Summary
flexibilidad conformacional desempeña un papel crítico en la función de la proteína. En este documento, se describe el uso de la espectrometría de masas de ionización por electrospray resuelta en el tiempo junto con el intercambio de hidrógeno-deuterio para sondear los rápidos cambios estructurales que impulsan función en proteínas ordenadas y desordenadas.
Abstract
proteínas intrínsecamente desordenados (PDI) han sido durante mucho tiempo un reto para los biólogos estructurales debido a su falta de elementos de estructura secundaria estables. El hidrógeno-deuterio Exchange (HDX) medida en escalas de tiempo rápidas es especialmente adecuado para detectar estructuras y redes de enlaces de hidrógeno que están pobladas brevemente, lo que permite la caracterización de confórmeros transitorios en conjuntos nativos. El acoplamiento de HDX a espectrometría de masas ofrece varias ventajas clave, incluyendo una alta sensibilidad, bajo consumo de muestra y sin restricción en el tamaño de la proteína. Esta técnica ha avanzado mucho en las últimas décadas, incluyendo la capacidad de supervisar HDX tiempos de etiquetado en la escala de tiempo de milisegundos. Además, mediante la incorporación del flujo de trabajo HDX en una plataforma de microfluidos que aloja un microreactor proteasa ácida, somos capaces de localizar propiedades dinámicas en el nivel de péptido. En este estudio, resuelta en el tiempo de ionización por electrospray espectrometría de masas (tresi-MS) acoplado a HDX was utiliza para proporcionar una imagen detallada de la estructura residual en la proteína tau, así como los cambios conformacionales inducidos en la hiperfosforilación.
Introduction
Durante las últimas décadas, los avances se han hecho importantes en el desarrollo de técnicas analíticas diseñadas para medir la estructura de la proteína y la dinámica de 1, 2, 3, 4. Mientras que la cristalografía de rayos X sigue siendo la herramienta principio para la determinación de la estructura de proteínas, se necesitan altas concentraciones de proteína y se requiere una amplia optimización para producir cristales de calidad de difracción. Las proteínas que son difíciles de cristalizar, tales como proteínas asociadas a la membrana y intrínsecamente desordenadas clásicamente se han estudiado por intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX) RMN 5. Sin embargo, en las últimas décadas, el acoplamiento de ionización por electrospray espectrometría de masas (ESI-MS) para HDX ha ganado rápidamente popularidad 6, 7.
Espectrometría de masas ofrece una solucióna muchas de las restricciones planteados por cristalografía de rayos X y RMN. En particular, MS es altamente sensible (nM a concentraciones mu M se requiere), y prácticamente no hay límite en el tamaño de la proteína. Además, el ciclo de trabajo alto de análisis MS permite la posibilidad de estudiar proteínas que sean sometidos a rotación enzimática, mal plegamiento, formación de complejos y otros procesos biológicamente relevantes. Estos procesos ocurren a menudo en el milisegundo a segunda escala de tiempo y requieren un mezclado rápido de los reactivos antes del análisis.
El desarrollo de resuelta en el tiempo de ionización por electrospray (tresi) por Wilson y Konermann en 2003 reacciones se permite monitorizar en tiempo real mediante la pseudo-ESI-MS. Su configuración incorpora un mezclador capilar con un volumen de cámara de reacción continuamente ajustable 8. El dispositivo consta de dos capilares concéntricos, con el capilar interior sellado y una muesca cortada en su lado para permitir la mezcla dentro de la estrecha inter-capillary el espacio de la muesca en el extremo del capilar interior (típicamente 2 mm). Cuando se aplica a experimentos HDX, el capilar interior lleva la proteína de interés, el capilar exterior lleva el etiquetado D2O solución, que sufre a continuación la mezcla con la proteína antes de entrar en la cámara de reacción ajustable que permite para el etiquetado HDX antes de la transferencia directa en el ESI fuente.
Brevemente, HDX se basa en hidrógenos amida de cadena principal sometidos a intercambio con átomos de deuterio en solución 9, 10. El intercambio es catalizada por bases a pH fisiológico, con ácido-catálisis convertirse en predominante a pH por debajo de aproximadamente 2,6. La tasa de cambio se basa en cuatro factores principales: pH, temperatura, disolvente accesibilidad y de enlace de hidrógeno intramolecular. Como los dos primeros factores se mantienen constantes durante todo el experimento, la tasa de cambio, en particular en las posiciones de amida del esqueleto peptídico, es principalmente dependent en la estructura de proteínas 11. Bien doblado regiones con extensas redes de enlaces de hidrógeno, estables en alfa-hélices y láminas beta se llevará hasta deuterio a velocidades sustancialmente más lento en comparación con los bucles y las regiones desordenadas (y, a veces no en todos) 12. Esto permite el análisis de proteína global, donde las perturbaciones en la estructura (por ejemplo., Sobre la agregación o de unión al sustrato) conducen a diferentes captación de deuterio (Figura 1).
El mezclador capilar cinética puede ser incorporado en una plataforma de microfluidos que contiene una cámara proteolítica para la localización de la captación de deuterio. Esta cámara proteolítica se lleva a cabo a pH bajo con el fin de apagar efectivamente la reacción de intercambio, y requiere una proteasa ácida inmovilizada con el fin de digerir la proteína en péptidos localizados (Figura 2). Supervisión de Exchange columna vertebral en milisegundos a escalas segunda vez es especialmente importante para lacaracterización de cambios conformacionales dentro de difícil caracterizar regiones de bucle, glóbulos fundidos, y proteínas intrínsecamente desordenadas (PDI) 13, 14. Alternativamente, tresi-HDX también se puede utilizar para caracterizar las proteínas que actualmente no tienen una estructura atómica resuelto a través de los métodos de cristalografía de rayos X y RMN, usando intercambio de deuterio acoplado al algoritmo de COREX (DX-COREX) enfoque 15, 16. Este protocolo detallado se aplicará tresi-HDX para estudiar tau, un desplazado interno, tanto en su forma nativa, así como su estado hiperfosforilada patógeno. Mientras que la TAU nativa es una de las PDI más bien estudiado, se sabe poco sobre su contraparte amiloidogénica 13.
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Protocol
NOTA: Por favor, consultar a todas las hojas de datos de seguridad (MSDS) antes de usar. Los humos producidos por ablación con láser de poli (metacrilato de metilo) (PMMA) pueden ser tóxicos. Asegúrese de que el grabador láser está conectado a un sistema de ventilación de trabajo. Utilice todas las prácticas de seguridad adecuadas en la construcción del dispositivo microfluídico incluyendo el uso de los controles de ingeniería (campana de humos, contenedor de objetos punzantes) y el equipo de protección personal (gafas de seguridad, mascarilla, guantes, ropa de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados). Es de suma importancia para usar cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) los reactivos de grado cuando sea posible, con todo ser de grado ACS o superior para disminuir los contaminantes que interfieren durante el análisis.
1. Preparación del dispositivo de microfluidos
- La construcción de la plataforma de microfluidos PMMA
- Obtener un bloque PMMA estándar (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) y láser de ablación de un canal de entrada para la introducción de los reactivos, un proteolisis de cámara, y un canal de salida utilizando un grabador láser 17, 18.
NOTA: Etch la cámara de la proteolisis en una forma oval alargada (30 x 5 x 0,05 mm). El canal de entrada y de salida debe extenderse hasta el extremo del bloque de PMMA y ser mayor de 75 m de anchura y profundidad con el fin de acomodar un capilar de 30 ga. - Cortar un acero inoxidable capilar de metal 30 ga en dos piezas de aproximadamente 10 cm cada uno utilizando una herramienta rotativa con un disco de corte 1/64" de espesor. Utilice papel de lija para suavizar los extremos de los capilares (esto puede facilitarse mediante la visualización bajo una microscopio de luz).
- Fundir los capilares en el poli grabado al agua fuerte (metacrilato de metilo) de bloque utilizando un soldador. El canal de entrada se conectará a bombas de jeringa automatizados, y el canal de salida se utiliza para el acoplamiento en la MS.
- Obtener un bloque PMMA estándar (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) y láser de ablación de un canal de entrada para la introducción de los reactivos, un proteolisis de cámara, y un canal de salida utilizando un grabador láser 17, 18.
- La construcción del mezclador Kinetic Resuelta en tiempo Flujo Continuo
- Obtener una fusionadocapilar de sílice de vidrio (ID: 75! m, OD: 150 m) de aproximadamente 40 cm, y la inserta en un acero inoxidable capilar de metal 28 ga de aproximadamente 15 cm. Dependiendo del tiempo de reacción requerido, usar un capilar de metal exterior más largo o uno con un ID más grande.
NOTA: Determinar el diámetro interior 'verdadero' del capilar de metal es crítico para la obtención de tiempos de reacción precisas. Esto se puede hacer conectando el capilar de metal a una HPLC, que fluye disolvente aunque el capilar, y el registro de la presión de retorno. Una contrapresión para el cálculo del diámetro interior se puede hacer, y el verdadero diámetro interior del capilar de metal determinado. Esto se puede calcular usando el software Molecular Weight Calculator (para Windows Versión 6.49). - Producir una muesca 2 mm utilizando la configuración grabador láser de baja potencia en un extremo del capilar de vidrio interior y sellar este extremo del capilar de vidrio interior (Figura 2). Alternativamente, hacer la muesca usando un capilar de vidrio cerámicoherramienta de corte Y o un molino rotatorio con una cuchilla de corte fino.
- Line-up el capilar de vidrio interior con el extremo del capilar de metal (esto se puede facilitar mediante la visualización bajo un microscopio de luz).
- Fije este mezclador cinética a un extremo de la te de mezcla (Figura 2).
- Adjuntar un capilar fundido de vidrio de sílice (ID: 75! M, OD: 150 m) de aproximadamente 40 cm hasta el extremo opuesto de la mezcladora cinética en la te de mezcla. Esto se utiliza para entregar ácido (ácido acético al 5%, pH 2,4) para extinguir la reacción.
NOTA: Los reactivos se suministran al dispositivo con jeringas de gas hermética a través de un tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) usando bombas de infusión automatizadas.
- Obtener una fusionadocapilar de sílice de vidrio (ID: 75! m, OD: 150 m) de aproximadamente 40 cm, y la inserta en un acero inoxidable capilar de metal 28 ga de aproximadamente 15 cm. Dependiendo del tiempo de reacción requerido, usar un capilar de metal exterior más largo o uno con un ID más grande.
- La activación de la pepsina
- Pesar 20 mg de pepsina de mucosa gástrica porcina y suspenderlo en 1 ml de tampón de acoplamiento (fosfato sódico 0,1 M, 0,15 M NaCl, pH 6,0).
- Pesar 50 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) perlas de agarosa activados por, añadir a la re-sproteasa uspended y gire suavemente durante la noche a 4 ° C.
- Centrifugar a 1.000 xg durante 2 min a temperatura ambiente para recoger la resina.
- Aspirar la proteasa no unido.
- Incubar la agarosa en 1 ml de tampón de bloqueo (1 M Tris-HCl, pH 6,0) y gire suavemente a temperatura ambiente durante 1 h.
- Centrifugar a 1.000 xg durante 2 min a temperatura ambiente para recoger la resina.
- Aspirar el tampón de bloqueo.
- Incubar la pepsina-agarosa con ácido acético 1 ml de 5%, pH 2,4 durante 5 min.
- Centrifugar a 1.000 xg durante 2 min para recoger la resina.
- Aspirar el sobrenadante.
- Repita los pasos 1.3.8 - 1.3.10 para un total de tres lavados.
- Almacenar las perlas en 1 ml de ácido acético a 4 ° C para su uso a largo plazo.
- Asamblea dispositivo
- Llene la cámara de la proteolisis con la suspensión de perlas de pepsina-agarosa activadas en ácido acético al 5% usando una espátula estéril.
- Coloque el platfor microfluidos PMMAm en entre dos bloques de PMMA en blanco como una cubierta para sellar el dispositivo, revestido con caucho de silicona para crear un sello estanco a los líquidos.
- Usar placas de sujeción metálico a la presión de sellado en el dispositivo.
NOTA: La abrazadera fue hecho a medida con el fin de adaptarse a la plataforma de microfluidos y se compone de dos placas de medición 10.1 cm x 7.4 cm x 1.2 cm. - El flujo de ácido acético al 5%, pH 2,4 a una velocidad de 10 l / min. El flujo mM de tampón de acetato de amonio 50 (pH 6,9), aunque la línea de proteína a una velocidad de 1 l / min.
NOTA: Es muy importante que el ácido acético fluye continuamente a través del dispositivo a lo largo de la totalidad del experimento. Asegúrese de que no hay fugas y que el fluido está saliendo sólo desde el canal de salida, que servirá como la fuente ESI. - Acoplar el dispositivo al extremo frontal de un espectrómetro modificado cuadrupolo tiempo de vuelo (Q-TOF) de masas usando una fase aislamiento ajustable para conseguir condiciones de electrospray óptimos.
NOTA: Un interruptor de derivaciónse introduce con el fin de simular la presencia de una fuente ESI comercial. 17
2. Intercambio de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio resuelta en el tiempo
- Adquisición de pepsina y Proteína Sólo Spectra
NOTA: adquisición ESI-MS se lleva a cabo en el modo de ion positivo con un voltaje de 4.500 hasta 5.000, 60-V potencial desagrupación, y 250-V potencial de enfoque. Los espectros se adquirieron en un intervalo de 350-1,500 m / z con una velocidad de barrido de 1 s -1.- Adquirir una única espectro de pepsina. Cualquier picos que aparecen en este espectro se restan una vez que se añade la proteína.
- Introducir 50-100 M tau / proteína fosfo-tau (purificar y preparar como se ha descrito previamente 13, 19) a una velocidad de 1 l / min en el que el tampón de acetato de amonio 50 mM fluía anteriormente.
- Adquirir una proteína única espectro.
- adquisición oPuntos f Tiempo
- Mientras que la proteína 100 M tau / fosfo-tau está fluyendo a 1 l / min, introducir D 2 O a una velocidad de 3 l / min a través de un conector tee y dejar reaccionar en el mezclador cinética. Permitir que el sistema se equilibre durante al menos 10 min antes de la adquisición del espectro.
NOTA: Después del intercambio, la reacción de marcaje se inactiva por el flujo de pH ácido acético 2,4 a 10 l / min y la digestión de la proteína marcada se produce en la cámara proteolítica. - Con el fin de aumentar el tiempo de etiquetado, manualmente tire hacia atrás de la posición del capilar de vidrio interior para lograr tiempos de 42 ms de mezcla a 8 s. Permitir que el sistema se equilibre durante al menos 10 min entre cada pull-back.
- Mientras que la proteína 100 M tau / fosfo-tau está fluyendo a 1 l / min, introducir D 2 O a una velocidad de 3 l / min a través de un conector tee y dejar reaccionar en el mezclador cinética. Permitir que el sistema se equilibre durante al menos 10 min antes de la adquisición del espectro.
3. Los datos y análisis estadístico
- La identificación de péptidos y calculando el porcentaje de deuterio intercambio
- Realizar análisis de espectros de MS utilizando el software mMass, versión 5.5.0 20
- Identificar péptidos utilizando el servidor de proteómica ExPASy FindPept y confirmar por disociación inducida por colisión (CID) cuando se requiera 21.
NOTA: Aquí, la incorporación de deuterio absorción se midió utilizando un software FORTRAN en-casa desarrollado para el análisis de distribución isotópica 22, 23. - Calcular las tasas intrínsecas teóricos basados en la secuencia primaria mediante la herramienta web SPHERE 22, 24.
- Ajustar los datos usando regresión no lineal exponencial único y normalizar usando una gráfica y software estadístico (por ejemplo, SigmaPlot).
NOTA: La relación de k int / k obs produce el Factor de Protección (PF), una medida semi-cuantitativa del grado de que una región particular, está estructurado dentro del conjunto conformacional.
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Representative Results
perfiles de digestión de nativo y fosfo-tau fueron similares, produciendo una secuencia de cobertura de 77,1 y 71,7%, respectivamente. valores de captación de deuterio de cada péptido se determinó mediante el ajuste de las distribuciones isotópicas observadas con las distribuciones teóricas generadas usando un software FORTRAN de desarrollo propio. Las mejores distribuciones de ajuste se muestran (Figura 3a), junto con los valores de captación de deuterio asociados. perfiles cinéticos de captación continuación se generan, y estaban bien descritos por expresiones exponenciales individuales. perfiles cinéticos para todos los péptidos observados a los 3 o más veces de etiquetado (n = 3) fueron analizados. Estos ajustes exponenciales individuales a los valores de captación observados producen el tipo de cambio constante k obs para cada péptido. Esto se compara con el dependiente "espiral al azar" tasa intrínseca constante k int-secuencia primaria. El PF calculado (k int / k </ em> obs) a 1,52 s se correlaciona con estructuras representativas de tau nativa y hiperfosforilada (Figura 4).
Como era de esperar, no se observaron PFs en la gama normalmente asociada con elementos de estructura secundaria que confirman que tau nativa exhibe débil enlace de hidrógeno interno. Protección significativa se observa en el extremo N y C-terminales, el dominio central y las de agregación propensa (hexapéptidos I y II) regiones (Figura 4). Después de 1,52 s, el 90% de la proteína se deuterado, con intercambio completo se produce en menos de 2 min.
La proteína nativa se puede comparar a un estado alterado, en este caso el estado hiperfosforilada amiloidogénica, donde observamos un aumento general en la absorción de deuterio a través de la proteína. Hay incrementos significativos en los extremos N y C-terminales y en la región H2. El aumento general en la absorción apoya la cACTUAL hipótesis de que la hiperfosforilación de la proteína hace que la adopción de una estructura extendida. De los dos hexapéptidos, H2 muestra el mayor aumento en la captación de deuterio, de ser una de las regiones más altamente protegidas en el estado nativo a casi ninguna protección en el estado hiperfosforilada. Esto sugiere que la exposición del dominio H2 es crucial para la amiloidosis. Por otro lado, algunas de las zonas que presentan una disminución de la absorción incluyen regiones que abarcan L114 a Q124, y G326 a S352. La última región corresponde a las regiones asociadas a los microtúbulos R3 y R4 en el dominio de repetición. Este tramo de la estructura residual recién formado está de acuerdo con estudios anteriores que demuestran que tau hiperfosforilada tiene una menor afinidad por los microtúbulos de unión 25. La región que abarca L114 a Q124 se identifica en el estado nativo como tener una propensión significativa para la estructura helicoidal, y la disminución en la absorción puede atribuirse a una mayor prevalencia de Seco estructura Ndary en el estado hiperfosforilada.
Figura 1. Representación esquemática de una proteína de someterse HDX antes del análisis de espectrometría de masas. La proteína de interés se diluye en una solución de óxido de deuterio (D 2 O), lo que permite hidrógenos lábiles de cadena principal para intercambiar con deuterio en el tiempo. regiones altamente dinámicos intercambiarán rápidamente, y deben ser monitoreados en la milésima de segundo a segundo escala de tiempo. Otras regiones que contienen estructuras secundarias más rígidas intercambiarán más lentamente. La reacción de intercambio se termina por enfriamiento rápido con ácido (pH 2,4), que también se desarrolla la proteína que permite la digestión con una proteasa ácida (por ejemplo, pepsina). La digestión se localiza el nivel de absorción de deuterio a través de diferentes áreas de la proteína. lacio "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Montaje experimental para tresi-HDX-MS. Una vista detallada de la mezcladora cinética se muestra en la parte inferior. El mezclador se compone de dos capilares concéntricos, un capilar de vidrio de sílice fundida interior dentro de un capilar de metal exterior. Una muesca está hecha 2 mm desde el extremo del capilar interior con un extremo conectado, lo que permite proteína para salir de la muesca y mezclar con el deuterio entrante. Este mezclador cinética se une a una te de mezcla. En el lado opuesto de la mezcladora, se adjunta un canal de entrega de ácido acético al 5% (pH 2,4). Tras enfriamiento de la reacción, la proteína deuterado pasa a través de la cámara de la proteolisis empaquetada con perlas pepsina-agarosa con el fin de producir péptidos pépticas. El capilar distal se utiliza como una fuente ESI.en / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. flujo de trabajo típica de los datos en bruto a parcelas cinéticos para los péptidos seleccionados de la proteína nativa y hiperfosforilada. (A) espectro sin procesar por cuatro péptidos (columnas) están equipados con las distribuciones isotópicas predichos para determinar el% de la captación de deuterio en tres puntos temporales diferentes (filas). (B) Observado parcelas cinéticas de absorción de deuterio% frente al tiempo para cada péptido (línea continua) usado para extraer k obs. Se observaron parcelas cinéticos para todos los péptidos en 3 o más veces de etiquetado (n = 3), las barras de error representan calculado "espiral al azar" perfil (línea de puntos) SE El se muestra para comparación. Reproducido de Zhu et al. 8 con permiso.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Datos de la Figura 4. HDX factor de protección mapeadas a estructuras representativas de (a) tau de longitud completa nativa y (b) tau hiperfosforilada. Estructura de tau hiperfosforilada se ha generado mediante la simulación FRODAN con refinamiento posterior usando VADAR. Grado de factores de protección son de color como un esquema de arco iris como se muestra en la leyenda (izquierda). Reproducido de Zhu et al. 8 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Mientras que los métodos de biología estructural, tales como cristalografía de rayos X y RMN son ventajosos porque proporcionan estructuras extremadamente detalladas de proteínas, estas imágenes son a menudo estática. La caracterización de las especies transitorias y dominios débilmente estructurados sigue siendo difícil de alcanzar cuando se estudió por estos métodos convencionales. Por lo tanto, con el fin de obtener una visión dinámica de este tipo de sistemas es importante trabajar a escalas de tiempo rápido. Hemos aplicado con éxito tresi-HDX-MS para obtener conocimientos detallados sobre los cambios conformacionales que ocurren dentro de un IDP bien estudiado a nivel peptídico localizado. Una de las limitaciones clave de esta técnica es que la pepsina es una proteasa no específica y, por sí sola, rara vez se produce la cobertura de secuencia completa. Una forma de ayudar a mejorar la cobertura de secuencia y especificidad es combinar proteasa de tipo XIII de Aspergillus saitoi a la cámara de digestión 26.
Es fundamental quela cámara de digestión se mantiene a un pH de 2,4 durante la totalidad del experimento con el fin de apagar efectivamente la reacción de intercambio y reducir la cantidad de la espalda de intercambio 11. Es imperativo que cualquier medida de proteólisis y su posterior análisis hacerse lo más rápidamente posible. Estudios anteriores han optimizado el tamaño de la cámara de digestión y sugerido tasas de flujo con el fin de mantener el nivel de back-intercambio a niveles insignificantes (≤5%) a temperatura ambiente 22. Se recomienda encarecidamente que el tamaño de la cámara no es mayor que las dimensiones indicadas en este protocolo. Una proteína altamente estructurada no ocupará niveles significativos de deuterio en la milésima de segundo a segundo escala de tiempo y será difícil de digerir en el tiempo permitido por la cámara de la proteólisis. Tales proteínas no son recomendables para su estudio mediante esta técnica.
Si bien se recomienda el uso de tampón de 50 mM de acetato de amonio (pH 6,9) para tque muestra de proteína, no todas las proteínas será compatible con esta concentración o el valor de pH. Es importante tener en cuenta el pI de la proteína, y ajustar el tampón en consecuencia para ser de al menos 1 unidad de pH por encima o por debajo. Esto asegurará que la proteína tiene la carga superficial requerida necesaria para el plegamiento adecuado y prevenir la agregación. El aumento de la concentración de acetato de amonio se recomienda para las proteínas propensa a la agregación con el fin de aumentar la solubilidad, sin embargo concentraciones por encima de 500 mM es que debe evitarse.
Tresi-HDX-MS se aplica mejor a sistemas compuestos de grandes regiones de bucle, glóbulos fundidos, o elementos de estructura secundaria transitorios 22. Además, hay varias ventajas económicas a esta técnica, ya que es simple y relativamente barato de implementar. Recientemente, ha habido un aumento en el uso de HDX-MS en la industria farmacéutica para el descubrimiento y desarrollo de fármacos 27. En los últimos diez añoss se ha producido un rápido crecimiento de las macromoléculas biológicas, los anticuerpos más notablemente monoclonales (mAbs), siendo aprobados por la FDA. En comparación con los fármacos de moléculas pequeñas, las estructuras de orden superior de las proteínas y sus dinámica de conformación juegan un papel importante en la determinación de la eficacia del fármaco. HDX-MS con éxito se ha utilizado como una herramienta de confirmación para la producción de anticuerpos biosimilares 28, así como la caracterización de anticuerpo-antígeno 29, 30, 31, y las interacciones proteína-ligando 32. Los avances en el desarrollo de software y automatización de experimentos acelerarán los tiempos de análisis que permite una mayor expansión de esta técnica en un futuro próximo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500 µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
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