの細孔サイズの界面活性剤を含まない酢酸セルロースフィルターを通してPEレトロウイルスの媒体をフィルタリングし、15 mLコニカルチューブに移します。 8μgの/ mLの最終濃度にポリブレンを追加します。慎重に新鮮なトランスフェクション培地2mLで細胞を補充。
注：メディアがあまりにも急激に変更された場合、細胞は、容易にプレートから切り離します。 - 培養したMEFの培地を吸引し、新鮮に収集したレトロウイルス培地を追加します。それは、6ウェルプレートのウェルあたりのメディアの1.7ミリリットルを得られるはずです。 24ウェルプレートのウェル当たり〜800μLを追加します。インキュベーターにMEFプレートを戻し、一晩インキュベートします。
- 1日目：ステップ2.4.1と2.4.2を繰り返します。 2 番目のウイルス回収後細胞を廃棄してください。インキュベーターに感染したMEFを返し、それらを一晩休ませて。
- 2日目：48時間誘導後、1×PBSで細胞馴化培地と洗浄×1を吸引。 24ウェルプレートのウェル当たり500μLの事前温めiCLMメディアを追加します。
- 3日間 - すべての2 iCLMメディアを交換してください。 14日、心臓再プログラミングの免疫細胞化学（ICC）分析のためのウイルス誘導後のプロセスプレート。
- 0日目：24時間トランスフェクション後は、0.45μmの細孔サイズの界面活性剤を含まない酢酸セルロースフィルターを通してPEレトロウイルスの媒体をフィルタリングし、15 mLコニカルチューブに移します。 8μgの/ mLの最終濃度にポリブレンを追加します。慎重に新鮮なトランスフェクション培地2mLで細胞を補充。
再プログラムしたMEFの3免疫染色
- 14日誘導後、慎重にメディアを吸引除去します。
- 氷冷1×PBS300μlで各ウェルをすすぎます。過剰の溶液を吸引します。
- 24ウェルプレートのウェル当たり4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を250μLで細胞を固定してください。 RTで15分間インキュベートします。
注： - 染色の前に、2週間固定した細胞は、1、4℃でPBS中に保存することができます。 - 300μLの0.1％PBS-トリトンX 100（PBST）で洗浄ウェル×3によって透過処理細胞。洗浄の間に室温で5分間インキュベート。最後の洗浄の後、過剰の溶液を吸引します。
- 10ブロック300μL/ウェルで1×ユニバーサルブロックBufferで室温で分。
- （ICC）染色バッファーを準備します。ブロッキング緩衝液1×PBSおよび1×ユニバーサルの1：1を追加します。 ICC染色緩衝液中で一次抗体を希釈し、4℃で一晩抗体をインキュベートします。お勧めの希釈用材料のセクションを参照してください。
- IPMとIAM識別するための1つのマウスαアクチニンとスライドのペア、鶏αGFP、およびウサギNPPAを染色します。
- IPMとIVM識別のためのマウスαアクチニン、鶏αGFP、およびウサギMyl2とスライドの1組を染色します。
- 次の日には、300μLの0.1％PBSTでウェル×3を洗います。洗浄の間に室温で5分間インキュベート。最後の洗浄の後、過剰の溶液を吸引します。
- ICC染色緩衝液中の二次抗体希釈液を調製します。お勧めの希釈用材料のセクションを参照してください。二次抗体を光から保護し、室温で1時間、インキュベートします。
- 以下の二次antibodieですべてのスライドを染色S：マウスアレクサ-555、鶏のAlexa-488、およびウサギのAlexa-647。
- 300μL、0.1％PBSTでウェル×3を洗ってください。洗浄の間に室温で5分間インキュベート。光から保護します。
- ガラス顕微鏡スライドを4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）1.5μgの/ mLを含むマウンティング培地の2.4μLを加えます。慎重に、24ウェルプレートのウェルからカバースリップを削除する過剰の溶液を除去し、実装メディアでガラススライドに移します。静かに過剰量と空気を除去するためにカバースリップを押してください。
- 好適なマニキュアやプラスチックシーラントでシール摺動します。ストアは、光から保護して4℃でスライドをマウントしました。
共焦点顕微鏡を使用した4心サブタイプの同定
注記：画像化のために、共焦点顕微鏡は、少なくとも2つの蛍光体405でのスペクトル検出が可能な検出器、488、555、及び639 nmの波長を備えたIPMS、アイムス、及びIVMSを識別するために必要です。 IMAGプランアポクロマート20X / 0.75客観以上使用して電子細胞。製造業者の画像解析ソフトウェアを用いて、走査ズーム画像は、40X油浸品質の画像を達成することができます。
- イメージ・ライブラリーは：DAPI、アレクサ488、アレクサ555、およびAlexa-647チャンネルを8ビット画像を撮る（CH。）。画素が2で6 S 1024フレームサイズ、ライン工程の滞留時間、および2の平均化は、高解像度の画像のために十分です。
- 各スライドについて、一方のエッジから開始し、アップスキャンを開始し、αアクチニン+サルコメア+細胞用の赤色蛍光チャネル（CH。）におけるダウン（例については、図3を参照してくださいと、図5（a））。サルコメア条線は555 nmの波長で視覚的に識別するのが容易です。
- αアクチニン+サルコメア+細胞が同定されたならば、緑CHに切り替えます。それが正の場合と（IPM）をメモしておきます。遠赤647 CHを評価するために、コンピュータに切り替えます。 （IAMまたはIVM）。
注：している細胞αアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - IPMSとして指定されています。 GFPの発現は、細胞（ 図4A）を通して理解されます。 - αアクチニン（マウス-Alexa555）、HCN4-GFP（鶏-Alexa488標識）で染色スライド、NPPA（ウサギ-Alexa647）、およびDAPI。 αアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFPである細胞- / NPPA +は IAMあります。 NPPA染色は核周囲や点状（ 図4B）が表示されます。
- αアクチニン（マウス-Alexa555）で染色スライド、HCN4-GFP（鶏-Alexa488標識）、Myl2（ウサギ-Alexa647）。 αアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFP陽性の細胞- / Myl2 +は IVMSです。 Myl2染色はサルコメアフィラメントに沿って横紋形を示すであろう。染色およびZ-面の品質のばらつきに、条線は常に（ 図4C）簡単に表示されない場合があります。
- αアクチニン+サルコメア+細胞が同定されたならば、緑CHに切り替えます。それが正の場合と（IPM）をメモしておきます。遠赤647 CHを評価するために、コンピュータに切り替えます。 （IAMまたはIVM）。
注：潜在的に再プログラミングされたMEFの実際の数を評価するために、24ウェルプレートの2ウェルを実験ウェルに平行に播種され、メッキ1日後に収穫されます。播種した細胞の総数は、2つのウェルを平均することによって決定されます。これは、メッキ、実際の総細胞（aTotal）となります。
- サルコメア+
- 視覚的に適切なαアクチニン+ /サルコメア+（右パネルは図3を参照 ）とレコード（ 図5B-I）のためのカバースリップ上の各セルを検査します。
- メッキ実際の総細胞（aTotal）により、各カバースリップと除算にαアクチニン+ /サルコメア+の合計数を集計した （ 図5B-III）。 aTotal = 12,500細胞、及び100細胞はα-アクチニンた場合たとえば、+ /サルコメア+は、その後、メッキのMEFの0.8％を再プログラムしました。平均reprograming実験は、1％のαアクチニンは+ /サルコメア+細胞（ 図5C）を得ます。
- サブタイプ+
注：以下の手順については、代表的なiCLM定量ワークフローについては、 図5B / Cを参照してください。それはどちらかのサブタイプ（ 図5B-I）のために一意である場合簡単に言えば、各筋節+セルのために、集計。平均サルコメア+細胞×100（ 図5B-I）オーバーサブタイプ+細胞の数を割ることによって（ 図5B-III）％のサブタイプを計算します。絶対％亜型効率（ 図5B-IV）を計算するには、×100（ 図5B-II）播種した細胞の総数で、図5B-Iからサブタイプ+細胞数を割ります。- αアクチニン+ /サルコメア+細胞のそれぞれについて、彼らはGFP +、NPPA +、またはMyl2あるかどうかを評価
- / Myl2 - - 、アクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFP - / NPPA +、およびαアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFPαアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFP + / NPPAの総数を集計- / Myl2 +細胞（ 図5B-I）。
- 各サブタイプの割合を計算するには、そのウェルで+ /サルコメア+細胞αアクチニンの総数でサブタイプ+細胞の数を分割し、100 GHMTを掛けIPMS、アイムス、およびIVMSでほぼ同じ比率を生成する（ 図5B-III）。
- 亜型+細胞の絶対数を計算するには、aTotalによる実験条件のサブタイプ+細胞の総数を除算し、100（ 図5B-II）を掛け。平均IPMSのIAMS 0.3％、総感染細胞集団の0.3％を表し、そしてIVMS 0.25％（ 図5B-IV）。
- αアクチニン+ /サルコメア+細胞のそれぞれについて、彼らはGFP +、NPPA +、またはMyl2あるかどうかを評価
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Representative Results
PM固有のレポーターマウスを利用して、我々は、 図1に示されるように、多様な内因性の筋細胞を同定するための多重免疫戦略を開発しました。 図2に示す書き換え手順に続いて、サブタイプ特異的のCMの誘導は、低レートではあるが、早ければ4日目21として検出することができます。 14日目では、実験は、サルコメア組織（ 図3）およびサブタイプ仕様（ 図4）を停止し、評価することができます。 図5は、スライドICCのための準備（ 図5パネルA）、およびiCLMサブタイプ特異的細胞の定量化（ 図5パネルB / C）のワークフローをまとめたものです。
図1： 内因性のサブタイプの多様性心筋細胞。 αアクチニンのためのHCN4-GFPレポーターマウスからの新生児の心房心筋細胞（筋節マーカー、赤）、HCN4-GFP（緑色PMマーカー、）、およびNPPA（心房マーカー、オレンジ）の（AB）免疫細胞化学（ICC）染色。 αアクチニンのためのHCN4-GFPレポーターマウスからの新生児の心室心筋細胞（筋節マーカー、赤）、HCN4-GFP（緑色PMマーカー、）、およびMyl2（心室マーカー、オレンジ）の（C）免疫細胞化学染色。 DAPI（青）：核染色。スケールバー：20μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1：培養培地。 GHMT誘発性の再プログラミングの際に使用されるいくつかの媒体を製造するための表の要約。 表2：播種、トランスフェクションおよび誘導形式。（A）細胞のプレーティングとトランスフェクションのための表の要約。 （B）播種密度近似感染単位（またはウイルス上清）心筋細胞様細胞へのMEFを誘導するために必要。 
図2： タイムライン回路図を再プログラム。 GHMT誘発性HCN4-GFPのMEFの略図。三つの主要な段階が示されています。 
図3： サルコメア組織の学位。 αアクチニン（筋節マーカー、赤）のためのHCN4-GFP MEFを14日GHMT後の伝達のICC染色はサルコメア組織の多様な範囲を示しています。組織増加の程度から右のパネルに左。各レベルの代表画像（N = 3）。スケールバー：20μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図4：サブタイプ固有の再プログラムCardiomyo球。 αアクチニン（筋節マーカー、赤）のためGHMT形質導入HCN4-GFPのMEFの（AC）ICC染色、HCN4-GFP（PMマーカー、緑）、NPPA（心房マーカー、オレンジ）、またはMyl2（心室マーカー、オレンジ） 。 DAPI（青）：核染色。スケールバー：20μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図5： イメージの取得と解析ワークフロー。画像解析のための模式図。 パネルAは、細胞にサルコメア+およびサブタイプ特異性を付与する優先順位を示します。 パネルB（I〜IV）、Cは平均GHMT-iCLM実験から期待される結果を示しています。キーポイントと式は緑色で示されています。オム/ファイル/ ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 iCLMメディア 成分 容量（ml） 最終濃度 DMEM 270 199培地 90 FBS 50 10％ インスリン - トランスフェリン - セレンG 2.5 0.50％ MEMビタミン溶液 10 2％ MEMアミノ酸 20 4％ 非必須アミノ酸 10 2％ 抗生物質、抗真菌剤 10 2％ B-27サプリメント 10 2％ 熱不活性化ウマ血清 25 5％ ピルビン酸ナトリウム 2.5 1.5 mMの ぷらっと-Eメディア（PE） 成分 容量（ml） 最終濃度 DMEM 450 FBS 50 10％ ペニシリン/ストレプトマイシン 5 1％ ピューロマイシン 0.05 1μg/ mLの ブラストサイジン 0.5 10μg/ mLの 線維芽細胞培地（FB） 成分0; 容量（ml） 最終濃度 DMEM 450 FBS 50 10％ ペニシリン/ストレプトマイシン 5 1％ グルタマックス 5 1％ トランスフェクション培地（TXF） -フィルタ処理（0.45μmの） 成分 容量（ml） 最終濃度 DMEM 450 FBS 50 10％ バッファを染色免疫細胞化学（ICC） 成分 容量（ml） 最終濃度 1×PBS 5 1×ユニバーサルブロッキングバッファー 5 A）細胞播種とトランスフェクション プレート/ディッシュ 表面積（cm 2）と 播種密度（セル） 成長培地（ミリリットル） トランスフェクトする全DNA量（μgの） トランスフェクション試薬（μL） 減少血清培地（μL） 15cmのプレート 152 1.00E + 06 20 25 75 600 10cmプレート 55 5.50E + 06 10 9 27 300 6センチメートルプレート 21 2.20E + 06 4 3.5 10.5 105 6ウェル/ X1 9 1.00E + 06 2 2 6 60 12ウェル/ X1 4 4.00E + 05 1 0.5 1.5 15 24ウェル/ X1 2 2.00E + 05 0.5 0.3 0.9 9 48ウェル/ X1 1 1.70E + 05 0.25 0.15 0.45 4.5 B）線維芽細胞の播種と誘導 プレート/ディッシュ 線維芽細胞の播種密度（単位：百万ドル） iCLMのおおよその感染単位 6センチメートルプレート 0.22から0.33 5.00E + 7（〜5 mL）で 6ウェル/ X1 0.1から0.15 3.00E + 7（〜3ミリリットル） 12ウェル/ X1 0.04から0.06 1.30E + 7（~1 mL）で 24ウェル/ X1 0.02から0.03 6.50E + 6（〜0.8 mL）を 48ウェル 0.001から0.015 3.00E + 6（〜0.4 mL）を
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Discussion
本研究は、心臓転写のレトロウイルス媒介発現を介して、心臓のサブタイプの多様なセットにしたMEFの変換のためのダイレクトリプログラミング戦略を提供することはGATA4、MEF2C、TBX5、およびHand2（GHMT）要因。 PM固有レポーターマウスと組み合わせて多重免疫染色法を用いて、我々は、単一細胞の解像度でIAM、IVMS、およびIPMSを識別することができます。このようなアッセイは、サブタイプの多様性とサルコメアの開発に向けて、個々の転写因子の寄与を分離することのできるインビトロ系の実験を可能にします。並行して、これは新たな転写因子または特定の系統に向かってiCLMsにバイアスをかける小分子への洞察をもたらす可能性があります。それにもかかわらず、このアッセイが正常に完了するためのいくつかの重要なステップがあります。以下では、一般的なiCLM実験におけるウイルス力価の影響、線維芽細胞質、およびイメージング解析に取り組みます。
私たちの研究では、EMP・ローイエコトロピック-レトロウイルスは、E12.5のMEFのを再プログラムします。私たちは、レトロウイルス力価は、細胞の品質に直接関係しているに気づきました。高継代数（> 35）と貧しい培養技術は深刻なレトロウイルス粒子の品質に影響を与えます。したがって、心に留めておくべきいくつかの考慮事項があります。 PLAT-E細胞は、VSV-G偽型ウイルスを生成し、従って、超遠心分離またはサイクル24,25の凍結に耐えることができないありません。細胞の寿命を維持するためには、抗生物質選択と在庫を維持することが肝要です。しかし、それらは、ウイルス産生の間に抗生物質を含まない培地中で維持されるべきです。我々の経験では、ここで使用されるトランスフェクション試薬は、細胞内で最高のトランスフェクション効率を提供します。他のトランスフェクション方法を使用する場合、産生されたウイルス力価を比較する26必須です。採取する製造業者によって推奨事項がありますがトランスフェクション後のウイルス上清48時間、我々は通常、より高い力価のウイルスプレップに関連した毒性作用を回避しながら、2つの24時間の収穫のラウンドは、より高い再プログラミング効率が得られることを観察しました。いくつかの研究は、市販のウイルス上清濃縮器27の実現可能性を示しているもののさらに、我々はより高いスループットを維持するために私たちの定期的なプロトコルでは、これらを採用していません。
高力価ウイルスカクテルに加えて、線維芽細胞の品質が成功再プログラミングアッセイ28決定的に重要です。正しくタイムアウトした場合、新たに単離したMEFを凍結ストックに比べて、それらの高い効率に利用すべきです。彼らは29を統合するために非常に増殖性のホストを必要とするので、これは、レトロウイルスの性質に関連することができました。さらに、MEF播種密度が重要な役割を果たしています。我々は、使用播種密度を持つテーブルが含まれています我々の実験において（ 表2）。また、MEFのを継代しても大幅にリプログラミング効率が低下します。
免疫細胞化学（ICC）はサルコメア組織とサブタイプの仕様の分析のための私達の標準的な技術です。 PM-GFPレポーターマウスの助けを借りて、私たちは三つの主要な心臓のサブタイプ（AM、VM、およびPM）を検出するための抗体のパネルを形成することができました。しかし、抗体種の可用性と標準共焦点顕微鏡のセットアップの4チャネルの制限の制約のために、サブタイプごとに2つのカバースリップは、すべての3つのサブタイプの有病率を定量化するために必要とされています。一つのカバーガラスは、αアクチニン/ GFP（HCN4）/ Myl2、およびαアクチニン/ GFP（HCN4）のための1 / NPPAを染色します。サルコメア構造はすべてのCMの共通の特徴およびサブタイプ仕様21の潜在的な前提条件である我々の以前の観察に基づき、我々の分析の最初のステップは、+サルコメアを決定され、細胞。しかし、原因の主観的な性質のために、サルコメア組織のレベルを確立することは、おそらくこのアッセイの最も難しい部分です。これは、複数の観察者の数量化を平均化することによって、または、プロセス30を自動化する計算セルの分割ソフトウェアを開発することによって制限することができます。基準点として、内因性の細胞を用いて、我々はよく組織サルコメア+のしきい値を発見し、iCLMs（ 図3）を獲得するためにそれを利用しました。これらのパラメータを考慮すると、平均的な実験は20に上昇を与える- 30％αアクチニン+細胞が、わずか1％がα-アクチニンされている+ /サルコメア+を 。 1パーセントのサルコメア+細胞のうち、約30％がNPPA +、Myl2 +、またはHCN4-GFP +になります。
心筋細胞は、構造的に複雑であることを考えると、集団ベースの遺伝子発現（ 例えば 、定量RT-PCR）または分析は複雑な形態学CHをキャプチャすることはできませんフローサイトメトリーiCLMの再プログラミング中に発生ザンジュ。これとは対照的に、パッチクランプやカルシウム過渡イメージングは非常に厳格な単一細胞の機能アッセイであるが、専門的なスキルや機器は、これらの実験を行うために必要とされています。したがって、記載された方法は、スループットを著しく損なうことなくiCLMの再プログラミングの重要な構造と機能パラメータを研究する直接的なアプローチを提供するという点でユニークです。
直接再プログラミングにおける多くの最近の進歩にもかかわらず、多くの研究は、より良好な分子、心臓再プログラミングを調節するメカニズム、及びより具体的には、サブタイプの仕様を理解するために行われるために残っています。これらのメカニズムは、臨床応用のための直接再プログラミングを翻訳することが特に重要になります。このように、本研究では、直接筋節開発、サブタイプの仕様、およびiCLMの成熟度への貢献を評価するために個別のパラメータを調節することができるプラットフォームを説明します。 Moreo版、このシステムは、さらに、再生心臓の次のステップのための小分子又は細胞外マトリックスの複合体のスクリーニングを可能にするハイスループット形式で動作するように開発することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
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