Summary
우리는 정밀 컷 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 폐에 다양한 면역 세포 유형의 현지화를 시각화하도록 면역 염색하는 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜은 다양한 조건 하에서 위치와 다양한 세포 유형의 기능을 시각화 할 수 있도록 확장 할 수 있습니다.
Abstract
알러지 유발 물질과 병원균의 흡입은 폐의 면역 세포 유형의 다양한 여러 변화를 이끌어 낸다. 유동 세포 계측법은 면역 세포에 세포 표면 단백질의 정량 분석을위한 강력한 기술이지만, 폐 내에서 이러한 세포의 현지화 및 이동 패턴에 관한 정보를 제공하지 않습니다. 마찬가지로, 화성 분석은 체외에서 화학 주성 인자에 반응하는 세포의 가능성을 연구하기 위해 수행 할 수 있지만, 이러한 분석은 그대로 폐의 복잡한 환경을 재현하지 않습니다. 이러한 전술 한 기술들에 대조적으로, 폐 내의 각각의 세포 유형의 위치를 용이하게 시판되는 형광 태그 항체로 염색 정밀 절단 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 공 초점 현미경에 의해 부분을 시각화 시각화 할 수있다. PCLS 살 모두 사용과 폐 조직을 고정하고, 슬라이스 전체 엽 단면 한 큰 영역을 포괄 할 수있다. 우리는 성공적으로 수지상 세포의 구별 유형, 대 식세포, 호중구, T 세포와 B 세포뿐만 아니라, 림프, 내피 등의 구조 세포를 포함 폐에서 세포 유형의 다양한의 위치를 시각화하기 위해이 프로토콜을 사용하고있다 상피 세포. 세포가 폐 내에서 이동 및 정상 상태에서 염증 동안 서로 상호 작용하는 방식을 라이브, 입체 폐 조직에서 수지상 세포와 T 세포 사이 것과 같은 세포 상호 작용을 시각화하는 능력은 공개 할 수 있습니다. 같은 유동 세포 계측법 및 정량 PCR과 같은 다른 절차와 함께 사용하는 경우 따라서, PCLS는 폐의 알레르기 성 및 염증성 질환의 기초가 세포 사건의 포괄적 인 이해에 기여할 수있다.
Introduction
이러한 지질 다당류 (LPS)와 같은 염증성 자극의 흡입 후,이 내에 면역 세포의 조정 움직임, 그리고 폐에서. 예를 들어, 호중구는 빠르게 폐 실질과기도로 모집하고 있습니다. 또한, 종래의 수지상 세포 (CDCS)로 알려진 몇몇 전문 항원 제시 세포는 비교적 복잡한 이동 패턴 1, 2 겪는다. CDCS은 표면 마커들의 디스플레이하는 CD11c에 부분적으로 유세포하여 식별 기초 할 수있다. 수지상 고유 서브 세트 CD103 및 CD11b를 3 차 표면 발현에 의해 구별 될 수있다. 흡입 된 항원을 취득하면, 일부 CDCS 폐 빠져가 항원 특이 적 T 세포 위해 4 펩티드를 제시 폐 배수 림프절 (림프절)에 림프관을 통해 이동한다. 이 적응성 면역 연구의 시작에 중요한 초기 이벤트esponses. 알 수없는 이유로, 그러나, 흡입 항원을 획득 모든 CDCS는 폐를 떠나, 이러한 세포의 대부분은 몇 달 5 해당 기관에서 6 남아있다. 단핵구 유래의 CD11c + 케모카인 수용체, CCR7 부족한 세포, 지역 림프절 7, 8로 마이그레이션 할 수없는 때문에 이러한 관찰은 부분적으로 이러한 세포의 발달 조상에 의해 설명 될 수있다. CDCS의 이동 가능성도 폐 내에서의 해부학 적 위치에 의해 적어도 부분적으로 결정되는 것으로 보인다. 그러나, 폐 CDCS의 서로 다른 집단의 정확한 현지화 완전히 특징되지 않습니다. 폐 내에서, 그리고 직접 분자의 면역 세포 지역화의 개선 된 지식, 폐의 면역 체계가 활성화됩니다 방법에 대한 더 나은 이해를 위해 필요합니다.
PCLS이되고 증가하고있다폐 구조 (9), (10)의 구조적 일체 성을 유지하면서, LY는 셀룰러 위치 및 세포 - 세포 상호 작용을 시각화하기위한 생체 외 방법으로 사용된다. PCLS은 쥐, 소, 원숭이, 양, 말, 인간 (11)를 포함하여 많은 종의 폐를 연구하는 데 사용되었다. 이 기술의 주요 장점은 약 20 분할함으로써 개별 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고, 마우스 폐 단일 로브로부터 제조 될 수 있다는 것이다. 수지상 세포, 대 식세포, 호중구 및 T 세포를 포함하여 거의 모든 면역 세포 유형은 PCLS에 존재하고 그들의 정상적인 구조를 유지한다.
PCLS은 아세틸 콜린 (12) 또는 메타 (13)와 치료 후 칼슘 신호 및기도 평활근 세포의 수축력을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방식에서, 폐의 작은 부분은 인현미경 alyzed하지만, 한 연구는 PCLS에서기도 수축의 측정 슬라이스 조각에서 약 10 %을 변화하고,이 차이는 그대로 동물 (14)에 폐 기능 검사를 사용하여 볼에 필적이라고보고했다. 다른 연구자들은 LPS (15)와 함께 배양 한 후 사이토 카인의 발현 및 세포 표면 마커의 변화를 연구하기 위해 체외 방식으로 PCLS을 사용했다. PCLS 또한 작은 내 선방 동맥 저산소 성 폐 혈관 수축의 체외 모델에서 사용되어왔다. 이 선박은 해부 동맥 세그먼트 또는 subpleural 용기 (16)의 분석 등을 포함하여 기타 절차를 사용하여 도달 할 수없는 폐의 부분에 있습니다. 우리 연구실은 주로 생체 내 염증 자극 다음과 면역 세포의 정상 상태에서 라이브 폐 조직의 현지화 및 시각화 PCLS을 사용하고있다. 다음과 같이 우리가 개발 한 절차이다.
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Protocol
이 문서에 설명 된 동물 실험 절차는 NIEHS 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 폐 제조
- 제도적 동물 관리 및 사용위원회에 의해 제공되는 지침에 따라 특정 병원균이없는 조건에서 생후 6 12 주 사이 하우스 마우스.
참고 : 몇 군데 마우스는 각 연구자의 특정 관심 분야에 따라, 순진, 또는 처리 될 수 있습니다. 여기서는 50 μL의 총 부피의 비히클로 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하여, 나이브 마우스에 100 μg의 난 알부민 (OVA) 및 0.1 μg의 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)로 처리 된 마우스에 면역 세포 제이션을 설명한다. oropharyngeally기도에 OVA / LPS를 주입하기 위해 동물 이소 플루 란 흡입 마취와 수직으로 고무 밴드와 함께 자신의 치아에 의해 중단되었다. 혀 부드럽게 포셉 파지 연하 방지 한쪽 유지하고 50 #시켰다181; 구강의 후면에 증착 된 OVA / LPS 용액 L은 앞서 설명한 17. - 나트륨 펜토 바르 비탈 (100 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사로 마우스를 안락사 및 폴리스티렌베이스 동물 핀.
- 턱 복부까지의 중앙으로부터 피부와 복막 절단 가위로 복강을 열고. 집게 또는 위의 둔한 에지 제외 창자 당기고 폐 멀리 피 드레인 대정맥을 자르지. 폐를 절단하지 않도록주의하면서, 흉곽의 팽창을 허용하도록 위의 날카로운 팁 격막 천공.
- 클리어 침샘과 집게로 기본 기관에서 당기고 수동으로 조직을 잡아하여 멀리 기관에서 다른 조직. TRA 불구하고 모든 방법을 베이지 않도록주의하면서 미세 집게 가위를 사용하여 연골의 두꺼운 밴드의 전방 측면에서 기관의 작은 절개를합니다CHEA. 절개는 20 G 바늘이 통과 할 수 있도록 충분히 커야합니다.
- 바늘의 끝을지나 튜브의 약 1cm을두고 폴리에틸렌 튜브의 섹션 상에 1.5 인치, 20 G 바늘을 밀어. 아가까지 바늘을 통해 따뜻한 0.8 ㎖ (40 ℃)에서 2 % 저 융점 그려서 주사기를 최종 베벨 1 ml 주사기의 바늘을 장착하고,로드 약 45 °의 각도로 튜브를 절단.
- 기관의 절개로 튜브의 끝을 놓고 천천히 폐에 아가로 오스를 주입. 바늘이나 주사기를 이동하지 않고, 바늘이 기관에 남아 보장하기 위해 폴리스티렌베이스에 주사기를 테이프.
참고 : 주입 후, 폐는 가슴에서 크고 팽창 될 것입니다. 오른쪽 돌출부는, 먼저 왼쪽 엽을 확장합니다. 하나의 로브가 확장되면, 바늘 (기관지 과거) 너무 깊이 삽입 된, 그리고 그것을 진행하기 전에 약간 당겨해야 할 것입니다. 의이 부분절차는 아가로 오스는 응고 시작하기 전에, 상대적으로 빠르게 수행해야합니다. - 적어도 10 분 동안 상기베이스 및 냉장실 여전히 기관에 삽입 된 주사기 또는 냉장고, 마우스를 놓는다. 필요한 경우, 동물은 몇 시간까지, 심지어 비디오 현미경으로 이미지 세포의 이동으로 진행하면 거기에 유지 될 수있다.
- 마우스가 감기되면, 조심스럽게 가위를 사용하여 아가로 오스 - 팽창 폐를 절제하고, 얼음 차가운 PBS와 3cm 접시에 배치합니다. 얼음에 보관하십시오.
- 조직 슬라이스에 대해 원하는 엽 (예를 들어, 바로 우수한 엽)을 선택합니다. 확실히 (이 기관에 연결) 폐의 내부 부분이 접시에 내려 얼굴을 확인합니다.
주 : 로브를 사용하고, 플런저에 그 방향이 표시되며기도 혈관의 크기를 결정한다. 여기에서 설명한 배향은 큰기도의 시각화 및 실질 이상적이다. 마우스는 하나의 큰 왼쪽 엽과 오른쪽에 네 개의 작은 돌출부가 있습니다. 에 대한편리 크기 때문에, 또한 흡입 에이전트가 그 안에 균일하게 분산하기 때문에 인두 또는 비강 흡입을 통해 폐에 알러지 유발 물질의 도입 다음 PCLS 영상은 오른쪽 우수한 엽은 일반적으로 부분적으로 구분된다. 그러나 다른 로브, 특히 왼쪽 엽도 공부하실 수 있습니다. 마우스 균주 또는 치료를 비교하는 경우, 같은 엽을 비교하는 것이 중요하다.
2. 폐 슬라이스
참고 : 제조업체의 지침에 따라, 금속 블록, 플런저 및 금속 주사기를 냉각, 자동 슬라이서를 이용하여 슬라이스를 확인합니다.
- 플런저에 모든 용도의 작은 방울, 노 실행 젤 superglue를 넣고 접착제 금속 주사기의 측면에 접촉하지 않도록주의하면서 원을 그리 접착제를 확산. 접착제 주사기의 측면에 접촉하면, 주사기 플런저 접착제와 함께한다.
- 즉시 접착제와 플런저를 피복 한 후, 가볍게 잡고다운 기관 측과 집게 절제 로브 과잉 액체를 제거하고, 신중 플런저의 상부에 배치하기위한 조직에이 한 덩어리. 플런저의 에지를 넘어 연장되는 여분의 조직을 잘라내.
- 금속 주사기의 측면 이동과 조직을 통해 있도록 만들어 아래로 플런저를 이동 잘 깊은 몇 센티미터보다 더 이상, 하단에 붙어 폐. 금속 주사기의 바닥의 주위에 테이프 장소에서이 위치를 유지합니다.
- 단지 로브의 상부를 커버하는 것이므로 웰에 40 ℃에서 2 % 저 용융 아가 로스를 붓는다.
- 얼음 - 냉각 된 냉각 블록 금속 주사기를 둘러싸고 1 로브 및 아가로 냉각 - 2 분.
참고 : 주변 조직 아가로 오스의 짧은 시간 냉각이 고르지 잘라 PCLS이 발생할 수있는 슬라이스 동안 아가로 오스의 붕괴로 이어질 수있다. - 자동 슬라이서로 표본 주사기를 넣고 얼음 차가운 PBS와 버퍼 탱크를 채우십시오. 맞 춥니 시편 주사기 모터 구동 단계와 바닥에서 테이프의 부분을 제거한다. 스텝 모터 구동 단지 플런저의이면에 닿을 때까지 빨리 감기 (FF) 위치로 스위치를 켜는.
- 시편 주사기와 신선한 날을 맞 춥니 다. 슬라이서에서 설정 조직 두께, 연속 / 단일 슬라이스, 진동 및 속도. 예를 들어, 조직의 두께가 150㎛, 연속 절삭 (계속). 발진 9 및 속도 3 - 4. 시작. 위의 설정은 특정 자동 슬라이서 사양으로 조정해야합니다.
- 그들은 상기 버퍼 탱크 내로 낙하하고 빙냉 PBS를 함유하는 24 웰 플레이트에 배치로 얇은 주걱 또는 브러시를 사용하여 한번에 하나 PCLS 수집.
참고 : 실험 사이의 일관성을 유지하기 위해 조각을 유지하는 것이 중요합니다. 모든 폐 나이, 성별, 체중에 따라 다르지만, 10 번째 조각은, 예를 들어, 일반적으로 유사기도 크기 산출한다.
- 계정에 잠재적 인 형광 스펙트럼 중복 및 현미경의 탐지 기능을 가지고, 관심의 세포 유형에 따라 형광 태그 항체의 패널을 디자인합니다.
참고 : 다음과 같은 예를 들어, DC 서브 세트 검출 용 패널은 다음의 CD11c / 알파 X 인테그린 - BrilliantViolet (BV) (605) (인가 전압 : 405 nm의 발광 피크 : 605 ㎚), CD324은 / E-cadherin의 - 알렉사 488 (AF488 ) (인가 전압 : 488 nm의 발광 피크 : 519 ㎚), CD88 / C5Ra1 - 피코 에리 트린 (PE) (인가 전압 : 561 nm의 발광 피크 : 578 ㎚), CD103은 / 알파 E 인테그린 - 알로 피코시 아닌 (APC) (인가 전압 : 633 내지 발광 피크 : 660 ㎚). 형광 스펙트럼 뷰어 도구 (재료 목록 참조) 패널을 설계하는 데 유용합니다. - 원하는 항체를 포함한 항체 칵테일을 만든다.
- 정적 PCLS 이미징 1.5 ML의 microcentrifu 800 μL 염색 완충액 100 μL 프크 블로커, 50 μL 정상 마우스 혈청 및 50 μL 정상 쥐의 혈청을 추가1 mL의 총 부피에 대한 gation 튜브. 생균 이미징 대신 염색 완충액 10 % FBS (라이 보 비츠-10)을 함유하는 800 μL의 라이 보 비츠 매체 (1X)를 사용한다.
- 각 항체의 원하는 최종 농도를 조정하는 항체를 추가한다. 3 센티미터 접시에 항체 솔루션을 전송하고, 사용할 준비가 될 때까지 어둠 속에서 유지한다.
주 : (- 5 ㎍ / ㎖의 통상 1) 최종 농도가 필요 각 항체에 대해 최적화된다.
- 대형기도 또는 폐의 주변부로서 관심의 해부학 적 영역을 갖는 PCLS를 선택하고, 1 ㎖의 항체 용액을 포함하는 3-cm 접시에 놓는다.
- 30 또는 60 분 동안 천천히 흔들 얼음에 어두운 얼룩 PCLS,.
- 정적 PCLS 이미징 들어, 라이브 세포 이미징을 위해 섹션 4로 진행 섹션 5로 진행합니다.
PCLS 4. 정적 이미징
- 항체 PCLS 60 분 배양 후, t 디쉬로부터 상기 항체 용액을 제거하고 린스그는 1 mL의 얼음 차가운 PBS로 두 번 조각.
- 3cm 둥근 바닥 유리 접시 상에 50 μL 피펫 PBS. 주걱이나 붓을 사용하여, 평평해질 때까지 부드럽게 조각을 조작, 드롭에 스테인드 PCLS을 전송하고 확산. 피펫으로 PBS를 제거합니다. 슬라이스는 가능한 한 평평해야한다. 위의 절차는 광표백을 방지하기 위해 신속하게 수행 될 필요가있다.
- 슬라이스에 실온 장착 매체 1 방울을 넣고 부드럽게 플레이트의 웰에 유리 커버 슬립 놓는다. 이미징 전에 시간까지 4 ° C에서 어둠 속에서 PCLS을 유지합니다.
- 공 초점 현미경으로 볼 때, 20 배 목표를 (자료 목록을 참조)를 사용합니다. 은 "볼록 선체"설정에서 조직의 가장자리를 찾아 표시하기 위해 "타일"도구를 사용합니다. 이 타일 스캔 시간을 줄이는 데 도움이됩니다.
- Z 축 스택 범위를 설정하는 동안, 특히 가장자리 슬라이스의 여러 영역에서 확인 설정된 범위 그적합하다.
주 : Z-범위는 조직이 완전히 평평하게 누워에 도착하는 것은 매우 어렵 기 때문에 조직 자체의 두께보다 클 필요 전망이다. 슬라이스에 충돌 곡선을 수용하기 위해 250 ㎛의 - 예를 들어, 150 μm의 두께로 PCLS 상기 Z 스택 범위 가능성 (200)에 설정 될 필요가있다. 20 배의 대물 렌즈와 12 시간 - Z 축 스택 범위와 조직의 크기에 따라 각각의 전체 폐 스캔 (7) 사이를 취할 것이다. 각각의 폐는 고유하고 설정은 모든 실험 조정해야합니다.
PCLS 5. 라이브 세포 이미징
- 항체 PCLS의 30 분 인큐베이션 후에, 접시의 항체 용액을 제거하고 차가운 라이 보 비츠 10 mL로 1 회 조각을 헹군다.
- 신선한 50 μL 피펫 라이 보 비츠 - 10 커브 글라스 챔버 (8 개 슬롯)의 슬롯에 하나. , 매체에 PCLS를 전송하기 위해 주걱을 사용하여 슬라이스가 평평해질 때까지 부드럽게 조작하고 확산. 위의 절차필요 광표백을 방지하기 위해 신속하게 수행한다.
- 피펫을 사용하여 50 μL 매체를 제거합니다. 슬라이스는 가능한 한 평면 거짓말을하는 것입니다.
주 : 조각의 가장자리가 상기 챔버의 벽에 대해 수직으로 대칭되는 경우에 허용된다. 또한, 가능하다면, 금속 백금의 중량을 다음 단계로 진행하기 전에 슬라이스를 고정하는데 사용될 수있다. 잘라 작은 무게로 구부러 질 수 있습니다 백금 와이어의 한 예를 들어 첨부 자료 목록을 참조하십시오. - 4 ° C 냉장실에서 성장 인자 - 감소 된 100 μL 라이 보 비츠 10 페놀 레드없는 세포 외 기질을 100 μL를 혼합한다. 이를 위해 미리 냉각 된 피펫 팁을 사용하거나 세포 외 기질은 팁에 응고됩니다.
주 : 매트릭스 매질이 비율 (1 : 1) 조직 배양 조건에서 PCLS을 저장하기에 충분히 조밀 한 겔을 생성한다. - 부드럽게 혼합하는 행렬을 피펫 조심스럽게 젤은 루의 상단에가는 것을 확인의 PCLS 위에 피펫슬라이스를 겨, 그리고 조각이 젤 상단에 뜨지 않습니다. 겔 플레이트의 바닥에 내려 PCLS 정박 중량으로 작동한다.
- 조심스럽게 37 ℃ 배양기에 챔버 커버 글라스를 전송하고, 매트릭스 ~ 5 분 동안 응고하자.
- 공 초점 현미경의 사전 예열 단계에 전체 챔버의 coverglass을 전송합니다. 촬상에 걸쳐 37 ℃에서 챔버를 유지한다. 라이 보 비츠의 매체를 사용하는 경우 CO 2 공급은 세포 배양 중에 필요하지 않습니다.
- 프레임 간의 원하는 간격에 기초하여 상기 Z 스택 영역 및 타일의 범위를 설정한다. 공 초점 현미경으로 볼 때, 20 배 목표를 (자료 목록을 참조)를 사용합니다. (예를 들어, 2 × 2를 중심으로 그리드)은 "중심 그리드"설정을 사용하여 조직에 대한 관심의 영역을 나타 내기 위해 "타일"도구를 사용합니다.
- Z 축 스택 범위를 설정하는 동안 설정 범위가 적절한 슬라이스의 여러 영역에서 확인.
참고 : ZR앤지 조직의 두께와 동일 할 것. 각각의 폐는 고유하고 설정은 모든 실험 조정해야합니다. 2 × 2 타일 10 Z-스택은 일반적으로 1 ~ 프레임 / 2 분을 초래할 것이다. 확인 자동 초점 기능은 촬영 기간 동안 XY 및 Z-드리프트를 최소화하기 위해 실험을 시작하기 전에 활성화됩니다.
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Representative Results
C57BL / 6 마우스에서 두 개의 DC 서브 세트들의 위치, CD11b를 하이 CDCS 및 CD103 + CDCS, PCLS 식별로 절단하는 CD11c 특이 단일 클론 항체 (모노클로 날 항체)로 염색하고, CD88, CD103 및 CD324 (E-cadherin의). CD324 얼룩기도 상피 세포에 대한 항체 및 CD88은 대 식세포와 호중구,하지만 CDCS (8)에 표시됩니다. 이것은 우리의 CD11c + 대 식세포에서 CDCS를 구별하고,기도 (도 1)에 각 세포 유형의 공간적 관계를 관찰 할 수 있었다. 우리는 CD103 + CDCS는 주로기도와 subpleural 지역의 주위에있는 반면, CD11b를 하이 CDCS는 실질에 지역화 것을 발견했다. CD103 + CDCS 용이이 실험에서는 세포 표면 CD103 직접 염색에 의해 검출되었지만, CD11b를 검출 안녕하세요 CDCS는 CD88 및 CD103 얼룩의 유무에 의존했다. 직접적으로는 CD11b를 확인하려면CDCS 안녕, 우리는 먼저 광범위 면역에 사용하는 유동 세포 계측법 항 -CD11b 항체 (클론 M1 / 70)를 사용하여 얼룩 PCLS하려고. 그러나, 이러한 항체는 형광 색소가 항체에 결합 (도 2a 및 데이터는 도시되지 않음)에 관계없이 어느 한, 본 출원에서 높은 배경 낮은 특이성을 가지고 있었다. 대조적으로, CD172a (SIRP1α)에 대한 항체는 CD11b를 하이 CDCS 18 염색하지만 구조적하지 CD103 + 세포 CDCS (도 2B, 데이터는 도시하지 않음). 자신에 CD172a 항체는 CDCS 및 단핵구 또는 대 식세포 구별 할 수 없었다. 간질 성 대 식세포에서 (CD172a + CD88 +)와 CD11b를 하이 CDCS (CD172a + CD88 -) - 그러나, CD88 및 CD172a에 대한 항체와 공동 얼룩에 의해, 우리는 폐포 대 식세포 (CD88 + CD172a) 구별 할 수 있었고, 쇼를 그 후자의 세포가 우선적으로 지역화실질 아니라 상피 서브 영역 (도 2c - F) 계약, 우리의 결과는 이들 세포의 간접 염색하여 얻어진.
백혈구 내 조직 이전 연구는 말초 조직에서 수지상되는 트래픽을 통해 지역 림프절의 림프관의 그것들을 포함하여 구성 세포의 가시화를 필요로한다. 피부와 림프절에서 림프 혈관은 종종 LYVE-1 또는 Podoplanin에 단클론 항체를 사용하여 식별됩니다. 그러나 PCLS에서, 모노클로 날 항체는 LYVE-1 Podoplanin하고, 혈관 내피 세포 및 폐포 상피 세포 (데이터는 도시되지 않음)를 포함하는 다른 세포 유형의 다양한 염색하였습니다. 이 단클론 항체는 특히 PCLS에 림프관을 식별하기위한 때문에 제한 실용화 있습니다. 그러나, CD90.2 (Thy1.2) 공지 된 T 세포 마커, 표지 림프 구조에 대한 모노클로 날 항체는 다른 조직 (19), (20) (도 3A, B에 나타낸 바와 같이 이전 Prox1 촉진제 (21) (도 3A, C)의 전사 제어하에 트랜스 유전자에 의해 코딩 TdTomato 형광 단백질처럼. PROX1은 림프관 (22)에 필요한 마스터 전사 인자이다. Prox1 TdTomato 트랜스 제닉 마우스는 부신 수질 (21) 간, 렌즈, 및 치아 이랑 신경 내분비 세포와 같은 폐 및 다른 조직에서의 밝은 형광 림프관을 나타낸다. 사실,이 두 가지 표시 방법은 중복 염색 패턴 (그림 3D)를했다. 이러한 라벨링 방법을 사용하여, 우리는 CD103 + CDCS는 CD324 발현기도 상피 세포, 림프계, 그리고 subpleural 영역 (그림 3A, E) 등 여러 가지 해부학 적 영역에 존재 있음을 확인할 수 있었다.
정지 영상, 세포 이동 및 세포 외에하는 CELL 상호 작용은 PCLS (동영상 1)의 라이브 세포 이미징을 사용하여 기록 할 수 있습니다. PCLS 갓 GFP 발현 OT-II T 세포 OVA와 LPS 점적 주사를받은 마우스로부터 제조하고, CD103 (적색)과기도 상피 (CD324, 블루)에 대한 모노클로 날 항체로 염색하고 추적하기 위해 이미지화 된 CD103 + CDCS와 T 세포의 이동 OVA / LPS 점적 주입 후 16 시간. 비디오 (4 시간)의 과정 동안, CD103 + 수지상 세포 (적색)과 적응 적 전송 OVA 특정 T 세포 (녹색)과의 상호 작용의 동적 움직임을 명확하게 볼 (동영상 1)이다.
PCLS 염색 및 공 초점 현미경에 의해 공개로 CDC 부분 집합의 1. 뚜렷한 해부학 적 위치를 그림. A) 다양한 항체로 염색 미처리 된 C57BL / 6 마우스의 폐에서 전체 PCLS. 의 색상 각각의 분자 (맨 오른쪽)의 글자 색으로 표시된다. 노란색, 중 CD11c + CD88 + (대 식세포 (-; 흰색 CD103 +의 CD11c + CD88), CD11b를 하이 CDCS (빨간색은 CD11c + CD103 - - CD88) CD103 + CDCS : 개인 및 조합 염색은 다음과 관심의 세포 유형에 대한 색상을 제공합니다 ), 호중구 (중 CD11c - CD88 +, 녹색) 및기도 상피 세포 (CD324 + 청색). B - D)이 세트에서의 고배율. B) CD11b를 하이 CDCS는 실질에 지역화. C) CD103 +기도 주위 CDCS. 본능적 인 늑막 아래 D) CD103 + CDCS. 화이트 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
수지상 세포와 대 식세포의 그림 2. 염색. CD11b를 (블루)에 대한 항체와의 PCLS A)은 염색 PCLS에서 높은 배경을 제공한다. CD172a (그린 B) 항체)는 CD11b + 세포에 대한 PCLS 비교적 낮은 배경 큰 특이성을 갖는다. C) 그 색 글자 색 (맨 오른쪽)에 의해 지시되는 모노클로 날 항체로 염색 한 C57BL / 6 마우스의 항목 PCLS. 중 CD11c (적색), CD88 (시안), CD172a (녹색) 및 CD324 (파란색). CD11b를 하이 CDCS (중 CD11c + CD88 - CD172a +, 노란색), 폐포 대 식세포 (중 CD11c + CD88 + CD172a -; 핑크), 간질 성 대 식세포 (중 CD11c + CD88 + CD172a + 백색), 호중구 (중 CD11c - CD88 +, 시안) 및 기도 (CD324 + 청색). D - F) 인 세트의 높은 배율C에 도시. D) 하위 영역 흉막. E) 하위 상피 영역입니다. F) 간질. 간질 성 대 식세포는 실질에 지역화 및 폐포 대 식세포는 폐포에 있습니다. 레이블이없는 흰색 막대는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PCLS의 구조 세포의 그림 3. 라벨링. A) 전체 PCLS Prox1 tdTomato 마우스부터 제조하고, CD90.2 (녹색)에 단클론 항체로 염색 CD103 (흰색) 및 CD324 (파란색). Prox1 발현 세포 (적색) Prox1 유전자 프로모터 (Prox1-TdTomato)의 조절하에 TdTomato으로 표시된다. B - E) 인 세트에서의 높은 배율
영화 1. T 세포는 폐에서 CD103 + CDCS와 상호 작용합니다. T 세포 (녹색)과 상호 작용 CD103 + CDCS (적색)의 라이브 세포 이미징. OVA 특이 OT-II Nur77의 GFP 마우스로부터 분리 된 CD4 + T 세포는 시험관 내에서 수지상 세포 및 비장 OVA 자극 및 적응 적 헝겊으로 옮겼다 - / - 마우스. 2 시간 후,받는 사람 마우스 처리 재치기도에 시간 OVA / LPS 점적. 16 시간 OVA / LPS 처리 후, PCLS가 만들어 염색하고, 37 ℃에서 4 시간 동안 묘화 하였다. 시차 화상 (분) 기록이 도시되어있다. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭합니다.)
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 원래의 폐 CDCS의 두 부분 집합의 위치를 시각화하기 위해 개발되었다. 그러나,이 프로토콜은 쉽게 세포 생존 및 폐의 3 차원 구조를 유지하면서, 다양한 세포 유형을 공부하고 적용 할 수 있습니다. 후자의 기능은 세포 배양 시스템에 비해 중요한 장점이다 희귀 세포 유형의 식별을 용이하게한다. 상기 방법은 폐에서 PCLS의 발생에 의존하고, 배경 얼룩을 최소화하면서 항체의 적절한 조합이 특정 세포 유형을 식별. 큰 정도,이 유동 세포 계측법을 포함한 다른 응용 프로그램에서 잘 작동 항체가 반드시 PCLS을 염색 잘 작동하지 않기 때문에 경험적인 운동이다. 우리는 이미이 점에서 상당한 진전을 만들었습니다, 그러나 여기에서 다루지 않은 세포 유형을 공부하고자하는 연구자들은 서로 다른 항체를 테스트하고 형광 색소와 농도를 최적화 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여, 우리는 CD103 + CDCS와 CD11b를 하이 CDCS는 폐에있는 개별의 지역화에있는 것을 발견했다. CD11b를 하이 CDCS 주로 실질에서 발견 된 반면, 정상 상태에서, CD103 + CDCS는기도 주위와 subpleural 영역에서 검출된다. 우리는 여기에 설명되는 프로토콜은 세포 내 분자를 염색하기에 적합하지 않지만, 그 촬상 세포 표면 표지뿐 아니라 분비 분자 유용하다. 따라서, 우리는 PCLS에서, 케모카인, CCL21 및 CCL19를 검출 할 수 있었다 (결과 미도시). 약한 형광 신호 차 항체를 사용하여 볼 경우는 그 신호를 증폭하는 이차 항체를 사용하는 것이 가능하다.
PCLS의 생균 비디오 이미징을 수행하는 주요 과제 충분히 4-H 현미경 기간 동안 상당한 xy- 및 z 드리프트를 방지하기 위하여 배양 배지에서 조직을 고정 하였다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 실험다른 실온에서 고체 인 세포 외 매트릭스의 라이 보 비츠 매체의 비율과 결정과 1 : 1 비율은 세포 생존과 안정된 3 차원 구조를 유지 하였다. 이후 이미지 프로세싱 동안, 우리는 또한 추가적인 부수 XY 또는 Z - 시프트 (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx 제거 TurboReg 및 StackReg라는 ImageJ에 플러그인 일련의 활용? ID = 18,226). 공 초점 현미경의 자동 초점 도구를 사용하여 관심 영역은 전체 주사 기간 동안, 특히 Z-범위에서 초점이 유지되었다. PCLS의 라이브 세포 이미징 동안 또 다른 문제는 현미경의 타일 스캔, Z-스택, 시계열 및 자동 초점 기능을 활용했다. 각 프레임 사이의 시간을 최소화하기 위해, 균형은 각 타일을 스캔 소요되는 시간 사이에 공격해야합니다. 각각의 연구 프로젝트에서 스캔 시간을 최적화하기 위해 Z - 스택 번호, 타일, 스캔 속도는 조절 될 필요가있다.
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Disclosures
저자는 선언하는 이해 관계의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 현미경과의 도움을 제프 터커, 에리카 스카피니, 그리고 아그네스 Janoshazi 감사합니다, 비판적 읽기 마우스 식민지의 그녀 관리를위한 라이곤 페로우 및 준 첸와 마이클 샌더슨 조직 슬라이서에 대한 도움말, 마이클 Fessler 데릭 가인 원고. 이 작품은 결과적으로 보건 복지부가 후원하는 NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09)의 교내 지점에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
