Introduction
O coração é o primeiro órgão funcional para desenvolver no embrião 1, 2. Em conjunto com o sistema circulatório, que fornece o oxigénio, nutrientes, e um mecanismo de eliminação de resíduos durante o desenvolvimento. Três semanas após a fertilização, o coração humano bate pela primeira vez e a sua regulação correcta é mantida por cardiomiócitos (CMS). A perda irreversível destas células especializadas é, por conseguinte, o problema fundamental subjacente a insuficiência cardíaca progressiva. Embora alguns organismos, tais como o peixe-zebra e Xenopus têm o potencial para a regeneração cardíaca, o coração de mamíferos adultos é mais limitada de 3, 5, 6. Assim, tendo em conta a função crítica do coração, não é surpreendente que a doença cardíaca é a causa principal de morte no mundo, sendo responsável por 600.000 mortes nos Estados Unidos sozinho 7. oguinte, terapias baseadas em células para reparar ou substituir o miocárdio lesado de forma eficiente são de grande interesse clínico.
O estudo seminal de Yamanaka e seus colegas 8 mostraram que a expressão forçada de quatro fatores de transcrição é suficiente para converter células de fibroblastos completamente diferenciadas para as células-tronco pluripotentes. No entanto, a capacidade tumorigénica de todas as estratégias de células estaminais pluripotentes tem sido uma preocupação crítica na sua utilização para fins terapêuticos. Isso motivou o campo científico para procurar métodos alternativos para transdiferenciam células, evitando um estágio pluripotente. Recentemente, vários grupos demonstraram a viabilidade desta estratégia, exibindo conversão directa de fibroblastos de rato para células de cardiomiócitos-like induzidas (iCLMs) com a expressão ectópica de fatores de transcrição GATA4, MEF2C, Tbx5, e mais tarde, HAND2 (GMT e GHMT , respectivamente) 9, 10. Furthermore, a mesma estratégia pode ser realizada in vivo e nos tecidos de origem humana-9, 11, 12. Estudos recentes puseram em evidência factores adicionais ou as vias de sinalização que pode ser modulada de modo a melhorar ainda mais a eficiência cardíaca reprogramação 13, 14, 15. Tomados em conjunto, estes estudos demonstram o potencial de transdiferenciação dirigido para terapias regenerativas. No entanto, a baixa eficiência de CM reprogramação, os mecanismos moleculares desconhecidos, reprodutibilidade inconsistente devido a diferenças metodológicas 16, e a heterogeneidade dos iCLMs permanecem sem solução.
A fim de avaliar diretamente iCLM heterogeneidade, foi elaborado um ensaio de uma única célula discreta e robusta para a identificação de desenvolvimento sarcomere e Specificatio linhagem cardíacaN-duas características necessárias de cardiomiócitos funcionais. Há pelo menos três tipos principais de CM no coração tal como definido pela sua localização e propriedades elétricas únicas: atrial (AM), ventricular (VM) e pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. Numa combinação orquestrada, eles permitem que a bombagem de sangue adequado. Durante a lesão cardíaca, um ou todos os subtipos pode ser afectada, e o tipo de terapia com células teriam de ser dirigida numa base de caso-a-caso. Atualmente, a maioria das estratégias de focar a geração global de cardiomiócitos, enquanto pouco trabalho está sendo feito para estudar os mecanismos moleculares que regulam a especificação subtipo.
Detalhes do estudo seguinte como quantificar adequadamente sarcômeros bem organizadas e identificar um conjunto diversificado de subtipos de cardiomiócitos. Usando um pacemaker (PM) do mouse repórter -específica, somos capazes de aplicar um iabordagem mmunocytochemical distinguir miócitos atriais induzidas-like (IAM), miócitos ventriculares induzidas-like (MIV), e induzidas miócitos PM-like (IPMS) 21. Com base em nossas observações, apenas as células que exibem organização sarcomere são capazes de batimento espontâneo. Esta plataforma reprogramação exclusivo permite avaliar o papel de determinados parâmetros na organização do sarcômero, especificação subtipo, e a eficiência da reprogramação CM na resolução de uma única célula.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais envolvendo práticas animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da UT Southwestern Medical Center.
1. Isolamento de Hcn4-GFP E12.5 rato embrionário de fibroblastos (MEFs)
- Configurar acasalamentos cronometrados entre homozigotos machos Hcn4-GFP e CD-1 fêmeas.
- Sacrificar fêmea grávida em E12.5 por eutanásia dióxido de carbono e subsequente deslocamento cervical.
- Remover cornos uterinos com uma pinça de dissecação como descrito anteriormente 22, 23, e colocá-los em uma placa de Petri sobre gelo com uma solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) sem Ca2 + ou Mg2 +.
- Execute todas as etapas posteriores na capa de cultura de tecido, utilizando uma técnica estéril.
- Retire os embriões do útero e saco amniótico com uma tesoura e dissecando fórceps. Mantenha a placenta anexado para melhor manuseio. pregnant CD-1 fêmeas geralmente dão à luz entre 10 e 14 filhotes.
- Usando dissecando uma pinça, levar os embriões isolados e rapidamente lavá-los duas vezes em 70% (v / v) EtOH.
NOTA: As lavagens deve ser rápido para minimizar a morte celular. - Retire a cabeça, membros, cauda e órgãos internos, incluindo o coração dos embriões isolados.
- Colocar o tecido restante em um prato de 10 cm com 1 mL de PBS 1x e tritura finamente com uma lâmina de barbear esterilizada para aproximadamente 1 mm 3 de tamanho.
- Transferir tecido moído para um tubo cónico de 50 ml com PBS.
- Girar a 300 xg por 3 min. Aspirar cuidadosamente o excesso de PBS.
- Adicionar 1 ml de estéril 0,25% de tripsina-EDTA por embrião. Incubar as células em um banho de água a 37 ° C durante 15 min. Misture delicadamente o tubo a cada 4 min. Sobre-digestão do tecido irá diminuir significativamente o rendimento.
- mistura de células Vortex à velocidade máxima (3.200 rpm) durante 4 s.
- Adicione 2 ml de meio de fibroblastos por embrião e misture. filtro ttravés de um filtro celular de 100 um, utilizando uma pipeta para auxiliar as células através do filtro. Consultar a Tabela 1 para a formulação de todos os meios subsequentes.
- Giram a 300 g durante 4 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
- Adicionar 10 ml de meio de fibroblastos fresca por 3 embriões e triturar 6-10 vezes.
- Placa as células em 1 15 cm prato de cultura de tecidos para cada 3 embriões preparados. Durante a noite em cultura a 37 ° C, 5% de CO2.
- Após a incubação durante a noite, substituir a mídia com frescos 30 mL de mídia por placa. Colocar as células de volta na incubadora durante a noite.
NOTA: Verifique se há Hcn4-GFP + contaminação de células sob um microscópio fluorescente. A cultura deve ser GFP - e só se tornam GFP + sobre a reprogramação. - No dia seguinte, as células de colheita com 3 ml de fresco pré-aquecido 0,25% de tripsina-EDTA. Contagem e congelar células. Tipicamente, congelar as células a 3 x 10 6 culas por ml. O Yie esperadoLD deve ser de 3 x 10 6 células por embrião.
2. Retrovirus Produção e Reprogramação
Atenção: O protocolo seguinte exige a produção e manipulação de retrovírus infecciosos. Execute as seguintes etapas em um armário de Biossegurança Nível 2, sob BSL-2 orientações e técnica estéril. Use 10% de alvejante de dispor de todos os materiais expostos ao retrovírus.
- Produção de retrovírus e preparação MEFs
NOTA: O protocolo seguinte é para a produção retroviral em placas de 6 poços e MEF infecção em placas de 24 poços. Para outros formatos, consulte a Tabela 2. MEFs são banhados no dia -1, então o tempo terá de ser coordenado de forma adequada para cada experimento (Consulte a seção 2.3 e Figura 2).- Manter as células como as recomendações do fabricante Plat-E (PE). Resumidamente, as células de cultura de PE em DMEM suplementado com 10% de FBS, 1 ug / mL puromyCIN, 10 ug / ml de blasticidina, penicilina e estreptomicina. células de passagem 1: 4 a cada dois dias quando a cultura atinge 70-90% de confluência.
- Dia -2: No dia antes da transfecção, as células semente Plat-E a 1 x 10 6 células / poço numa placa de 6 poços em meio de transfecção. As células devem ser de 70-80% confluentes no momento da transfecção.
- A transfecção utilizando um agente de transfecção comercial.
NOTA: Os reagentes comerciais devem estar à temperatura ambiente (TA) antes da transfecção. Para a transfecção de ADN, adicionar cada ADN plasmídico retroviral individualmente (G, H, H, e T), para formar um cocktail GHMT 9.- Dia -1: Em um tubo de poliestireno de 15 mL cónico, misturar 60 mL de meio de soro reduzido com 6 mL de reagente de transfecção por reacção de um formato de placa de 6 poços. Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente.
Observação: Uma vez que o reagente de transfecção utilizado aqui se liga aos plásticos, umadd directamente para o meio de soro reduzido para evitar qualquer diminuição da eficiência de transfecção. - Adicionar um total de 2 mg de GHMT cocktail por reação e bata suavemente para misturar. não vortex. Incubar a reacção durante 15 min à TA.
- Adicionar a mistura do passo 2.2.3 às células PE de forma sensata gota.
- Incubar as células Plat-E transfectadas durante a noite num banho a 37 ° C, 5% de CO2. Anote o tempo de transfecção.
- Dia -1: Em um tubo de poliestireno de 15 mL cónico, misturar 60 mL de meio de soro reduzido com 6 mL de reagente de transfecção por reacção de um formato de placa de 6 poços. Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente.
- Semeadura de rato Hcn4-GFP fibroblastos embrionárias.
- 1 h antes do plaqueamento MEFs, preparar uma placa de 24 poços para imunocitoquímica.
- Adicionar uma lamela fibronectina 12 mm por bem.
- Poços revestimento com 300 uL de solução de colagénio bovino (por exemplo, surecoat) e incuba-se num banho a 37 ° C incubadora durante 1 h.
- solução de revestimento aspirado imediatamente antes do plaqueamento MEF.
- Descongelar uma ampola congelada de Hcn4-GFP MEFs e lavar com x1 fibrobl pré-aquecidomeios AST a 500 xg durante 5 min.
- Determinar a viabilidade celular utilizando a exclusão de azul de tripano ou corantes semelhantes. Calcular o número de células viáveis por ml de cultura, utilizando a seguinte fórmula:
% de células viáveis = [1,00 - (número de células azuis / número total de células)] x 100- Calcular o número total de células viáveis utilizando a seguinte fórmula:
As células viáveis =% de células viáveis x factor de diluição x 10.000 x volume total de suspensão de células
- Calcular o número total de células viáveis utilizando a seguinte fórmula:
- Seed 3 x 10 4 culas por po para uma placa de 24 poços com colagénio bovino lamela solução de fibronectina previamente preparada.
- 1 h antes do plaqueamento MEFs, preparar uma placa de 24 poços para imunocitoquímica.
- Transdução e reprogramação de MEFs
NOTA: De acordo com as notas do fabricante, devidamente mantido células Plat-E produzir um título médio de 1 x 10 7 unidades de infecção / mL. Embora a título não é directamente medido para cada experiência, um controlo de GFP é sempre incluído como um substituto para a eficiência de infecção.Expressão GFP e alta intensidade (GFP +> 95%) está correlacionado com geração tipicamente mediada por GHMT bem sucedida de iCLMs.- Dia 0: 24 h pós-transfecção, filtrar a forma retroviral PE através de um tamanho de poro uM-filtro de acetato de celulose sem agente tensioactivo 0,45 e transferir para um tubo cónico de 15 mL. Adicionar polibreno a uma concentração final de 8 ug / mL. Cuidadosamente repor as células com 2 ml de meio de transfecção fresco.
NOTA: As células facilmente separar da placa se a mídia é alterado muito rapidamente. - Aspirar o meio dos MEFs cultivadas e adicionar o meio retroviral recentemente colhido; deve proporcionar 1,7 mL de meio por poço de uma placa de 6 poços. Adicionar ~ 800 uL por poço de uma placa de 24 poços. Retorno placa MEF para a incubadora e incubar durante a noite.
- Dia 1: Repita os passos 2.4.1 e 2.4.2. Descarte células após a colecção de vírus da 2ª. Voltar MEFs infectados para a incubadora e deixá-los descansar durante a noite.
- Dia 2: 48 h pós-indução, aspirar a célula condicionado mídia e lavagem x1 com 1x PBS. Adicionar 500 ul meios iCLM pré-aquecido por poço de uma placa de 24 poços.
- Substituir mídia iCLM cada 2 - 3 dias. placa processo de 14 dias após a indução viral para imunocitoquímica análise (ICC) de reprogramação cardíaca.
- Dia 0: 24 h pós-transfecção, filtrar a forma retroviral PE através de um tamanho de poro uM-filtro de acetato de celulose sem agente tensioactivo 0,45 e transferir para um tubo cónico de 15 mL. Adicionar polibreno a uma concentração final de 8 ug / mL. Cuidadosamente repor as células com 2 ml de meio de transfecção fresco.
3. A imunocoloração de MEFs reprogramado
- 14 dias pós-indução, aspirar cuidadosamente a mídia.
- Lavar cada poço com 300 mL de gelo-frio 1x PBS. Aspirar o excesso de solução.
- Fixar as células com 250 uL de solução de paraformaldeído a 4% (PFA) por poço de uma placa de 24 poços. Incubar 15 min a RT.
NOTA: Fixa células podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C durante 1 - 2 semanas antes da coloração. - permeabilizar células por Wells lavar 3x com 300 uL de 0,1% Triton X-100 de PBS (PBST). Incubar 5 min à temperatura ambiente entre lavagens. Aspirar o excesso de solução após a última lavagem.
- Bloco para 10min à temperatura ambiente com tampão de bloqueio universal 1x a 300 uL / poço.
- Prepare tampão de coloração (ICC): Adicione 1: 1 de PBS 1x e 1x Universal tampão de bloqueio. Dilui-se os anticorpos primários em tampão de coloração ICC e incubar anticorpos durante a noite a 4 ° C. Consulte a seção de material para diluições recomendadas.
- Manchar um par de lâminas com α-actinina rato, αGFP frango e coelho NPPA para IPM e identificação IAM.
- Manchar um par de lâminas com rato α-actinina, αGFP frango, e Myl2 coelho para IPM e IVM identificação.
- No dia seguinte, lave poços x3 com 300 mL de 0,1% PBST. Incubar 5 min à temperatura ambiente entre lavagens. Aspirar o excesso de solução após a última lavagem.
- Preparar as diluições de anticorpo secundário em tampão de coloração ICC. Consulte a seção de material para diluições recomendadas. Incubar anticorpos secundários 1 h à temperatura ambiente, protegida da luz.
- Manchar todos os slides com o antibodie secundária seguintes: Rato Alexa-555, frango Alexa-488, e coelho Alexa-647.
- Lave poços x3 com 300 mL de 0,1% PBST. Incubar 5 min à temperatura ambiente entre lavagens. Proteger da luz.
- Adicionar 2,4 mL de meio de montagem contendo 1,5 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para uma lâmina de microscópio de vidro. Remova cuidadosamente a lamela do poço da placa de 24 poços, remover o excesso de solução e transferir para a lâmina de vidro com meios de montagem. Pressione suavemente a lamela para remover o excesso de volume e ar.
- lâminas de vedação com unha polonês preferencial ou selante plástico. Loja montadas lâminas a 4 ° C protegidos da luz.
4. Identificação do cardíacos subtipos Usando Microscopia Confocal
NOTA: Para imagens, um microscópio confocal equipado com pelo menos 2 detectores fluorescentes capazes de detecção espectral a 405, 488, 555, e 639 nm comprimento de onda é necessário, a fim de identificar IPMS, IAM, e iVMS. imagcélulas e usando um plano-Apochromat 20X / 0,75 objetiva ou melhor. Usando o software de análise de imagem do fabricante, a digitalização de imagens de zoom pode conseguir imagens de qualidade de imersão 40X de óleo.
- biblioteca de imagens: tome imagens de 8 bits com DAPI, Alexa-488, Alexa-555 e Alexa-647 canais (cap.). Pixel tempo de permanência de 6 s, 1024 tamanho do quadro, passo linha no 2, e média de 2 é suficiente para imagens de alta resolução.
- Para cada slide, começar a partir de uma extremidade e começar a digitalizar cima e para baixo no canal fluorescente vermelha (cap.) Para sarcômero + células α-actinina + (Consulte a Figura 3 e Figura 5A para exemplos). estrias sarcômero são mais fáceis de identificar visualmente no comprimento de onda 555 nm.
- Uma vez que um sarcômero + células α-actinina + foi identificado, mudar para o ch verde. e manter a nota se for positivo (IPM). Mudar para o computador para avaliar a vermelho-distante 647 ch. (IAM ou MIV).
NOTA: As células que sãoα-actinina + / + sarcômero / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - são designados como IPMS. Expressão da GFP será visto ao longo da célula (Figura 4A). - lâminas mancha com α-actinina (mouse-Alexa555), Hcn4-GFP (frango-Alexa488), NPPA (coelho-Alexa647) e DAPI. Células que são α-actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP - / + NPPA são IAM. NPPA coloração aparece perinuclear e pontuada (Figura 4B).
- lâminas mancha com α-actinina (mouse-Alexa555), Hcn4-GFP (frango-Alexa488), Myl2 (coelho-Alexa647). Células positivas para α-actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP - / + Myl2 são iVMS. Myl2 coloração irá apresentar uma forma estriado ao longo do filamento sarcômero. Devido a variações na qualidade da coloração e o plano z, estrias podem nem sempre ser facilmente visível (Figura 4C).
- Uma vez que um sarcômero + células α-actinina + foi identificado, mudar para o ch verde. e manter a nota se for positivo (IPM). Mudar para o computador para avaliar a vermelho-distante 647 ch. (IAM ou MIV).
NOTA: De modo a avaliar o número real de MEFs potencialmente reprogramadas, 2 poços de uma placa de 24 cavidades são semeadas em paralelo aos poços experimentais e são colhidas um dia após o plaqueamento. O número total de células plaqueadas é então determinada através da média das duas cavidades. Isto torna-se total de células reais banhados (atotal).
- sarcômero +
- Inspecionar visualmente cada célula em uma lamela para o bom α-actinina + / sarcômero + (painéis da direita Figura 3) e registro (Figura 5B-I).
- Tabular o número total de α-actinina + / + sarcômero em cada lamela e dividir pelo número total de células plaqueadas reais (atotal) (Figura 5B-III). Por exemplo, se atotal = 12.500 células, e células 100 foram a-Actinina + / + sarcômero então, 0,8% de as MEFs plaqueadas foram reprogramadas. Uma médiareprogramação experiência renderá 1% de a-actinina + / sarcômero células + (Figura 5C).
- subtipo +
NOTA: Para os passos seguintes, consulte a Figura 5B / C para um fluxo de trabalho iCLM quantificação representativa. Resumidamente, para cada célula sarcómero +, tabular se que é único para qualquer subtipo (Figura 5B-I). Calcular a% de subtipo (Figura 5B-III), dividindo o número de células ao longo do subtipo + sarcómero média + x 100 células (Figura 5B-I). Para calcular a% de eficiência absoluta subtipo (Figura 5B-IV), dividir o número subtipo + célula a partir da Figura 5B-I pelo número total de células semeadas x 100 (Figura 5B-II).- Para cada uma das células α-actinina + / + sarcômero, avaliar se eles são GFP +, + NPPA, ou Myl2
- Tabular número total de α-actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP - / NPPA +, e α-actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP - / + Myl2 células (Figura 5B-i).
- Para calcular a percentagem de cada subtipo, divida o número de células Subtipo + pelo número total de α-actinina + / sarcômero + células em que bem e multiplicar por 100. GHMT gera IPMS, Iams, e iVMS proporções mais ou menos iguais (Figura 5B-III).
- Para calcular o número absoluto de células subtipo +, dividir o número total de células subtipo + para a condição experimental por atotal e multiplicar por 100 (Figura 5B-II). Em IPMS médios representam 0,3% da população total de células infectadas, IAM 0,3%, eiVMS 0,25% (Figura 5B-IV).
- Para cada uma das células α-actinina + / + sarcômero, avaliar se eles são GFP +, + NPPA, ou Myl2
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Representative Results
Tomando vantagem do rato repórter específica do PM, que desenvolveu uma estratégia para identificar imunocoloração multiplex diversas miócitos endógenos, como representado na Figura 1. Após os passos de reprogramação mostrados na Figura 2, a indução de MC específicos do subtipo pode ser detectada tão cedo como o dia 4 21, se bem que a uma velocidade baixa. Ao dia 14, o experimento pode ser interrompido e avaliadas para a organização do sarcómero (Figura 3) e o subtipo de especificação (Figura 4). A Figura 5 resume o fluxo de trabalho de preparação das lâminas de TPI (Figura 5 Painel A), e a quantificação de células iCLM específica para subtipos (Figura 5 Painel B / C).
Figura 1: Sub-tipo Diversidade das endógenaCardiomiócitos. (AB) Imunocitoqu�ica (ICC) coloração de cardiomiócitos atriais neonatais de ratos repórter Hcn4-GFP para α-actinina (marcador sarcomere, vermelho), Hcn4-GFP (PM marcador, verde) e NPPA (fibrilação marcador, laranja). (C) coloração imunocitoquímica de cardiomiócitos ventriculares neonatais de ratos repórter Hcn4-GFP para α-actinina (marcador sarcomere, vermelho), Hcn4-GFP (PM marcador, verde) e Myl2 (ventricular marcador, laranja). DAPI (azul): coloração nuclear. Barras de escala: 20 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Meio de Cultura. resumo da tabela para a preparação dos diversos meios utilizados durante a reprogramação induzida GHMT. Tabela 2: Sementeira, transfecção e formatos de indução.(A) Resumo da tabela para o revestimento e transfecção de células. Unidades (B) densidade de semeadura e infecção aproximada (ou sobrenadante viral) necessária para induzir MEFs em células de cardiomiócitos-like. 
Figura 2: Reprogramação Timeline esquemático. Representação esquemática do induzidas GHMT MEFs Hcn4-GFP. As três etapas principais são retratados. 
Figura 3: grau de organização sarcômero. ICC coloração de Hcn4-GFP MEFs 14 dias após GHMT transdução de α-actinina (marcador sarcomere, vermelho) mostra uma gama diversificada de organização sarcômero. O grau de organização aumenta da esquerda para a direita painéis. imagens representativas de cada nível (n = 3). Barra de escala: 20 ^ m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 4: específicos do subtipo reprogramado Cardiomyo citos. (AC) ICC coloração de GHMT transduzidas Hcn4-GFP MEFs para α-actinina (marcador sarcomere, vermelho), Hcn4-GFP (PM marcador, verde), NPPA (marcador atrial, laranja), ou Myl2 (marcador ventricular, laranja) . DAPI (azul): coloração nuclear. Barras de escala: 20 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 5: Aquisição de Imagem e Análise de Fluxo de Trabalho. Representação esquemática para análise de imagem. O painel A mostra a ordem de prioridade de atribuição sarcómero + e subtipo-especificidade para uma célula. Painel B (i-iv) e C mostram os resultados esperados de uma experiência média GHMT-iCLM. Pontos-chave e fórmulas são mostrados em verde.om / files / ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. media iCLM Componente Volume (mL) A concentração final DMEM 270 meio 199 90 FBS 50 10% Insulin-transferrina-selênio G 2.5 0,50% solução de vitaminas MEM 10 2% MEM Aminoácidos 20 4% Os aminoácidos não-essenciais 10 2% Antibióticos antimicóticos 10 2% B-27 suplemento 10 2% Inactivado pelo calor Soro de Cavalo 25 5% Na-piruvato 2.5 1,5 mM Media Plat-E (PE) Componente Volume (mL) A concentração final DMEM 450 FBS 50 10% Penicilina / Estreptomicina 5 1% puromicina 0,05 1 ug / mL Blasticidin 0,5 10 ug / mL Meio de fibroblastos (FB) Componente0; Volume (mL) A concentração final DMEM 450 FBS 50 10% Penicilina / Estreptomicina 5 1% Glutamax 5 1% Meio de transfecção (TxF) - filtrada (0,45 um) Componente Volume (mL) A concentração final DMEM 450 FBS 50 10% Imunocitoquímica (ICC) tampão de coloração Componente Volume (mL) A concentração final 1x PBS 5 1x tampão de bloqueio universal 5 A) sementeira de células e transfecção Placa / Dish Área de Superfície (cm 2) Densidade de semeadura (células) O meio de crescimento (ml) A quantidade total de ADN para transfectar (ug) Transfection Reagent (uL) Meio de soro reduzido (uL) 15 cm placa 152 1,00E + 06 20 25 75 600 10 cm placa 55 5.50E + 06 10 9 27 300 6 centímetros placa 21 2.20e + 06 4 3,5 10.5 105 6 bem / x1 9 1,00E + 06 2 2 6 60 12 bem / x1 4 4,00E + 05 1 0,5 1,5 15 24 bem / x1 2 2,00E + 05 0,5 0,3 0,9 9 48 bem / x1 1 1.70E + 05 0,25 0,15 0,45 4,5 B) semeadura de fibroblastos e indução Placa / Dish Fibroblastos densidade de semeadura (milhões) Unidades de infecção aproximados para iCLM 6 centímetros placa 0,22-0,33 5,00E + 7 (~ 5 mL) 6 bem / x1 0,1-0,15 3.00E + 7 (~ 3 mL) 12 bem / x1 0,04-0,06 1,30E + 7 (~ 1 mL) 24 bem / x1 0,02-0,03 6.50E + 6 (~ 0,8 mL) 48 bem ,001-,015 3.00E + 6 (~ 0,4 mL)
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Discussion
O presente estudo fornece uma estratégia de reprogramação direta para a conversão de MEFs em um conjunto diversificado de subtipos cardíacas via expressão mediada por retrovírus da transcrição cardíaca fatores GATA4, MEF2C, Tbx5 e HAND2 (GHMT). Usando uma abordagem imunocoloração multiplex em combinação com um rato repórter específica do PM, somos capazes de identificar IAM, iVMS e IPMS em resolução de uma única célula. Um tal ensaio permite uma experimental sistema in vitro capaz de isolar as contribuições de fatores de transcrição individuais à diversidade subtipo e desenvolvimento sarcômero. Em paralelo, este poderia trazer conhecimento para novos factores de transcrição ou pequenas moléculas que Bias iCLMs no sentido de uma linhagem particular. No entanto, existem vários passos críticos para a conclusão bem sucedida deste ensaio. Abaixo, vamos abordar o impacto do título viral, a qualidade de fibroblastos, e análise de imagem em um experimento geral iCLM.
Em nosso estudo, nós empLoy ecotr�icos-retrovirais para reprogramar MEFs E12.5. Percebemos o título retroviral está diretamente relacionada com a qualidade das células. número de alta passagem (> 35) e técnicas de cultura pobres afectar gravemente a qualidade das partículas retrovirais; portanto, há várias considerações a ter em mente. Células Plat-E não produzem VSV-G vírus pseudotipado, e são, portanto, incapazes de suportar ultracentrifugação ou ciclos de congelamento de 24, 25. A fim de preservar a longevidade das células, é imperativo manter a lingua com a selecção de antibiótico. No entanto, estas deveriam ser mantidas em meio isento de antibiótico durante a produção viral. Em nossa experiência, o reagente de transfecção usada aqui fornece a mais alta eficiência de transfecção em células. Se outros métodos de transfecção são para ser utilizados, comparando-se os títulos virais produzidas 26 é essencial. Apesar de existirem recomendações do fabricante para a colheitao viral sobrenadante 48 h após a transfecção, observou-se que duas rodadas de 24 h de colheita produzir eficiências de reprogramação mais elevadas, evitando efeitos tóxicos normalmente associados com preps viral de maior titulação. Além disso, apesar de vários estudos têm demonstrado a viabilidade de concentradores de sobrenadante viral comerciais 27, não temos empregada estes em nosso protocolo regular, a fim de manter um rendimento mais elevado.
Além de cocktails virais de título elevado, a qualidade de fibroblastos é de importância crucial para um ensaio de reprogramação 28. Se cronometrado corretamente, MEFs recentemente isolados devem ser utilizados devido às suas eficiências mais altas em comparação com os estoques congelados. Isto pode estar relacionado com a natureza dos retrovírus, como eles precisam de um hospedeiro altamente proliferativo, a fim de integrar 29. Além disso, MEF densidade de sementeira desempenha um papel crítico. Nós incluímos uma tabela com as densidades de semeadura empregadosNas nossas experiências (Tabela 2). Além disso, passagem das MEFs também irá diminuir significativamente a eficiência de reprogramação.
Imunocitoquímica (ICC) é a nossa técnica padrão para análise da organização sarcomere e especificação subtipo. Com a ajuda de um rato repórter PM-GFP, que foram capazes de formar um painel de anticorpos para a detecção de três principais subtipos cardíacas (AM, VM, e PM). No entanto, devido a limitações de disponibilidade de espécies de anticorpo e a limitação de 4 canais em um padrão microscópio confocal de set-up, por duas lamelas subtipo são necessários para quantificar a prevalência de todos os três subtipos. Uma lamela vai manchar para α-Actinina / GFP (Hcn4) / Myl2, e um para α-Actinina / GFP (Hcn4) / NPPA. Com base em nossa observação anterior de que a estrutura sarcomérica é uma característica comum de todos os CMs e um pré-requisito potencial para a especificação de subtipo 21, o primeiro passo em nossa análise é determinar sarcomere +células. No entanto, devido à sua natureza subjetiva, estabelecendo o nível de organização sarcômero é talvez a parte mais difícil deste ensaio; isso pode ser limitado pela média quantificações múltipla do observador ou através do desenvolvimento de software segmentação celular computacional para automatizar o processo 30. Usando células endógenas como um ponto de referência, descobrimos um limite para a bem organizada sarcomere + e utilizado que para marcar iCLMs (Figura 3). Tendo em conta estes parâmetros, uma experiência média irá dar origem a 20 - 30% de a-actinina + células, mas apenas 1% são a-Actinina + / + sarcômero. Das células sarcômero + 1%, ~ 30% será NPPA +, + Myl2, ou Hcn4-GFP +.
Dado que os cardiomiócitos são estruturalmente complexa, a expressão do gene de base populacional (por exemplo qRT-PCR) ou análises de citometria de fluxo não pode capturar o ch morfológica intrincadoanges que ocorrem durante iCLM reprogramação. Em contraste, a fixação de patches e de cálcio de imagem transiente são ensaios funcionais de uma única célula altamente rigorosos, mas as habilidades e equipamentos especializados são necessários para realizar esses experimentos. Assim, a metodologia descrita é único na medida em que proporciona uma abordagem simples para estudar parâmetros estruturais e funcionais da iCLM reprogramação sem comprometer significativamente o rendimento.
Apesar dos muitos avanços recentes na reprogramação direta, ainda há muito trabalho a ser feito para compreender melhor os mecanismos moleculares que regulam a reprogramação cardíaca e, mais especificamente, especificação subtipo. Estes mecanismos será especialmente importante para traduzir reprogramação direta para aplicações clínicas. Como tal, neste estudo, descrevemos uma plataforma capaz de modular directamente parâmetros discretos para avaliar a contribuição para o desenvolvimento do sarcômero, especificação subtipo, e maturidade iCLM. Moreover, este sistema pode ser desenvolvido para trabalhar em um formato de alto rendimento que permite a triagem complexa de moléculas pequenas ou matrizes extracelulares para o próximo passo em cardiologia regenerativa.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
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