Summary
גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.
Abstract
מיסודם חלבונים מופרעים (עקור) כבר זמן רב אתגר לביולוגים מבניים עקב חוסר אלמנטי מבנה משני יציבה. מימן-דאוטריום Exchange (HDX) למדידה בסקאלות זמן מהירות מתאים באופן ייחודי כדי לזהות מבנים ורשתות מליטת המימן כי מאוכלסות בקצרה, המאפשר האפיון של conformers חולף בהרכבים מקומיים. עגינת HDX כדי ספקטרומטריית מסה מציעה יתרונות מרכזיים, כולל רגישות גבוהה, צריכת מדגם נמוכה ואין הגבלה על גודל חלבון. טכניקה זו התקדמה מאוד בעשורים האחרונים, כולל היכולת לפקח פעמים תיוג HDX על ציר הזמן אלפית השנייה. בנוסף, על ידי שילוב זרימת עבודת HDX גבי פלטפורמת microfluidic אירוח הפקת microreactor פרוטאז חומצי, אנחנו מסוגלים למקם תכונות דינמיות ברמת פפטיד. במחקר זה, זמן-נפתרה electrospray יינון ספקטרומטריית מסה (TRESI-MS) מצמידים HDX ווההים משמש כדי לספק תמונה מפורטת של מבנה שיורית חלבון טאו, כמו גם את משמרות קונפורמציה המושרות על hyperphosphorylation.
Introduction
במהלך העשורים האחרונים, התקדמות משמעותית נעשתה בפיתוח שיטות אנליטיות שנועדו למדוד את מבנה חלבון ואת דינמיקת 1, 2, 3, 4. בעוד קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן נותר כלי העיקרון לקביעת מבנה החלבון, ריכוז גבוה של חלבון נחוצים ואופטימיזציה נרחב נדרש לייצר גבישים באיכות עקיפה. חלבונים שקשה לגבש, כגון חלבונים בממברנה הקשורים בו אי סדר מיסודם נחקרו קלאסי ידי חילופי מימן-דאוטריום (HDX) התמ"ג 5. עם זאת, בעשורים האחרונים, צימוד של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון (ESI-MS) כדי HDX צבר במהירות פופולרית 6, 7.
ספקטרומטריית מסה מציעה פתרוןלרבים המגבלות שמציב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו- NMR. בפרט, MS הוא מאוד רגיש (ננומטר לריכוזים מיקרומטר חובה), ואין כמעט שום מגבלה על גודל החלבון. בנוסף, מחזור העבודה הגבוה של ניתוח MS מאפשר לאפשרות של לימוד חלבונים כפי שהם עוברים מחזור אנזימטי, misfolding, complexation ותהליכים ביולוגיים-רלוונטיים אחרים. תהליכים אלה מתרחשים לעתים קרובות על האלפית השני בקנה המידה שנייה זמן ודורשים ערבוב מהיר של ריאגנטים לפני הניתוח.
התפתחות electrospray יינון זמן לפתור (TRESI) על ידי וילסון Konermann ב 2003 תגובות מותרות להיות במעקב בזמן פסאודו-אמת על ידי ESI-MS. ההתקנה שלהם שולבה מיקסר נימים עם נפח תא תגובת מתכוונן ברציפות 8. המכשיר מורכב משתי נימים קונצנטריים, עם הנימים הפנימיות אטום חריץ וחותכי הצד שלה, כדי לאפשר ערבוב בתוך הבין-קַפִּילָאר הצרמרחב y מן החריץ עד הסוף של הנימים הפנימיות (בדרך כלל 2 מ"מ). כאשר חלים ניסויי HDX, הנימים הפנימיות נושאות את החלבון של עניין, הנימים החיצוניות נושאות את התיוג D 2 O פתרון, אשר ולאחר מכן עובר ערבוב עם החלבון לפני הכניסה לתא תגובת מתכוונן המאפשר תיוג HDX לפני העברה ישירה לתוך ESI מָקוֹר.
בקצרה, HDX מסתמך על מימנים אמידים עמוד שדרה עוברים חילופי עם אטומי דאוטריום בתמיסה 9, 10. חילופי בסיס-המזורז ב- pH הפיזיולוגי, עם-קטליזה חומצה הופכת נפוצה ב- pH מתחת כ 2.6. שער חליפין מבוסס על ארבעה גורמים עיקריים: pH, טמפרטורה, נגישות ממס מליטת מימן intramolecular. כמו שני הגורמים לשעבר נשמרים קבועים לאורך הניסוי, שער הדולר, במיוחד בתפקידים אמיד עמוד השדרה פפטיד, הוא בעיקר dependent על מבנה חלבון 11. בחוזקה אזורים מקופל עם נרחב, רשתות מליטת מימן יציבת סלילים-α ו β-sheets ייקח עד דאוטריום בשיעורים איטיים באופן משמעותי בהשוואת לולאות ואזורים מופרעים (ולפעמים בכלל לא) 12. זה מאפשר ניתוח חלבון הגלובלי, שבו הפרעות במבנה (למשל., על צבירה או מצע מחייב) להוביל שונים ספיג דאוטריום (איור 1).
מיקסר נימי הקינטית ניתן לשלב פלטפורמת microfluidic המכילה תא פרוטאוליטים עבור לוקליזציה של ספיגת דאוטריום. תא פרוטאוליטים זה מתקיים ב- pH הנמוך כדי להרוות את תגובת החליפין אפקטיבי, ומחייב פרוטאז חומצה משותק על מנת לעכל את החלבון לתוך פפטידים מקומיים (איור 2). ניטור חילופי עמוד השדרה בבית אלפית השנייה כדי קשקשים בפעם השנייה הוא חשוב במיוחד עבוראפיון של שינויים מרחביים בתוך קשה לאפיין אזורי לולאה, כדוריות מותכת, וחלבונים מופרעים מיסודם (עקורים) 13, 14. לחלופין, TRESI-HDX יכול לשמש גם כדי לאפיין חלבונים כי כרגע אין מבנה האטום לפתור באמצעות שיטות של קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו- NMR, באמצעות חילופי דאוטריום מצמידים את האלגוריתם קורקס (DX-קורקס) הגישה 15, 16. פרוטוקול מפורט זה יחול TRESI-HDX ללמוד טאו, גידול IDP, הן זה בצורה מקורית כמו גם זה מצב hyperphosphorylated פתוגניים. בעוד טאו ילידים הוא אחד העקור הנחקר ביותר היטב, מעט מאוד ידוע על עמיתו amyloidogenic שלה 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: אנא להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. האדים שנוצרים על ידי אבלציה לייזר של פולי (methacrylate מתיל) (PMMA) יכול להיות רעיל. הקפד כי חרט ליזר מחוברת מערכת אוורור תקין. השתמש בכל נהלי הבטיחות המתאימים בעת בניית מכשיר microfluidic כולל השימוש שולט הנדסה (במנדף, במכל חד) וציוד מגן אישי (משקפי בטיחות, מסיכת פנים, כפפות, חלוק מעבדה, מכנסיים באורך מלאים, נעליים סגורות). זה הוא בעל חשיבות עליונה לשימוש כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) ריאגנטים כיתה במידת האפשר, עם כל היותו של כיתה ACS ומעלה כדי להקטין מזהמים להתערב במהלך הניתוח.
1. הכנת המכשיר microfluidic
- בניית פלטפורמת Microfluidic PMMA
- השג בלוק PMMA סטנדרטי (8.9 x 3.8 x 0.6 ס"מ) לייזר לקטוע ערוץ קלט עבור החדרת חומרים כימיים, A proteoתמס קאמרית, ואת ערוץ הפלט באמצעות חרט לייזר 17, 18.
הערה: Etch חדר proteolysis ב צורה סגלגלה מוארכת (30 x 5 x 0.05 מ"מ). ערוץ הקלט והפלט חייב להאריך עד סוף הבלוק PMMA ו להיות יותר מ 75 מיקרומטר בשני רוחב ועומק על מנת להתאים נימי 30 ga. - חותכים נימי מתכת נירוסטה 30 ga לשתי חתיכות של כ 10 ס"מ כל אחת באמצעות כלי סיבובית עם דיסק 1/64" עבה חתוכים. השתמשו בנייר זכוכית כדי להחליק את הקצוות של הנימים (זו ניתן להקל על ידי הצגת תחת מיקרוסקופ אור).
- ממיסים את הנימים לתוך פולי חרוט (methacrylate מתיל) לחסום באמצעות מלחם. ערוץ הקלט יחובר משאבות מזרק אוטומטיות, ואת ערוץ הפלט ישמש צימוד לתוך MS.
- השג בלוק PMMA סטנדרטי (8.9 x 3.8 x 0.6 ס"מ) לייזר לקטוע ערוץ קלט עבור החדרת חומרים כימיים, A proteoתמס קאמרית, ואת ערוץ הפלט באמצעות חרט לייזר 17, 18.
- בנייה של זרימה רציפה זמן שנפתרה מיקסר קינטי
- השג התמזגונימי זכוכית סיליקה (ID: 75 מיקרומטר, OD: 150 מיקרומטר) של כ 40 ס"מ, ולהכניס אותו לתוך נימי מתכת נירוסטה 28 ga של כ 15 ס"מ. תלוי בזמן התגובה הנדרשת, להשתמש נימי מתכת חיצוניות כבר או אחד עם מזהה גדול.
הערה: קביעת הקוטר הפנימי "האמיתי" של נימי המתכת היא קריטית להשגת זמני תגובה מדויקות. ניתן לעשות זאת על ידי הצמדת נימי המתכת אל HPLC, זורמת ממס למרות הנימים, והקלטת הלחץ בחזרה. Backpressure לחישוב קוטר פנימי יכול להתבצע, ואת הקוטר הפנימי האמיתי של נימי המתכת נקבע. זה יכול להיות מחושב באמצעות תוכנת מחשבון משקל מולקולרי (עבור Windows גרסה 6.49). - הפק חריץ 2 מ"מ באמצעות הגדרות חרט חשמל נמוכות ליזר על קצה אחד של נימי זכוכית הפנימיות לאטום בסוף זה של נימי זכוכית הפנימיות (איור 2). לחלופין, לעשות את החריץ באמצעות קַפִּילָאר זכוכית קרמיתכלי חיתוך y או במטחנה סיבובית עם להב חיתוך עדין.
- קו-עד נימי הזכוכית הפנימיות עם תום נימי המתכת (זה יכול להיות בהנחייתם הצפייה במיקרוסקופ אור).
- צרף מערבל הקינטית הזאת לקצה אחד של טי ערבוב (איור 2).
- צרף נימי זכוכית סיליקה התמזגו (ID: 75 מיקרומטר, OD: 150 מיקרומטר) של כ 40 ס"מ עד הסוף השני של מערבל הקינטית על טי ערבוב. זה משמש כדי לספק חומצה (חומצה אצטית 5%, pH 2.4) כדי להרוות את התגובה.
הערה: שמגיבים שסופקו המכשיר עם מזרקים-הדוק גז דרך צינור polytetrafluoroethylene (PTFE) באמצעות משאבות אינפוזיה אוטומטיות.
- השג התמזגונימי זכוכית סיליקה (ID: 75 מיקרומטר, OD: 150 מיקרומטר) של כ 40 ס"מ, ולהכניס אותו לתוך נימי מתכת נירוסטה 28 ga של כ 15 ס"מ. תלוי בזמן התגובה הנדרשת, להשתמש נימי מתכת חיצוניות כבר או אחד עם מזהה גדול.
- הפעלת פפסין
- תשקלי 20 מ"ג של פפסין מן רירית הקיבה החזיריות להשעות אותו 1 מ"ל של חיץ צימוד (0.1 M פוספט נתרן, 0.15 M NaCl, pH 6.0).
- תשקול 50 מ"ג של -hydroxysuccinimide N (NHS) חרוזי agarose -activated, להוסיף מחדש שלפרוטאז uspended ולסובב בעדינות לילה בשעה 4 ° C.
- ספין למטה XG ב 1000 עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את שרף.
- לשאוב פרוטאז המאוגד.
- דגירה agarose ב 1 מ"ל של חיץ חסימת (1 M Tris-HCl, pH 6.0) ולסובב בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 1 שעה.
- ספין למטה XG ב 1000 עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את שרף.
- לשאוב את חיץ החסימה.
- דגירה agarose-פפסין עם חומצה אצטית 1 מ"ל של 5%, pH 2.4 עבור 5 דקות.
- ספין למטה XG ב 1000 עבור 2 דקות כדי לאסוף את השרף.
- לשאוב supernatant.
- חזור על שלבי 1.3.8 - 1.3.10 עבור סכום כולל של שלושה שוטף.
- אחסן את החרוזים 1 חומצה אצטית מ"ל ב 4 ° C לשימוש לטווח ארוך.
- עצרת Device
- ממלאים את החדר proteolysis עם תרחיף של חרוזים פפסין-agarose מופעל 5% חומצה אצטית בעזרת מרית סטרילי.
- מניחים את platfor microfluidic PMMAמ 'בין שני רחובות PMMA ריק ככיסוי לאטום את המכשיר, מרופדת גומי סיליקון כדי ליצור חותם חזק נוזלי.
- להשתמש בצלחות הידוק מתכתית ללחץ-החותם את המכשיר.
הערה: מהדק נעשה מנהג כדי להתאים את הפלטפורמה microfluidic והוא מורכב משני לוחות מדידת 10.1 ס"מ x 7.4 ס"מ x 1.2 ס"מ. - זרימת 5% חומצה אצטית, pH 2.4 בשיעור של 10 μL / דקה. זרימה חיץ אמוניום אצטט 50 מ"מ (pH 6.9) על פי קו חלבון בשיעור של 1 μL / דקה.
הערה: חשוב מאוד כי חומצה אצטית זורם ברציפות באמצעות המכשיר ברחבי מכלול הניסוי. ודא שאין דליפות וכי הנוזל הוא יציאה רק מערוץ הפלט, אשר ישמש כמקור ESI. - זוג המכשיר עד הסוף מול quadrupole שונה פעם של הטיסה (Q-TOF) ספקטרומטר מסה באמצעות במה מבודדת מתכווננת כדי להשיג תנאים מיטביים electrospray.
הערה: מעקף מתגהוא הציג על מנת לדמות את נוכחותו של מקור ESI מסחרי. 17
Exchange electrospray יינון מימן-דאוטריום 2. זמן נפתרה
- רכישת פפסין וחלבון רק ספקטרה
הערה: רכישה ESI-MS מתבצעת במצב יון חיובי עם מתח של 4500 כדי 5000, 60-V פוטנציאל declustering, ו 250-V התמקדות פוטנציאל. ספקטרה נרכש על פני טווח של 350-1,500 מ '/ z עם קצב סריקה של 1 s -1.- רוכש את הספקטרום רק פפסין. כל פסגות המופיעים בספקטרום זה מופחתים פעם החלבון מתווסף.
- הציגו 50-100 מיקרומטר טאו / phospho-טאו חלבון (לטהר ולהכין כפי שתואר לעיל 13, 19) בשיעור של 1 μL / דקה שבה חיץ אמוניום אצטט 50 מ"מ זרמה בעבר.
- רוכשת חלבון ספקטרום בלבד.
- o רכישהנקודות ו זמן
- בעוד 100 מיקרומטר טאו / phospho-טאו חלבון זורם על 1 μL / דקה, להציג D 2 O בשיעור של 3 μL / min באמצעות מחבר טי ולאפשר להגיב במיקסר הקינטית. אפשר שהמערכת לאזן במשך לפחות 10 דקות לפני הרכישה של הספקטרום.
הערה: לאחר חילופי, התגובה תיוג הוא הרווה ידי זרימת חומצה אצטית pH 2.4 ב 10 μL / min ועיכול של חלבון הנקרא מתרחשת בתא פרוטאוליטים. - על מנת להגדיל את זמן התיוג, ידני למשוך בחזרה את המיקום של נימי זכוכית הפנימיות כדי להשיג ערבוב זמנים של 42 מילים-שניות כדי 8 ים. אפשר שהמערכת לאזן במשך דקות 10 לפחות בין כל גב משיכה.
- בעוד 100 מיקרומטר טאו / phospho-טאו חלבון זורם על 1 μL / דקה, להציג D 2 O בשיעור של 3 μL / min באמצעות מחבר טי ולאפשר להגיב במיקסר הקינטית. אפשר שהמערכת לאזן במשך לפחות 10 דקות לפני הרכישה של הספקטרום.
3. נתונים וניתוח סטטיסטי
- זיהוי פפטידים חישוב אחוז דאוטריום Exchange
- בצעו MS ספקטרום מנתח באמצעות תוכנת mMass, גרסה 5.5.0 20
- זיהוי פפטידים באמצעות שרת proteomic ExPASy FindPept ולאשר ידי (CID) דיסוציאציה המושרה-התנגשות כאשר נדרש 21.
הערה: הנה, התאגדות ספיגה דאוטריום נמדדה באמצעות תוכנת FORTRAN פתחה בתוך הבית לניתוח חלוקת איזוטופי 22, 23. - חשב את השיעורים התיאורטי מהותיים המבוססים על הרצף הראשוני באמצעות כלי האינטרנט SPHERE 22, 24.
- התאם את הנתונים באמצעות רגרסיה לא לינארית יחיד מעריכים לנרמל באמצעות גרפים ותוכנות סטטיסטיות (למשל, SigmaPlot).
הערה: היחס של k int / k OBS מניב את מקדם ההגנה (PF), מדד חצי כמותית של המידה כי באזור מסוים הוא מובנית בתוך אנסמבל קונפורמציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרופילי עיכול של ילידי phospho-טאו היו דומים, מניב כיסוי רצף של 77.1 ו 71.7% בהתאמה. ערכים ספיגים דאוטריום של כל פפטיד נקבעו על ידי התאמת הפצות איזוטופי ציינו עם ההפצות התיאורטיות שנוצרו באמצעות תוכנת FORTRAN פתחה בתוך הבית. התפלגויות ההתאמה האופטימליות מוצגות (איור 3 א) יחד עם הערכים הספיגים דאוטריום קשור. פרופילים הקינטית ספיגים אז נוצרים, ותוארו היטב על ידי הבעות מעריכי יחיד. פרופילים קינטי לכל פפטידים ציינו בזמני תיוג 3 או יותר (n = 3) נותחו. מתאימי מעריכי יחיד אלה לערכים הספיגים ציינו להניב את OBS k הקבוע שער חליפין עבור כל הפפטיד. זאת בהשוואה ל int k תלוי העיקרי-רצף "אקראי סליל" מהותי בקצב קבוע. PF מחושבת (k int / k </ em> OBS) בשעה 1.52 ים ממופה על מבנים נציג טאו יליד hyperphosphorylated (איור 4).
כצפוי, לא PFS נצפה בטווח הקשורים בדרך כלל עם אלמנטי מבנה משניים המאשר כי טאו ילידי מציג מליטת מימן פנימי חלשה. הגנה משמעותית שנצפה בבית N ו- C-טרמיני, התחום המרכזי נוטה-אגרגציה (hexapeptides I ו- II) אזורים (איור 4). אחרי 1.52 ים, 90% של החלבון deuterated, עם חילופי מלא המתרחש תחת 2 דקות.
החלבון המקורי ניתן להשוות מצב שונה, במקרה זה מדינת hyperphosphorylated amyloidogenic, שבו אנו צופים עלייה כללית ספיג דאוטריום פני החלבון. ישנן עליות משמעותיות על N- ו- C-טרמיני באזור H2. העלייה הכללית ספיג תומכת גurrent השערת hyperphosphorylation גורמת חלבון לאמץ מבנה מורחב. מבין שני hexapeptides, H2 מציג את העלייה הגדולה ביותר ספיג דאוטריום, מלהיות אחד האזורים המוגנים ביותר ביותר במדינת הילידים כמעט שום הגנה במדינת hyperphosphorylated. הדבר מצביע כי חשיפה של תחום H2 היא קריטית עבור amyloidogenesis. מצד השני, כמה מהאזורים מציגים ירידה ספיגה לכלול אזורים הפורשים L114 ל Q124, ו G326 ל S352. האזור השני מתאים לאזורי R3 ו R4 הקשורים microtubule בתחום החוזר. זה קטע של מבנה שיורית החדש שנוצר מתאים לממצאי מחקרים קודמים הוכחת כי טאו hyperphosphorylated יש זיקה ירד עבור microtubule מחייב 25. האזור המשתרע L114 ל Q124 מזוהה במדינת הילידים כבעל נטייה משמעותית עבור מבנה סליל, ואת הירידה ספיגה ניתן לייחס שכיחות גבוהה יותר של seco מבנה ndary במדינת hyperphosphorylated.
איור 1. תיאור סכמטי של חלבון עובר HDX לפני ניתוח ספקטרומטריית מסה. החלבון של עניין הוא מדולל לתוך תמיסה של תחמוצת דאוטריום (D 2 O), המאפשר מימני שדרת רָפִיף להחליף עם דאוטריום לאורך זמן. אזורים דינמיים מאוד יחליפו במהירות, והוא חייב להיות תחת פיקוח על אלפית השנייה בקנה מידה בפעם השנייה. אזורים אחרים המכילים מבנים משניים נוקשים יותר יחליפו יותר לאט. תגובת החליפין הוא הופסק על ידי מרווה עם החומצה (pH 2.4), אשר גם יתפתח החלבון המאפשר עיכול עם פרוטאז חומצה (למשל, פפסין). עיכול מתאים את הרמה ספיגה דאוטריום פני תחומים שונים של החלבון. כחוש וגבוה "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ניסיונותיי הגדרה עבור TRESI-HDX-MS. תצוגה מפורטת של מערבל הקינטית מוצגת בתחתית. המיקסר מורכב משתי נימים קונצנטריים, גידול נימי זכוכית סיליקה פנימית התמזגו בתוך נימי מתכת חיצוניות. חריץ נעשה 2 מ"מ מהקצה של הנימים הפנימיות עם סוף לחשמל, המאפשר חלבון כדי לצאת החריץ ומערבב עם דאוטריום נכנסת. מערבל קינטית זו מצורף מטיבת ערבוב. בצד הנגדי של המיקסר, ערוץ אספקת 5% חומצה אצטית (pH 2.4) מצורף. בעקבות מרווה של התגובה, החלבון deuterated עובר דרך תא proteolysis ארוז עם חרוזים פפסין-agarose כדי לייצר פפטידים פפטי. נימי דיסטלי משמשת כמקור ESI.es / ftp_upload / 55,464 / 55464fig2large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
עבודת איור 3. אופיינית מנתונים גולמיים חלקות הקינטית עבור פפטידים נבחרים מתוך חלבון יליד hyperphosphorylated. (א) ספקטרום גלם עבור ארבעה פפטידים (עמודות) מותקן הפצות איזוטופי צפויות לקבוע% של ספיגה דאוטריום בשלוש נקודות זמן שונות (שורות). (ב) נצפתה חלקות הקינטית של ספיגת דאוטריום% לעומת זמן עבור כל פפטיד (קו מוצק) המשמש לחלץ OBS k. חלקות קינטי לכל פפטידים נצפו בזמני תיוג 3 או יותר (n = 3), ברי שגיאה מייצגים SE מחושב "סליל אקראי" פרופיל (קו מקווקו) מוצג לצורך ההשוואה. לשכפל מ Zhu ואח. 8 באישור.אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
נתוני איור 4. HDX מקדם הגנה ממופית על מבני נציג (א) טאו באורך מלא ילידים ו- (ב) טאו hyperphosphorylated. מבנה טאו hyperphosphorylated נוצר באמצעות סימולצית FRODAN עם עידון עוקב באמצעות VADAR. תואר של מקדמי הגנה נצבעים כמו תוכנית rainbow כמוצג האגדה (משמאל). לשכפל מ Zhu ואח. 8 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד שיטות ביולוגיה מבניות כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן ו- NMR הן יתרון משום שהם מספקים מבנים מפורטים מאוד של חלבונים, התמונות האלה הן בדרך כלל סטטי. האפיון של מינים חולפים תחומים מובנים בחולשה ממשיך להיות חמקמק כאשר למדו על ידי השיטות הקונבנציונליות הללו. לכן, על מנת לקבל תובנות דינמיים על סוגים אלה של מערכות חשוב לעבוד בסקלות זמן מהירות. יש לנו ליישם בהצלחה TRESI-HDX-MS להשיג תובנות מפורטות על שינויים מרחביים המתרחשים בתוך IDP למד היטב ברמה peptidic מקומי. אחת מגבלות מפתח טכניקה זו היא כי פפסין הוא פרוטאז נוקב ו, בכוחות עצמו, לעתים רחוק מייצר כיסוי רצף מלא. אחת הדרכים לעזור ולשפר את הכיסוי רצף וספציפיות היא לשלב סוג פרוטאז XIII מ אספרגילוס saitoi לתא העיכול 26.
זה קריטי, כיחדר העיכול נשמר ב- pH של 2.4 במהלך מכלול הניסוי על מנת להרוות את התגובה החילופית ביעילות ולהפחית את הכמות החילופית בחזרה 11. זה הכרחי כי כל צעדי proteolysis וניתוח שלאחר מכן להיעשות כמה שיותר מהר. מחקרים קודמים מותאם לגודל החדר העיכול והציע ספיקות על מנת לשמור על רמת-חליפין חזרה לרמות זניחות (≤5%) בטמפרטורת החדר 22. מומלץ מאוד כי גודל החדר הוא לא יותר גדול הממדים הרשומים בתוך פרוטוקול זה. חלבון מובנים מאוד לא תופסים רמות משמעותיות של דאוטריום על אלפית השנייה בקנה מידה בשנית ויהיה קשה לעכל את הזמן המותר על ידי תא proteolysis. חלבונים מסוג זה אינם מומלצים מחקר באמצעות טכניקה זו.
בעוד אנו ממליצים להשתמש 50 מ"מ אמוניום אצטט חיץ (pH 6.9) עבור tהוא מדגם החלבון, לא כל החלבונים יהיו תואמים עם ריכוז זה או ערך pH. חשוב לציין את PI של חלבון, ולהתאים את החיץ בהתאם, כדי להיות לפחות יחידת pH 1 מעל או מתחת. פעולה זו תבטיח כי חלבון יש את המטען משטח הנדרש הדרושים מתקפלים הולם ולמנוע צבירה. הגדלת הריכוז של אמוניום אצטט מומלץ עבור חלבונים נוטה צבירה כדי להגדיל מסיסות, אולם בריכוזים מעל 500 מ"מ יש להימנע.
TRESI-HDX-MS מוחל הטוב ביותר במערכות מורכבות אזורי לולאה גדולים, כדוריות מותכת, או אלמנטי מבנה משניים חולף 22. בנוסף, ישנם יתרונות כלכליים שונים בטכניקה זו כפי שהיא פשוט וזול יחסית ליישם. לאחרונה, חלה עלייה בשימוש HDX-MS בתעשיית התרופות עבור גילוי ופיתוח תרופות 27. במהלך העשור האחרון מספרs חלה צמיחה מהירה של מקרומולקולות ביולוגיות, ובעיקר נוגדנים חד שבטיים (מבז), שאושרו על ידי ה- FDA. לעומת תרופות מולקולה קטנה, מבנים מסדר גבוה של חלבונים הדינמיקה קונפורמציה שלהם לשחק תפקיד גדול בקביעת יעילות התרופה. HDX-MS שימש בהצלחה ככלי אישור לייצור נוגדנים biosimilar 28, כמו גם את האפיון של אנטיגן נוגדן 29, 30, 31, ו אינטראקציות ליגנד-חלבון 32. התקדמות בפיתוח תוכנה לאוטומציה של ניסויים תאיץ פעמי ניתוח המאפשר רחבה נוספת של טכניקה זו בעתיד הקרוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500 µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
- Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization? Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
- Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
- Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
- Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
- Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
- Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
- Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
- Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
- Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
- Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
- Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
- Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
- Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
- Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
- Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
- Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
- Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
- Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
- Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
- Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
- Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
- Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).
