Summary
Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.
Abstract
Doğası gereği düzensiz proteinler (IDP) dolayı uzun stabil, ikincil yapı elemanlarının eksikliğinden yapısal biyologlar için bir meydan okuma olmuştur. Hidrojen-Döteryum hızlı zaman ölçeklerinde ölçülen değişimi (HDX) yerel toplulukları geçici konformerlerin karakterizasyonu için izin kısaca doldurulur yapılar ve hidrojen bağlayıcı ağları tespit etmek için özel olarak düzenlenmiştir. kütle spektrometresi için HDX Kenetlendirilmesi yüksek hassasiyet, düşük numune tüketimi ve protein boyutu üzerinde hiçbir kısıtlama dahil olmak üzere birçok önemli avantajlar sunmaktadır. Bu teknik milisaniye zaman ölçeğindeki HDX etiketleme kez izlemek için yeteneği dahil olmak üzere, son birkaç on yıl içinde büyük ölçüde ilerlemiştir. Buna ek olarak, bir asidik proteaz mikroreaktör muhafaza eden bir mikro-akışkan bir platform üzerine HDX akışını içeren, biz peptid düzeyinde dinamik özellikleri lokalize edebiliyoruz. Bu çalışmada, Zaman Çözümlemeli Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi (Tresi-MS) HDX wa bağlanmıştau proteininin kalıntı yapısının detaylı bir resmini, hem de hiperfosforilasyon üzerine indüklenen konformasyonel vardiya sağlamak için kullanılır.
Introduction
Son birkaç on yıl içinde, önemli gelişmeler, protein yapısı ve dinamikleri 1, 2, 3, 4 ölçmek için tasarlanmış analitik tekniklerin geliştirilmesi yapılmıştır. X-ışını kristalografisi, protein yapısını belirlemek için başlıca aracı olduğu birlikte, proteinin yüksek konsantrasyonlar gerekmedikçe ve kapsamlı optimizasyon kırılma kalitesi kristalleri üretmek için gereklidir. Bu gibi membran bağlantılı ve doğal olarak düzensiz proteinler olarak kristalize zor olan proteinler, klasik hidrojen döteryum değişimi (HDX) NMR 5 tarafından incelenmiştir. Ancak, son yıllarda, HDX için elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS) kavrama hızla popülerlik 6, 7 kazanmıştır.
Kütle spektrometresi bir çözüm sunarX-ışını kristalografisi ve NMR ile ortaya çıkan kısıtlamalar birçok. Özel olarak, MS, son derece hassas (gerekli uM konsantrasyonlarda nM) 'dir, ve protein boyutuna herhangi bir sınırlama hemen hemen yoktur. Buna ek olarak, MS analizi, yüksek görev döngüsü Enzimatik devir hızı, yanlış katlanması, kompleks ve diğer biyolojik olarak-ilgili işlemleri tabi proteinler üzerinde incelemeler olasılığı sağlar. Bu işlemler, genel olarak ikinci zaman ölçeğine milisaniye ile ortaya çıkar ve analiz öncesinde reaktifler hızlı karıştırma gerekir.
2003 izin reaksiyonlarda Wilson ve Konermann ile Zaman Çözümlemeli Elektrosprey İyonizasyon (Tresi) geliştirilmesi ESI-MS ile sözde-gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Bunların kurulum sürekli ayarlanabilir tepkime haznesi hacmi 8 ile bir kılcal karıştırıcı dahil. Cihaz dar arası kılcal içinde karışmasına olanak sağlamak için sızdırmaz bir iç kılcal ve yan kesilmiş bir çentik ile iki eş merkezli kılcal oluşurİç tel (tipik olarak 2 mm) ucuna çentikten y alanı. HDX deneyler uygulandığında, iç kılcal ilgili proteini taşıyan, dış kılcal etiketleme D'yi daha sonra ESI doğrudan transferi yapılmadan önce HDX etiketleme sağlayan ayarlanabilir bir reaksiyon odasına girmeden önce protein ile karıştırılması uğrar 2 O solüsyonu taşır kaynak.
Kısaca, HDX çözeltisi 9, 10 döteryum atomları ile alışverişi yapılan omurga amid hidrojenlerin dayanır. değişimi baz katalizörlü fizyolojik pH'da, asit katalizi altında, pH yaklaşık 2.6 ile yaygın hale gelmektedir ile. pH, sıcaklık, çözücü erişilebilirlik ve molekül içi hidrojen bağı: değişim oranı, dört ana faktöre dayanır. önceki iki faktör deney, özellikle peptid omurga amid pozisyonlarında değişim oranı boyunca sabit tutulur gibi, esas olarak bağımlı hazırlık olduğuProtein yapısı 11 t. Sıkıca döngüler ve düzensiz bölgelere (ve bazen hiç) 12 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük hızlarda döteryum alacak α-helis ve β-tabaka halinde geniş, stabil hidrojen bağlama ağları ile bölgeleri katlanabilir. Bu küresel protein analizi, izin verdiğinde yapısındaki pertübasyonları (örn., Agregasyon ya da substrat bağlanması üzerine) döteryum edilmektedirler (Şekil 1) farklı yol açar.
Kinetik kılcal karıştırıcı döteryum alımının lokalizasyonu için bir proteolitik bölme ihtiva eden bir mikro-akışkan bir platform içine dahil edilebilir. Bu proteolitik bölme etkili bir değişim reaksiyonu söndürmek için düşük pH değerinde tutulur ve lokalize peptitler (Şekil 2) bir protein sindirimi için hareketsizleştirilmiş bir asit proteazı gerektirir. İkinci kez ölçeklere milisaniye de İzleme omurga değişimi için önemlidirzor olan konformasyonel değişiklikler karakterizasyonu döngü bölgesi, erimiş kürecikler, ve yapısal olarak düzensiz proteinler (IDP) 13, 14 karakterize etmek için. Seçenek olarak ise, Tresi-HDX da Corex algoritması (DX-Corex) yaklaşımı 15, 16 bağlanmış döteryum değişimi kullanılarak, şu anda X-ışını kristalografisi ve NMR yöntemleri ile çözülür atom yapısına sahip olmayan proteinleri karakterize etmek için kullanılabilir. Bu ayrıntılı protokol o patojenik hiperfosforillenmiş eyalet hem de doğal şeklinin yanı var içinde, Tau'yu, IDP çalışma Tresi-HDX uygulanacaktır. Yerli tau en iyi çalışılan IDP'lerin biri olsa da, küçük onun amiloidojenik meslektaşı 13 hakkında bilinmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Kullanmadan önce tüm ilgili güvenlik bilgi formuna (MSDS) başvurun. poli (metil metakrilat), lazer ablasyonunun (PMMA) tarafından üretilen dumanlar toksik olabilir. lazer gravür çalışan bir havalandırma sistemine bağlı olduğundan emin olun. (Gözlük, yüz maskesi, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam boy pantolon galoş) mühendislik kontrolleri (çeker ocak, kavuz konteyner) ve kişisel koruyucu ekipman kullanımı dahil mikroakışkan cihaz bina tüm uygun güvenlik uygulamaları kullanın. Bu mümkün olduğunda, analiz sırasında müdahale kirletici maddelerin azaltılması için ACS derecesi ya da daha yüksek her bir varlık ile, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) seviye reaktif maddeleri büyük önem taşımaktadır.
Mikroakışkan Aygıt 1. Hazırlık
- PMMA mikroakışkan Platformu İnşaat
- bir PMMA-Standart blok (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) elde edilir, maddeleri eklemek için bir proteo bir giriş kanalı lazer ablasyonparçalama bölmesi ve bir lazer gravür 17, 18 kullanarak bir çıkış kanalı.
NOT: uzunlamasına oval bir şekle (30 x 5 x 0.05 mm) içinde proteoliz odası Etch. giriş ve çıkış PMMA blok sonuna kadar devam eder ve 30 ga kılcal yerleştirmek için her iki genişlik ve derinlikte daha büyük olan 75 um olmalıdır. - ., Bir 1/64" kalın kesme diski ile bir döner alet, yaklaşık 10 cm, her biri iki parça halinde bir 30 ga paslanmaz çelik metal kapiler kesin kılcal uçlarının (bu altında incelendiği kolaylaştırılabilir düz zımpara kağıdı kullanarak ışık mikroskobu).
- lehim kullanarak kazınmış poli (metil metakrilat) blok içine kılcal eritin. giriş kanalı otomatik enjektör pompalarının bağlı olacak, ve çıkış MS içine bağlanması için kullanılır.
- bir PMMA-Standart blok (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) elde edilir, maddeleri eklemek için bir proteo bir giriş kanalı lazer ablasyonparçalama bölmesi ve bir lazer gravür 17, 18 kullanarak bir çıkış kanalı.
- Sürekli Akış Zaman Çözülmüş Kinetik Mikser inşaatı
- Bir kaynaşmış Edinmesilika cam kılcal (İD: 75 um, OD: 150 um) yaklaşık olarak 40 cm ve yaklaşık 15 cm arasında bir 28 ga paslanmaz çelik metal boru içine yerleştirin. Gerekli reaksiyon süresine bağlı olarak, daha büyük bir kimliği olan bir uzun dış metal kapiler ya da bir kullanın.
Not: Metal kılcal 'doğru', iç çapı belirlenmesi doğru reaksiyon zamanları elde etmek için kritiktir. Bu kılcal da akan çözücü ve geri basınç, kayıt HPLC metal kılcal bağlanması ile yapılabilir. iç çap hesaplanması için bir karşı basınç yapılabilir ve metal kapiler gerçek iç çapı belirlenmiştir. Bu (Windows Version 6.49 için) Molekül Ağırlığı Hesaplama yazılımı kullanılarak hesaplanabilir. - Iç cam kılcal bir ucunda düşük lazer gücü gravür ayarları kullanılarak bir 2 mm çentik üretmek ve iç cam kılcal (Şekil 2) bu ucunu sızdırmaz. Seçenek olarak ise, bir cam seramik kılcal kullanılarak çentik açmakY kesici alet veya ince bir kesme bıçağı ile bir döner öğütücü.
- Diziliş metal kapiler ucu ile iç cam kılcal (bu, bir ışık mikroskobu altında incelendiği kolaylaştırılabilir).
- Karıştırma T'sinin bir ucunda (Şekil 2), bu kinetik karıştırıcı takın.
- karıştırma T'sinin kinetik karıştırıcının karşı ucuna yaklaşık 40 cm (150 um'lik: 75 um, OD İD) bir kaynaşık silika cam kılcal takın. Bu, reaksiyonun sönmesi için asit (% 5 asetik asit, pH 2.4) sunmak için kullanılır.
Not: Tepkime maddeleri otomatik infüzyon pompaları kullanılarak politetrafloroetilen (PTFE) boru içinden gaz geçirmez şırınga ile cihaza verilir.
- Bir kaynaşmış Edinmesilika cam kılcal (İD: 75 um, OD: 150 um) yaklaşık olarak 40 cm ve yaklaşık 15 cm arasında bir 28 ga paslanmaz çelik metal boru içine yerleştirin. Gerekli reaksiyon süresine bağlı olarak, daha büyük bir kimliği olan bir uzun dış metal kapiler ya da bir kullanın.
- pepsin Aktivasyon
- domuz gastrik mukozadan pepsin 20 mg tartılır ve birleştirme tamponu (0.1 M sodyum fosfat, 0.15 M NaCl, pH 6.0) içinde 1 mL asın.
- N-hidroksisüksinimid (NHS) ile aktive edilen agaroz boncuklar, 50 mg tartılır yeniden s ekleuspended proteaz ve yavaşça gece boyunca 4 ° C 'de döner.
- reçine toplamak için oda sıcaklığında 2 dakika için 1000 x g'de Spin.
- Bağlanmamış proteaz aspire.
- tamponu (1 M Tris-HCI, pH 6.0) ile bloke 1 mL agaroz inkübe ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında yavaşça döner.
- reçine toplamak için oda sıcaklığında 2 dakika için 1000 x g'de Spin.
- Bloklama tamponunu aspire.
- 1 mL% 5 asetik asit, 5 dakika boyunca, pH 2.4 ile pepsin agaroz inkübe edin.
- reçine toplamak için 2 dakika süreyle 1000 x g'de Spin.
- Süpernatant aspire.
- Üç yıkama olmak üzere toplam 1.3.10 - Tekrar 1.3.8 adımları tekrarlayın.
- Uzun süreli kullanım için 4 ° C'de 1 mL asetik asit içerisinde boncuk saklayın.
- Cihaz Montaj
- steril bir spatula kullanılarak% 5 asetik asit içerisinde aktif pepsin-agaroz boncuklarının bulamaç ile proteoliz odası doldurun.
- PMMA mikroakışkan platfor yerleştirincihazın kapatılması için bir kapak olarak iki boş PMMA blokları arasında m, sıvı sızdırmaz bir conta oluşturmak için silikon kauçuk ile kaplı.
- basınç conta cihazı metalik sıkıştırma plakaları kullanın.
Not: kelepçe özel mikroakışkan platformu uyacak şekilde yapılmış ve 10.1 cm x 7.4 cm x 1.2 cm boyutunda iki levha oluşmaktadır. - 10 uL / dakikalık bir hızda,% 5 asetik asit, pH 2.4 akış. 1 uL / dakikalık bir oranda protein hattı da 50 mM amonyum asetat tamponu (pH 6.9) Akış.
NOT: asetik asit sürekli olarak deney tamamı boyunca cihaz üzerinden akan son derece önemlidir. hiçbir sızıntı ve sıvının ESI kaynağı olarak hizmet edecek bir çıkış kanalı, yalnızca çıkan emin olun. - Çift uygun elektrosprey koşulları elde etmek için ayarlanabilir bir izole edilmiş aşama kullanılarak bir tadil edilmiş bir dört kat time-of-flight (Q-TOF) kütle spektrometresi ön ucuna cihazı.
NOT: Bir baypas anahtarıticari bir ESI kaynağı varlığını taklit etmek amacıyla ilave edilir. 17
2. süre-çözülmüş Elektrosprey İyonizasyon Hidrojen döteryum Değişim
- Pepsin kazanılması ve Protein Sadece Spectra
Not: ESI-MS satın 60 V declustering potansiyeli +5,000 için +4,500 bir gerilim ile pozitif iyon modunda gerçekleştirilir ve 250 V potansiyel odaklama. Spektrumlar 1 sn'lik bir tarama oranıyla, tarandı 350-1,500, m / z aralığı üzerinde elde edilir -1.- bir pepsin tek spektrumunu elde edin. Protein eklendikten sonra bu spektrumun görünen herhangi bir tepe noktaları çıkartılır.
- 50 mM amonyum asetat tamponu, daha önce akan 1 uL / dakikalık bir oranda 50-100 uM tau / fosfo-tau proteinini (19 arındırmak ve daha önce 13 tarif hazırlandı) tanıtılması.
- bir proteini ancak spektrum elde edin.
- Toplama of Zaman Noktaları
- 100 uM tau / fosfo-tau proteini 1 uL / dakika ile akarken, bir T konektörü yoluyla 3 mL / dakikalık bir oranda D2O tanıtmak ve kinetik karıştırıcıda reaksiyona girmesine izin. spektrumun elde edilmesinden önce en az 10 dakika boyunca dengeye kavuşmaları için sistem için izin verir.
Not: değiştirmenin ardından, etiketleme reaksiyonu etiketlenmiş proteinin 10 uL / dakikada, asetik asit ile pH 2.4 akışı ve sindirimi ile söndürülür proteolitik bölme oluşur. - El, etiketleme süresini artırmak 8 s 42 ms'lik karıştırma süreleri elde etmek için iç cam kılcal konumunu geri çekmek için. Her bir çekme arka tarafı arasında en az 10 dakika boyunca dengeye kavuşmaları için sistem için izin verir.
- 100 uM tau / fosfo-tau proteini 1 uL / dakika ile akarken, bir T konektörü yoluyla 3 mL / dakikalık bir oranda D2O tanıtmak ve kinetik karıştırıcıda reaksiyona girmesine izin. spektrumun elde edilmesinden önce en az 10 dakika boyunca dengeye kavuşmaları için sistem için izin verir.
3. Veri ve İstatistiksel Analiz
- Peptitler belirlenmesi ve Döteryum Borsası yüzdesi hesaplanması
- MS spektrumları mMass yazılımı kullanılarak analiz sürüm 5.5.0 20 gerçekleştir
- ExPASy FindPept proteomik sunucusu kullanarak peptidleri belirlemek ve 21 gerektiği zaman çarpışma neden olduğu ayırma (CID) tarafından teyit etmektedir.
NOT: Burada, döteryum alımı dahil izotop dağıtım analizi 22, 23 için bir in-house geliştirilen FORTRAN yazılımı kullanılarak ölçüldü. - KÜRE web aracı 22, 24 kullanılarak primer dizisine dayanan teorik özgül oranlarını hesaplayın.
- Tek bir üstel lineer olmayan regresyon kullanılarak veri monte edin ve bir grafik ve istatistiksel yazılım (örneğin, SigmaPlot) kullanılarak normalize.
Not: oranı k int / k gözlenen koruma Faktörü (PF), belirli bir bölge yapısal topluluk içinde yapılandırılmıştır derece bir yarı-nicel ölçümünü verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
doğal ve fosfo-tau sindirim profilleri, sırasıyla 77.1 ve 71.7% sekans kapsama hasıl benzerdi. Her bir peptidin Döteryum alım değerleri, bir in-house geliştirilen FORTRAN yazılımı kullanılarak üretilen teorik dağılımların ile gözlenen izotopik dağılımları uydurulması ile belirlendi. En uygun dağılımlar ilişkili döteryum alım değerleri ile birlikte (Şekil 3a) 'da gösterilmiştir. Alım kinetik profiller daha sonra oluşturulacak ve de tek bir üstel ifadelerle tarif edilmiştir. 3 ya da daha fazla markalama zamanlarda gözlenen tüm peptidler için kinetik profiller (n = 3) analiz edilmiştir. Gözlenen alım değerleri bu tek bir üslü uyan her bir peptit için kuru sabiti k obs verir. Bu primer sekans bağımlı "gelişigüzel kıvrımlı" içsel Hız sabiti k int karşılaştırılır. Hesaplanan PF (k int / k </ 1.52 s em> obs), doğal ve hiperfosforile tau (Şekil 4) temsili yapılara üzerine eşlenir.
Beklendiği gibi, Fişleri normal olarak doğal tau zayıf hidrojen bağları sergilediğini teyit ikincil yapı elemanları ile bağlantılı aralıkta gözlenmiştir. Belirgin bir koruma ve C-termini, merkezi alan ve agregasyon eğilimli (hekzapeptitleri I ve II) bölgeleri (Şekil 4) görülmektedir. 1.52 s sonra, protein,% 90 dolu değişimi 2 dakika altında meydana gelen, döterlenmiş edilir.
doğal protein bu durumda, değişmiş bir duruma biz protein karşısında döteryum alımında genel bir artış gözlemlemek amiloidojenik hiperfosforillenmiş devlet, karşılaştırılabilir. N- ve C-termınalınde ve H2 bölgede önemli bir artış söz konusudur. alımında genel artış c desteklerhiperfosforilasyonunun uzatılmış bir yapıya benimsemek proteini neden olan hipotezini eçerli. İki hexapeptides ki, H2 hiperfosforillenmiş halde neredeyse hiç korunma yerli halde en çok korunan bölgelerinden biri olmasının yanı sıra döteryum alımında büyük artış göstermektedir. Bu H2 etki alanının poz amiloidojenez için kritik olduğunu göstermektedir. Öte yandan, alımının düşmesine sergileyen alanlardan bazıları S352 için Q124 için L114 ve G326 kapsayan bölgeler bulunur. ikinci bölge tekrar alanı mikrotübül-bağlantılı R3 ve R4 bölgelerine karşılık gelir. Yeni oluşan kalıntı yapının bu gerilme önceki çalışmalar hiperfosforile tau mikrotübül 25 bağlanması için bir azalma afiniteye sahip olduğunu ortaya koyan kabul eder. Q124 için L114 yayılma bölgesi sarmal yapı için önemli bir yatkınlığı bulunan doğal halde tespit edilir ve alımında azalma Seco daha yaygın atfedilebilir hiperfosforile halde ndary yapısı.
Önceki kütle spektrometre analizi için HDX gören bir proteinin 1 şematik bir tasvirini, Şekil. Ilgilenilen protein kararsız omurga hidrojen zamanla döteryum ile yer değiştirmeye izin veren, döteryum oksit (D 2 O) içindeki bir çözeltisi içine seyreltilir. Son derece dinamik bölgeler hızla alışverişinde bulunacaklar ve ikinci kez ölçeğine milisaniye üzerinde izlenmesi gerekir. daha katı sekonder yapılar içeren diğer bölgeler daha yavaş değişim olacaktır. Değiştirme reaksiyonu, aynı zamanda, bir asit proteaz (örn pepsin) ile sindirme sağlayan protein izlerken asit (pH 2.4), ile söndürülmesi ile sonlandırılır. Sindirim proteinin farklı alanları arasında döteryum kazanma düzeyini lokalize. sıska "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tresi-HDX-MS için Şekil 2. Deneysel Açıklama. Kinetik karıştırıcının ayrıntılı bir görünüşüdür alt kısmında gösterilir. Karıştırıcı, iki eş merkezli kılcal, bir dış metal kapiler içinde bir iç erimiş silis cam kapiller oluşmaktadır. Bir çentik çentik çıkıp gelen döteryum ile karıştırmak için protein sağlayan, bir takılı ucu ile iç kılcal ucundan 2 mm yapılır. Bu kinetik karıştırıcı, bir karıştırma T'sinin bağlanmıştır. Mikserin karşı tarafında,% 5 asetik asit verilmesi, bir kanal (pH 2.4) eklenmiştir. Reaksiyonun söndürülmesi sonra, döteryumlanmış proteini peptik peptidleri üretmek üzere pepsin-agaroz taneleri ile dolu proteoliz odası içinden geçer. Distal kılcal bir ESI kaynağı olarak kullanılır.es / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
Doğal ve hiperfosforile proteinden seçilen peptidler için kinetik parsellere ham verilerden Şekil 3. Tipik iş akışı. Dört peptitler (sütun) (a) Ham spektrumu üç farklı zaman noktalarında (satırlar) döteryum alımının% belirlemek için tahmin edilen izotopik dağılımları takılmıştır. (B) her bir peptit (katı çizgi) için zamana göre% döteryum alımının kinetik araziler Gözlemlenen k obs özünü çıkarmak için kullanılır. Tüm peptitler için kinetik grafikleri 3 ya da daha fazla markalama kez gözlenmiştir (n = 3), hata çubukları SE hesaplanan "gelişigüzel kıvrımlı" profil (noktalı çizgi) karşılaştırma için gösterilmiştir temsil eder. Zhu ve ark çoğaltılmıştır. Izni ile 8.Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. HDX koruma faktörü verileri (a), doğal, tam uzunluktaki tau'nun ve (b) hiperfosforile tau temsili yapılara üzerine eşlenir. aşırı fosforile tau yapısı Vadar kullanılarak müteakip arıtma ile FRODAN simülasyon kullanılarak oluşturulmuştur. Legend (sol) 'de gösterildiği gibi koruyucu faktörler derecesi bir gökkuşağı düzeni olarak renklendirilir. Zhu ve ark çoğaltılmıştır. Izni ile 8. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
bu proteinlerin son derece ayrıntılı yapılar sağladığı için, X-ışını kristalografisi ve NMR gibi yapısal biyoloji yöntemleri avantajlı olmakla birlikte, bu resimler genellikle statiktir. Geçici türler ve zayıf yapılı alanların karakterizasyonu Bu geleneksel yöntemlerle çalışılan zaman zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu tip sistemlerde dinamik analizler elde etmek için hızlı zaman ölçeklerinde çalışmak önemlidir. Biz başarıyla lokalize peptidik düzeyde iyi çalışılmış IDP içinde oluşan yapısal değişikliklere ilişkin ayrıntılı bilgiler edinmek için Tresi-HDX-MS uyguladık. Bu tekniğin anahtarı sınırlamalar biri pepsin belirli olmayan ve proteaz olmasıdır ve kendi başına, nadiren tam sırası kapsama üretir. Dizisi kapsamı ve özgüllüğünü geliştirmek yardımcı olacak bir yöntemdir sindirim bölmesi 26 Aspergillus saitoi'den proteaz tip XIII birleştirmektir.
O kritiktirsindirim odasının etkin değişim reaksiyonu söndürmek ve arka değişimi 11 miktarını azaltmak amacıyla, deneme tamamını sırasında 2.4 bir pH değerinde muhafaza edilir. Herhangi proteoliz basamaklar ve daha sonraki analizler mümkün olduğunca çabuk yapılması zorunludur. Daha önceki çalışmalar sindirim odasının büyüklüğü optimize edilmiş ve oda sıcaklığında 22 de ihmal edilebilir seviyelere (≤5%) geri-değişim düzeyini tutmak için debilerini sürmüşlerdir. Kuvvetle odasının boyutu bu protokol dahilinde listelenen boyutlardan daha büyük değildir önerilir. Bir çok yapısal proteini, ikinci zaman ölçeğine milisaniye ile döteryum önemli seviyelerde almayacaktır ve proteoliz odası tarafından izin verilen sindirimi zor olacaktır. Bu tür proteinler bu tekniği kullanarak çalışma için tavsiye edilmez.
Biz t, 50 mM amonyum asetat tamponu (pH 6.9) kullanımı tavsiye ederkeno protein numunesi, tüm proteinlerin bu konsantrasyonda ya da pH değeri ile uyumlu olacaktır. Proteinin pl not edin ve tampon buna göre yukarıda veya aşağıda, en az 1 pH birimi olacak ayarlamak için önemlidir. Bu protein, uygun katlanma için gereken gerekli bir yüzey yüküne sahip olmasını sağlamak ve toplanmasını önler. amonyum asetat konsantrasyonunun arttırılması, ancak mM kaçınılması için 500 üzerinde konsantrasyonlar, çözünürlüğü arttırmak için topaklaşmaya yatkın proteinler için tavsiye edilir.
Tresi-HDX-MS iyi büyük döngü bölgelerinde erimiş globüller veya geçici ikincil yapı elemanları 22 oluşan sistemlere uygulanır. basit ve uygulanması nispeten ucuz olduğu için ek olarak, bu teknikle çeşitli ekonomik avantajlar vardır. Son zamanlarda, ilaç keşfi ve geliştirilmesi 27 için farmasötik endüstrisinde HDX-MS kullanımında büyük bir artış olmuştur. Son birkaç on yıl içindeBiyolojik makromoleküllerin hızlı bir artış olmuştur s, özellikle monoklonal antikorlar (mAb'ler), FDA tarafından onaylanan. küçük moleküllü ilaçlar ile karşılaştırıldığında, daha yüksek dereceli proteinlerin yapı ve yapısal dinamikleri ilaç etkinliğinin belirlenmesinde önemli bir rol oynar. HDX-MS başarılı bir şekilde Biyobenzer antikorların 28 üretilmesi için bir onaylama aracı, aynı zamanda, antikor-antijen 29, 30, 31, ve protein-ligand etkileşimleri 32 karakterizasyonu olarak kullanılmıştır. yazılım geliştirme ve deney otomasyonu gelişmeler yakın gelecekte bu tekniğin daha da genişlemesi için izin analiz sürelerini hızlandırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500 µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
- Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization? Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
- Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
- Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
- Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
- Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
- Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
- Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
- Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
- Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
- Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
- Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
- Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
- Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
- Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
- Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
- Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
- Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
- Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
- Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
- Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
- Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
- Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).
