Summary
المرونة بتكوين تلعب دورا حاسما في وظيفة البروتين. هنا، نحن تصف استخدام تأين بالإرذاذ الإلكتروني مطياف الكتلة وقت حل جانب لصرف الهيدروجين الديوتيريوم للتحقق التغييرات الهيكلية السريعة التي تدفع وظيفة في البروتينات أمر والمختلين.
Abstract
وقد البروتينات المختلين جوهريا (النازحين) لفترة طويلة تحديا لعلماء الأحياء الهيكلية نظرا لعدم وجود عناصر البنية الثانوية مستقرة. الهيدروجين الديوتيريوم تبادل (HDX) تقاس بمقاييس الوقت السريعة هي مناسبة فريدة للكشف عن الهياكل والشبكات الرابطة الهيدروجينية التي يتم لفترة وجيزة بالسكان، مما يسمح لتوصيف المتشاكلات عابرة في الفرق المحلية. اقتران HDX لقياس الطيف الكتلي يقدم العديد من المزايا الرئيسية، بما في ذلك حساسية عالية، وانخفاض استهلاك عينة وأي قيود على حجم البروتين. وقد تقدمت هذه التقنية بشكل كبير في العقود القليلة الماضية، بما في ذلك القدرة على رصد مرات العلامات HDX على مقياس الوقت ميلي ثانية واحدة. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال دمج سير العمل HDX في الصعود إلى منصة ميكروفلويديك السكن وmicroreactor البروتيني الحمضية، ونحن قادرون على توطين الخصائص الحيوية على مستوى الببتيد. في هذه الدراسة، في الوقت حل التأين electrospray الطيف الكتلي (TRESI-MS) يقترن إلى HDX واالصورة المستخدمة لتقديم صورة مفصلة للهيكل المتبقية في بروتين تاو، فضلا عن التحولات بتكوين الناجم على hyperphosphorylation.
Introduction
على مدى العقود العديدة الماضية، بذلت أوجه التقدم الكبير في تطوير التقنيات التحليلية لقياس بنية البروتين وديناميات 1، 2، 3، 4. في حين تبقى الأشعة السينية البلورات الأداة الرئيسية لتحديد بنية البروتين، وهناك حاجة تركيزات عالية من البروتين ومطلوب الأمثل واسعة لإنتاج بلورات ذات جودة الحيود. البروتينات التي يصعب بلورة مثل البروتينات المرتبطة الغشاء والمختلين جوهريا قد كلاسيكي تمت دراستها عن طريق تبادل الهيدروجين الديوتيريوم (HDX) NMR 5. ومع ذلك، في العقود الأخيرة، واقتران من تأين بالإرذاذ الإلكتروني الطيف الكتلي (ESI-MS) لHDX اكتسبت شعبية بسرعة 6 و 7.
قياس الطيف الكتلي يقدم حلالكثير من القيود التي تفرضها البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي. على وجه الخصوص، MS حساس للغاية (نانومتر لتركيزات ميكرومتر مطلوب)، وليس هناك عمليا أي حد على حجم البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ارتفاع دورة العمل من تحليل MS تتيح إمكانية دراسة البروتينات لأنها تخضع لدوران الأنزيمية، misfolding، complexation وغيرها من العمليات البيولوجية ذات الصلة. وغالبا ما تحدث هذه العمليات على ميلي ثانية واحدة على نطاق والمرة الثانية ويتطلب خلط السريع الكواشف قبل التحليل.
تطوير وقت حل التأين electrospray (TRESI) من خلال ويلسون وKonermann في عام 2003 ردود فعل سمح التي يتعين رصدها في وقت شبه حقيقي من قبل ESI-MS. الإعداد الخاصة بهم أدرجت خلاط الشعرية مع قابل للتعديل بشكل مستمر رد فعل حجم الغرفة 8. يتكون الجهاز من اثنين من الشعيرات الدموية متحدة المركز، مع الشعرية الداخلي مختومة والشق يقتطع من جانبها السماح لخلط داخل الضيق بين capillarذ الفضاء من الدرجة الأولى لنهاية الشعرية الداخلي (عادة 2 مم). عندما يطبق على التجارب HDX، الشعرية الداخلي يحمل البروتين من الفائدة، والشعرية الخارجي يحمل العلامات D 2 O الحل الذي ثم يخضع لخلط مع البروتين قبل الدخول إلى دائرة رد الفعل قابل للتعديل يسمح HDX وضع العلامات قبل النقل المباشر في ESI مصدر.
لفترة وجيزة، تعتمد على الهيدروجين HDX أميد العمود الفقري تمر التبادل مع ذرات الديوتيريوم في حل 9 و 10. تبادل هو قاعدة المحفز في درجة الحموضة الفسيولوجية، مع حمض الحفز أصبحت سائدة في درجة الحموضة أقل من حوالي 2.6. ويستند سعر الصرف على أربعة عوامل رئيسية هي: درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وسهولة الوصول المذيبات وضمجزيئي الرابطة الهيدروجينية. كما يتم الاحتفاظ اثنين من العوامل السابقة ثابت في كافة مراحل التجربة، وسعر الصرف، وخاصة في المناصب أميد الببتيد العمود الفقري، هو في المقام الأول dependenر على بنية البروتين 11. مطوية بإحكام المناطق ذات الشبكات الرابطة الهيدروجينية واسعة ومستقرة في α-اللوالب وβ اوراق ستتناول الديوتيريوم في أبطأ بكثير معدلات بالمقارنة مع الحلقات والمناطق المضطربة (وأحيانا لا على الإطلاق) 12. وهذا يسمح للتحليل البروتين العالمي، حيث الاضطرابات في بنية (على سبيل المثال، عند تجميع أو الركيزة ملزمة) تؤدي إلى اختلاف امتصاص الديوتيريوم (الشكل 1).
ويمكن إدراج خلاط الشعرية الحركية إلى منصة ميكروفلويديك تحتوي على غرفة بروتين لتوطين امتصاص الديوتيريوم. يقام هذه القاعة بروتين في انخفاض الرقم الهيدروجيني من أجل إخماد فعالية رد الفعل الصرف، ويتطلب البروتيني حامض يجمد من أجل هضم البروتين في الببتيدات المترجمة (الشكل 2). مراقبة الصرف العمود الفقري في ميلي ثانية واحدة لجداول زمنية ثانية مهم خاصة بالنسبة للتوصيف التغييرات بتكوين ضمن الصعب تميز المناطق حلقة، كريات المنصهرة، والبروتينات المختلين جوهريا (النازحين) 13، 14. بدلا من ذلك، يمكن TRESI-HDX أيضا أن تستخدم لتوصيف البروتينات أنه في الوقت الراهن ليس لدينا التركيب الذري حلها من خلال أساليب البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي، وذلك باستخدام الصرف الديوتريوم إلى جانب لخوارزمية COREX (DX-COREX) نهج 15 و 16. وهذا البروتوكول مفصل تنطبق TRESI-HDX لدراسة تاو، وهو IDP، في كل من انها شكل الأصلي، فضلا عن أنها دولة hyperphosphorylated المسببة للأمراض. بينما تاو الأصلي هو واحد من أكثر النازحين مدروسة، لا يعرف الكثير عن نظيره amyloidogenic 13 منه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى كافة الأوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. الأبخرة الناتجة عن الاستئصال بالليزر من بولي (ميتاكريليت الميثيل) (PMMA) يمكن أن تكون سامة. مما لا شك فيه أن الليزر متصل إلى نظام التهوية العمل. استخدام كل ممارسات السلامة المناسبة عند بناء الجهاز ميكروفلويديك بما في ذلك استخدام الضوابط الهندسية (غطاء الدخان، حاوية الأدوات الحادة)، ومعدات الوقاية الشخصية (نظارات السلامة، قناع الوجه، والقفازات، معطف المختبر، كامل طول السراويل والأحذية المغلقة اصبع القدم). ومن الأهمية بمكان أن استخدام عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) الكواشف الصف كلما أمكن ذلك، مع الوجود كله من ACS الصف أو أعلى لتقليل الملوثات التدخل أثناء التحليل.
1. إعداد الجهاز ميكروفلويديك
- بناء ميكروفلويديك منصة PMMA
- الحصول على كتلة PMMA قياسي (8.9 X 3.8 X 0.6 سم) الليزر واجتثاث قناة الإدخال لإدخال الكواشف، وPROTEOتحلل الغرفة، وقناة الإخراج باستخدام الليزر 17 و 18.
ملاحظة: إحفر غرفة التحلل البروتيني في شكل بيضاوي ممدود (30 × 5 × 0.05 مم). قناة المدخلات والمخرجات يجب أن تمتد إلى نهاية كتلة PMMA وأن يكون هناك أكبر من 75 ميكرومتر في كل من العرض والعمق من أجل استيعاب الشعرية 30 الجا. - قطع 30 الجا الفولاذ المقاوم للصدأ المعادن الشعرية إلى قطعتين من حوالي 10 سم لكل منهما باستخدام أداة دوارة مع قرص "قطع سميكة 1/64. استخدام الصنفرة لتسهيل نهايات الشعيرات الدموية (وهذا يمكن أن يتيسر من خلال عرض تحت المجهر الضوئي).
- تذوب الشعيرات الدموية في بولي محفورا (ميتاكريليت الميثيل) كتلة باستخدام حام الحديد. وسيتم ربط قناة المدخلات إلى مضخات الحقن الآلي، وسيتم استخدام قناة الناتج عن اقتران في MS.
- الحصول على كتلة PMMA قياسي (8.9 X 3.8 X 0.6 سم) الليزر واجتثاث قناة الإدخال لإدخال الكواشف، وPROTEOتحلل الغرفة، وقناة الإخراج باستخدام الليزر 17 و 18.
- بناء الحركية خلاط حل الزمني الدفق المستمر
- الحصول على تنصهرالسيليكا الشعرية الزجاج (ID: 75 ميكرون، OD: 150 ميكرون) من حوالي 40 سم، وأدخله في 28 الجا الفولاذ المقاوم للصدأ المعادن الشعرية حوالي 15 سم. اعتمادا على وقت رد الفعل المطلوب، واستخدام الشعرية المعدنية يعد الخارجي أو واحد مع معرف أكبر.
ملاحظة: تحديد "الحقيقي" القطر الداخلي للالشعرية المعدنية أمر بالغ الأهمية للحصول على أوقات رد الفعل دقيقة. ويمكن القيام بذلك عن طريق ربط الشعرية المعدنية إلى HPLC، تتدفق المذيب على الرغم من شعري، وتسجيل الضغط مرة أخرى. A احداهما لحساب القطر الداخلي يمكن إجراء، والقطر الداخلي الحقيقي للالشعرية المعادن تحديدها. ويمكن حساب هذا باستخدام برنامج حاسبة الوزن الجزيئي (ويندوز الإصدار 6.49). - إنتاج الشق 2 مم باستخدام إعدادات الليزر منخفض الطاقة على نهاية واحدة من الزجاج الشعرية الداخلي وختم هذه الغاية من الزجاج الشعرية الداخلي (الشكل 2). بدلا من ذلك، جعل الشق باستخدام capillar الزجاج والسيراميكأداة قطع ذ أو طاحونة دوارة مع شفرة القطع الجميلة.
- خط المتابعة الشعرية الزجاج الداخلي مع نهاية الشعرية المعدنية (وهذا يمكن أن تيسره عرض تحت مجهر الضوء).
- إرفاق هذا الخلاط الحركية إلى نهاية واحدة من نقطة الإنطلاق خلط (الشكل 2).
- إرفاق الشعرية تنصهر فيها الزجاج السيليكا (ID: 75 ميكرون، OD: 150 ميكرون) ما يقرب من 40 سم إلى الطرف الآخر من الخلاط الحركية على نقطة الإنطلاق الاختلاط. هذا وتستخدم لتقديم حمض (حمض الخليك 5٪، ودرجة الحموضة 2.4) لإرواء رد الفعل.
يتم تزويد كواشف إلى الجهاز مع الحقن مانعة لتسرب الغاز من خلال تترافلوروإيثيلين (PTFE) أنابيب باستخدام مضخات حقن الآلي: ملاحظة.
- الحصول على تنصهرالسيليكا الشعرية الزجاج (ID: 75 ميكرون، OD: 150 ميكرون) من حوالي 40 سم، وأدخله في 28 الجا الفولاذ المقاوم للصدأ المعادن الشعرية حوالي 15 سم. اعتمادا على وقت رد الفعل المطلوب، واستخدام الشعرية المعدنية يعد الخارجي أو واحد مع معرف أكبر.
- تنشيط البيبسين
- تزن من 20 ملغ من البيبسين من الغشاء المخاطي في المعدة الخنازير وتعليق في 1 مل من العازلة اقتران (الفوسفات 0.1 M الصوديوم، كلوريد الصوديوم 0.15 M، ودرجة الحموضة 6.0).
- تزن من 50 ملغ من N -hydroxysuccinimide (NHS) الخرز agarose -activated، إضافة إلى إعادة ياليالبروتيني uspended وتناوب بلطف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تدور باستمرار في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لجمع الراتنج.
- نضح البروتيني غير منضم.
- احتضان الاغاروز في 1 مل من عازلة تمنع (1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.0) وتناوب بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- تدور باستمرار في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لجمع الراتنج.
- نضح عازلة تمنع.
- احتضان البيبسين-الاغاروز مع حمض الخليك 1 مل من 5٪، ودرجة الحموضة 2.4 لمدة 5 دقائق.
- تدور باستمرار في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة لجمع الراتنج.
- نضح طاف.
- كرر الخطوات من 1.3.8 - 1.3.10 لما مجموعه ثلاثة يغسل.
- تخزين حبات في 1 مل حامض الخليك في 4 درجات مئوية لاستخدامها على المدى الطويل.
- الجمعية الجهاز
- تملأ الغرفة التحلل البروتيني مع الطين لتنشيط الخرز البيبسين-الاغاروز في حامض الخليك 5٪ باستخدام ملعقة معقمة.
- وضع المنهاج ميكروفلويديك PMMAم بين كتلتين PMMA فارغة كغطاء لاغلاق الجهاز، واصطف مع المطاط سيليكون لإنشاء ختم ضيق السائل.
- استخدام لوحات معدنية لقط إلى الضغط ختم الجهاز.
ملاحظة: تم المشبك مخصصة لتناسب منصة ميكروفلويديك ويتكون من اثنين من لوحات قياس 10.1 سم × 7.4 سم × 1.2 سم. - تدفق حمض الخليك 5٪، ودرجة الحموضة 2.4 بمعدل 10 ميكرولتر / دقيقة. تدفق 50 ملي العازلة خلات الأمونيوم (درجة الحموضة 6.9) على الرغم من أن خط البروتين بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة.
ملاحظة: من المهم للغاية أن حمض الخليك تتدفق باستمرار من خلال الجهاز طوال مجمل التجربة. ضمان عدم وجود أي تسرب وأن السائل يتم إنهاء فقط من انتاج قناة، والتي سوف تكون بمثابة مصدر ESI. - زوجان الجهاز على الواجهة الأمامية للرباعي الوقت من الطيران (Q-TOF) مطياف الكتلة تعديلها باستخدام مرحلة معزول للتعديل لتحقيق شروط electrospray المثلى.
ملاحظة: التبديل الالتفافيةهو عرض من أجل محاكاة وجود مصدر ESI التجاري. 17
2. حل العملات في الوقت التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم
- الحصول على البيبسين والبروتين فقط الأطياف
ويتم اكتساب ESI-MS في وضع ايون ايجابية مع الجهد من 4500-5000، 60-V إمكانية declustering، و 250-V تركز إمكانية: ملاحظة. يتم الحصول على أطياف على مجموعة من 350-1،500 م / ض بمعدل المسح من 1 ق -1.- الحصول على الطيف الوحيد البيبسين. يتم طرح أي قمم الواردة في هذا الطيف مرة واحدة يتم إضافة البروتين.
- إدخال 50-100 ميكرومتر تاو / بروتين فوسفاتي-تاو (تنقية وإعداد كما سبق وصفها 13، 19) بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة حيث العازلة خلات الأمونيوم 50 ملي كان يتدفق سابقا.
- الحصول على البروتين الطيف فقط.
- اكتساب سنقاط و الوقت
- بينما البروتين 100 ميكرومتر تاو / الفوسفات-تاو تتدفق في 1 ميكرولتر / دقيقة، وإدخال D 2 O بمعدل 3 ميكرولتر / دقيقة عن طريق موصل تي والسماح للرد في الخلاط الحركي. السماح للنظام لكي تتوازن لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل الحصول على الطيف.
ملاحظة: بعد الصرف، وتطفئ رد فعل العلامات التي تدفق من درجة الحموضة حمض الخليك 2.4 في 10 ميكرولتر / دقيقة والهضم من البروتين المسمى يحدث في غرفة بروتين. - من أجل زيادة الوقت وضع العلامات يدويا سحب موقف الزجاج الشعرية الداخلي لتحقيق خلط مرات من 42 مللي ثانية إلى 8 ق. السماح للنظام لكي تتوازن لمدة 10 دقيقة على الأقل بين كل سحب الظهير.
- بينما البروتين 100 ميكرومتر تاو / الفوسفات-تاو تتدفق في 1 ميكرولتر / دقيقة، وإدخال D 2 O بمعدل 3 ميكرولتر / دقيقة عن طريق موصل تي والسماح للرد في الخلاط الحركي. السماح للنظام لكي تتوازن لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل الحصول على الطيف.
3. البيانات والتحليل الإحصائي
- تحديد الببتيدات وحساب نسبة الديوتيريوم تبادل
- أداء MS أطياف تحليل باستخدام البرمجيات mMass، الإصدار 5.5.0 20
- تحديد الببتيدات باستخدام ملقم البروتين إكسباسي FindPept وتأكيد من قبل الناجم عن الاصطدام التفكك (CID) عند الحاجة 21.
ملاحظة: هنا، تم قياس التأسيس الديوتيريوم امتصاص باستخدام برنامج FORTRAN في المنزل وضعت لتحليل توزيع النظائر 22، 23. - حساب معدلات الجوهرية النظرية على أساس تسلسل الأساسي باستخدام أداة على شبكة الإنترنت SPHERE 22 و 24.
- احتواء البيانات باستخدام واحد الانحدار المتسارع غير الخطية وتطبيع باستخدام الرسوم البيانية والبرامج الإحصائية (على سبيل المثال، SigmaPlot).
ملاحظة: نسبة ك الباحث / ك التوليد تعطي عامل حماية (PF)، وهو مقياس شبه كمي لدرجة أن يتمحور منطقة معينة ضمن الفرقة بتكوين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كانت ملامح هضم الأصلي والفوسفات-تاو مماثلة، مما أسفر عن تغطية تسلسل 77.1 و 71.7٪ على التوالي. تم تحديد القيم الديوتيريوم امتصاص كل الببتيد عن طريق تركيب توزيعات النظائر لاحظ مع توزيعات النظرية تم إنشاؤها باستخدام برمجيات FORTRAN في المنزل المتقدمة. وتظهر أفضل التوزيعات المناسب (الشكل 3A) جنبا إلى جنب مع القيم امتصاص الديوتيريوم المرتبطة بها. ثم يتم إنشاء التشكيلات الحركية امتصاص، وكانت وصفت بشكل جيد من قبل تعابير أسية واحدة. (ن = 3) وقد تم تحليل الشخصية الحركية لجميع الببتيدات لوحظ في 3 مرات أو أكثر العلامات. هذه النوبات الأسي واحدة إلى القيم امتصاص احظ تسفر عن سعر الصرف الثابت k التوليد لكل الببتيد. تتم مقارنة هذا إلى تسلسل الرئيسي التابع "لفائف عشوائي" المعدل الصميم الثابت k كثافة العمليات. والمحسوب PF (ك الباحث / ك </ م> طب التوليد) في 1.52 الصورة تم تعيينه على الهياكل الممثلة للتاو الأصلي وhyperphosphorylated (الشكل 4).
وكما كان متوقعا، لم يلاحظ أي PFS في نطاق ترتبط عادة مع عناصر البنية الثانوية مؤكدا أن تاو الأصلي يسلك ضعف الرابطة الهيدروجينية الداخلي. لوحظ حماية كبيرة في N وC-ترميني، المجال المركزي والمعرضة للتجميع (hexapeptides الأول والثاني) المناطق (الشكل 4). بعد 1.52 ثانية، وبالديوتيريوم 90٪ من البروتين، مع التبادل الكامل تحدث في أقل من 2 دقيقة.
البروتين الأصلي يمكن مقارنة حالة تغيير، في هذه الحالة الدولة hyperphosphorylated amyloidogenic، حيث نلاحظ زيادة عامة في امتصاص الديوتيريوم عبر البروتين. هناك زيادات كبيرة في N- وC-ترميني وفي منطقة H2. الزيادة العامة في امتصاص تدعم جurrent فرضية أن hyperphosphorylation يسبب البروتين لاعتماد هيكل الموسعة. من hexapeptides اثنين، ويظهر H2 أكبر زيادة في امتصاص الديوتيريوم، من كونها واحدة من المناطق المحمية الأكثر تطورا في الدولة الأم إلى ما يقرب من أي حماية في ولاية hyperphosphorylated. وهذا يشير إلى أن التعرض للمجال H2 هو أمر حاسم لamyloidogenesis. من ناحية أخرى، فإن بعض المناطق واظهار انخفاض في امتصاص تشمل مناطق تمتد L114 إلى Q124، وG326 لS352. تقابل هذه المنطقة الأخيرة إلى المناطق R3 وR4 المرتبطة أنيبيب في المجال تكرار. هذا الجزء من الهيكل المتبقية التي شكلت حديثا يوافق مع الدراسات السابقة التي تدلل على أن تاو hyperphosphorylated لها قابلية انخفضت لأنيبيب ملزمة 25. تم تحديد المنطقة التي تمتد L114 إلى Q124 في الدولة الأم وجود ميل كبير للبنية حلزونية، ويمكن أن يعزى هذا الانخفاض في امتصاص إلى ارتفاع معدل انتشار سك هيكل ndary في ولاية hyperphosphorylated.
الشكل 1. تصوير تخطيطي من البروتين تمر HDX قبل تحليل الطيف الكتلي. يتم تخفيف هذا البروتين من الفائدة في حل من أكسيد الديوتيريوم (D 2 O)، والسماح للهيدروجين العمود الفقري عطوب لتبادل مع الديوتيريوم مع مرور الوقت. سوف المناطق ديناميكية للغاية تبادل بسرعة، ويجب أن تتم مراقبتها على ميلي ثانية واحدة على نطاق والمرة الثانية. وغيرها من المناطق التي تحتوي على هياكل الثانوية أكثر جمودا تبادل ببطء أكثر. إنهاء رد فعل الصرف التبريد مع حامض (درجة الحموضة 2.4)، والذي يتجلى أيضا البروتين السماح للهضم مع البروتيني الحمضية (مثل البيبسين). الهضم يموضع مستوى امتصاص الديوتيريوم في مناطق مختلفة من البروتين. نحيف "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التجريبية مجموعة المتابعة لTRESI-HDX-MS. ويرد عرض تفصيلي لالخلاط الحركية في القاع. وتتكون خلاط اثنين من الشعيرات الدموية متحدة المركز، وتنصهر الشعرية الداخلي زجاج السيليكا داخل شعري المعادن الخارجي. يتم إجراء الشق 2 ملم من نهاية الشعرية الداخلي مع نهاية الوتر، مما يسمح للبروتين للخروج من الدرجة الأولى وتخلط مع الديوتيريوم واردة. ويرد هذا الخلاط الحركية إلى نقطة الإنطلاق الاختلاط. على الجانب الآخر من خلاط، ويرد قناة توفير حامض الخليك 5٪ (الرقم الهيدروجيني 2.4). وبعد التبريد من رد الفعل، البروتين بالديوتيريوم يمر عبر غرفة التحلل البروتيني معبأة مع حبات البيبسين-الاغاروز من أجل إنتاج الببتيدات الهضمية. يستخدم الشعرية البعيدة كمصدر ESI.وفاق / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. سير العمل نموذجي من البيانات الخام إلى قطع الحركية للالببتيدات مختارة من البروتين الأصلي وhyperphosphorylated. (أ) الطيف الخام لمدة أربعة الببتيدات (الأعمدة) يتم تركيبها على توزيعات النظائر المتوقع أن تحدد٪ من امتصاص الديوتيريوم في ثلاث نقاط زمنية مختلفة (صفوف). (ب) لاحظ المؤامرات الحركية لل٪ امتصاص الديوتيريوم مقابل الوقت لكل الببتيد (خط الصلبة) المستخدمة لاستخراج ك التوليد. وقد لوحظت المؤامرات الحركية لجميع الببتيدات في 3 مرات أو أكثر العلامات (ن = 3)، أشرطة الخطأ تمثل يظهر SE وتحسب "لفائف عشوائي" الملف (الخط المنقط) للمقارنة. مستنسخة من تشو وآخرون. 8 بإذن.الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تعيينها بيانات الرقم 4. HDX عامل الحماية على الهياكل الممثلة لل(أ) الأصلي تاو بالطول و (ب) تاو hyperphosphorylated. تم إنشاء هيكل تاو hyperphosphorylated استخدام المحاكاة FRODAN مع الصقل لاحقا باستخدام VADAR. يتم تلوين درجة من عوامل الحماية ومخطط قوس قزح كما هو مبين في أسطورة (يسار). مستنسخة من تشو وآخرون. 8 بإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بينما الأساليب البيولوجيا البنيوية مثل البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي هي مفيدة لأنها توفر الهياكل مفصلة للغاية من البروتينات، وهذه الصور هي في كثير من الأحيان ثابتة. استمر توصيف الأنواع العابرة والمجالات المهيكلة ضعيف أن يكون بعيد المنال عند دراستها من قبل هذه الأساليب التقليدية. ولذلك، من أجل اكتساب رؤى الحيوية على هذه الأنواع من أنظمة فمن المهم للعمل في فترات زمنية سريعة. لقد طبقت بنجاح TRESI-HDX-MS للحصول على رؤى تفصيلية حول التغييرات التي تحدث متعلق بتكوين ضمن IDP-مدروسة على مستوى ببتيدية المترجمة. واحد من أوجه القصور الرئيسية لهذه التقنية هو أن البيبسين هو الأنزيم البروتيني غير محددة و، من تلقاء نفسها، ونادرا ما تنتج تغطية تسلسل كامل. طريقة واحدة للمساعدة في تحسين تغطية تسلسل وخصوصية تتمثل في الجمع بين نوع البروتيني XIII من الرشاشيات saitoi إلى غرفة الهضم 26.
ومن الأهمية بمكان أنيتم الاحتفاظ غرفة الهضم في الرقم الهيدروجيني من 2.4 خلال مجمل التجربة من أجل إخماد فعالية رد الفعل الصرف وتقليل كمية من الخلف الصرف 11. ومن الضروري أن يتم ذلك أي خطوات التحلل البروتيني وتحليلها لاحقا في أسرع وقت ممكن. وقد الأمثل الدراسات السابقة حجم الغرفة الهضم واقترح معدلات التدفق من أجل الحفاظ على مستوى الظهر الصرف إلى مستويات لا تذكر (≤5٪) في درجة حرارة الغرفة (22). فمن المستحسن أن حجم الغرفة ليست أكبر من أبعاد المدرجة ضمن هذا البروتوكول. وهناك بروتين منظم للغاية لا يستغرق فترة تصل مستويات كبيرة من الديوتريوم على ميلي ثانية واحدة على نطاق والمرة الثانية، وسوف تكون صعبة الهضم في الوقت الذي يسمح به غرفة التحلل البروتيني. لا ينصح هذه البروتينات للدراسة باستخدام هذه التقنية.
بينما نحن نوصي باستخدام 50 ملي العازلة خلات الأمونيوم (الرقم الهيدروجيني 6.9) لرانه نموذج البروتين، وليس جميع البروتينات تكون متوافقة مع هذا التركيز أو قيمة الرقم الهيدروجيني. ومن المهم أن نلاحظ المعهد البترولي من البروتين، وضبط المخزن المؤقت وفقا لذلك أن يكون على الأقل 1 وحدة درجة الحموضة أعلاه أو أدناه. وسوف يضمن هذا البروتين له تهمة السطحية المطلوبة اللازمة للطي السليم ومنع تجميع. زيادة تركيز خلات الأمونيوم يستحب للبروتينات عرضة التجميع من أجل زيادة القابلية للذوبان، ولكن تركيزات أعلى من 500 ملي هي التي ينبغي تجنبها.
من الأفضل تطبيق TRESI-HDX-MS إلى أنظمة تتألف من مناطق واسعة حلقة، كريات المنصهرة، أو عناصر البنية الثانوية عابرة 22. وبالإضافة إلى ذلك، هناك مزايا الاقتصادية المختلفة لهذه التقنية لأنها بسيطة وغير مكلفة نسبيا لتنفيذ. في الآونة الأخيرة، كانت هناك زيادة في استخدام HDX-MS في صناعة الأدوية لاكتشاف وتطوير الأدوية (27). على مدى العقد الماضي عدةليالي كان هناك نمو سريع الجزيئات البيولوجية، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة الأكثر أبرزها (MABS)، التي وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير. بالمقارنة مع العقاقير جزيء صغير، والهياكل أعلى ترتيب البروتينات وديناميتها بتكوين تلعب دورا كبيرا في تحديد فعالية الدواء. وقد تم بنجاح استخدام HDX-MS كأداة تأكيدا لإنتاج الأجسام المضادة بدائل حيوية 28، وكذلك توصيف الضد مستضد 29 و 30 و 31، والتفاعلات البروتين يجند 32. والتقدم في مجال تطوير البرمجيات وأتمتة التجارب تسريع مرات تحليل السماح لمزيد من التوسع لهذه التقنية في المستقبل القريب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500 µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
- Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization? Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
- Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
- Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
- Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
- Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
- Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
- Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
- Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
- Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
- Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
- Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
- Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
- Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
- Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
- Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
- Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
- Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
- Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
- Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
- Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
- Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
- Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).
