Summary
אנו מתארים שיטה לייצור פרוסות ריאה-לחתוך Precision (PCLS) ו immunostaining להם לדמיין את הלוקליזציה של סוגי תאים שונים חיסוניים הבריא. פרוטוקול שלנו ניתן להאריך לדמיין את המיקום והתפקוד של סוגי תאים שונים תחת מגוון של תנאים.
Abstract
שאיפת אלרגנים ופתוגנים מעוררת שינויים מרובים במגוון סוגי תאים חיסוניים הריאה. Cytometry זרימה היא טכניקה רבת עוצמה לניתוח כמותי של חלבונים בתא השטח על תאי מערכת החיסון, אבל זה לא מספק מידע על דפוסי לוקליזציה והגירה של תאים אלה בתוך הריאה. בדומה לכך, מבחני chemotaxis ניתן לבצע כדי לחקור את הפוטנציאל של תאים להגיב גורמי chemotactic במבחנה, אך אלה מבחנים אינם מתרבים בסביבה המורכבת של הריאה השלמה. בניגוד לטכניקות הנ"ל, המיקום של סוגי תאים בודדים בתוך הריאה ניתן מדמיין בקלות על ידי יצירת פרוסות ריאה-לחתוך Precision (PCLS), השאיר זמין מסחרי, נוגדנים מתויגים פלורסנטי, באופן חזותי את הסעיפים על ידי מיקרוסקופ confocal. PCLS יכול לשמש הוא לחיות קבועות רקמת ריאה, ואת הפרוסות יכולות להקיף תחומים גדולים כמו חתך של אונה כולו. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי להמחיש את המיקום בהצלחה במגוון רחב של סוגי תאים בתוך הריאה, כולל סוגים שונים של תאים דנדריטים, מקרופאגים, נויטרופילים, תאי T ותאי B, כמו גם תאים מבניים כגון הלימפה, אנדותל, וכן תאי האפיתל. היכולת לחזות אינטראקציות הסלולר, כגון אלו בין תאים דנדריטים ותאי T, ב live, רקמת הריאה תלת ממדי, יכול לחשוף כיצד תאים לנוע בתוך הריאה ולתקשר אחד עם השני על מצב יציב ובמהלך דלקת. לפיכך, כאשר נעשה שימוש בשילוב עם טיפולים אחרים, כגון זרימת cytometry וכמותיים PCR, PCLS יכול לתרום להבנה מקיפה של האירועים הסלולר העומדים בבסיס מחלות אלרגיות ודלקתיות של הריאה.
Introduction
בעקבות שאיפה של גירויים פרו-דלקתיים כגון lipopolysaccharide (LPS), ישנה תנועה מתואמת של תאי מערכת החיסון לתוך, בתוך, ומן הריאות. לדוגמא, נויטרופילים מגויסים במהירות אל parenchyma הריאות בדרכי הנשימה. בנוסף, כמה תאי מציגי אנטיגן מקצועיים המכונים תאי דנדריטים קונבנציונליים (cDCs) עוברים דפוס הגירה מורכב יחסית 1, 2. ניתן לזהות cDCs באמצעות cytometry הזרימה, מבוססת בחלקה על התצוגה שלהם של הסמן משטח, CD11c. תת ברור של DCs ניתן להבחין על ידי ביטוי משטח הפרש של CD103 ו CD11b 3. לאחר רכישת אנטיגן בשאיפה, כמה cDCs לצאת ריאות ולהעביר דרך כלי הלימפה כדי לנקז-ריאה בלוטות לימפה (LNs) שבו הם מציגים פפטידים אנטיגן ספציפי בתאי T 4. זהו אירוע מוקדם קריטי בייזום של r אדפטיבית החיסוניתesponses. מסיבות שאינן ידועות, אולם, לא כל cDCs כי ירכשו אנטיגנים בשאיפה לעזוב את הריאות, ורבי תאים אלה נשארים כי איבר במשך כמה חודשים 5, 6. תצפית זו יכולה להיות חלקית מוסברת על ידי שושלת התפתחותיות של תאים אלה משום CD11c נגזר מונוציטים + תאים שחסרו את הקולטן chemokine, CCR7, אינן מסוגלות להעביר LNs האזורית 7, 8. סביר להניח כי פוטנציאל ההגירה של cDCs נקבע גם, לפחות בחלקה, על ידי העמדה האנטומי שלהן בתוך הריאה. עם זאת, הלוקליזציה המדויקת של אוכלוסיות שונות אלה של cDCs הבריאה לא מאופיינת במלואו. ידע משופר של לוקליזציה תא חיסון בתוך הריאות, ושל המולקולות לכוון אותו, נדרש הבנה טובה יותר של איך המערכת החיסונית של הריאות הופכת מופעלת.
PCLS שמתבצע הגדלהly בשימוש כגישה לשעבר vivo לדמיין אינטראקציות מיצוב תא-תא הסלולר, תוך שמירה על שלמות מבנית של אדריכלות ריאות 9, 10. PCLS שמש ללמוד ריאות של מינים רבים, כוללים עכברים, בקר, קופים, כבשים, סוסים, ובני אדם 11. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא כי כ 20 פרוסות ניתן להכין מן אונה יחידה של ריאות עכבר, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים ניסויים בודדים. כמעט כל סוגי תאים חיסוניים, כולל DCS, מקרופאגים, נויטרופילים, ותאי T, נמצאים PCLS ולתחזק מבנים הרגיל שלהם.
PCLS יכול לשמש גם כדי ללמוד סידן איתות התכווצות של תאי דרכי הנשימה ואת שריר חלק לאחר הטיפול עם אצטילכולין 12 או methacholine 13. בגישה זו, רק חלק קטן של הריאות הואalyzed מיקרוסקופית, אבל מחקר אחד דיווח כי מדידות של כיווץ דרכי הנשימה PCLS להשתנות רק על 10% מן פרוסה לחתוך, ושונות זו דומה לזו לראות באמצעות בדיקת תפקודי ריאה בבעלי חיים שלמים 14. חוקרים אחרים השתמשו PCLS כגישה לשעבר vivo לחקר שינויי סמני משטח ביטוי ציטוקינים ותא לאחר דגירה עם LPS 15. PCLS גם שמש מודל vivo לשעבר של כיווץ כלי דם ריאתי היפוקסי בעורקי תוך acinar קטנים. כלים אלה נמצאים בחלק של הריאה כי לא ניתן להגיע באמצעות הליכים אחרים, כולל הקלטות מפלחים עורקי גזור או ניתוח של כלי subpleural 16. במעבדה שלנו השתמשה PCLS בעיקר לדמיין לוקליזציה תא החיסון ברקמת הריאה חי על מצב יציב ובעקבות גירוי דלקתי in vivo. הנהלים פתחנו לכך הם כדלקמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלים Animal ניסיוני המתואר במאמר זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים NIEHS ושימוש (IACUC).
1. הכנת ריאות
- עכברים בבית בין 6 ו 12 שבועות של גיל בתנאים הפתוגן ללא ספציפיים בהתאם להנחיות שסופקו על ידי ועדות הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש.
הערה: עכברים צלמו יכולים להיות נאיביים, או מטופלים, בהתאם לכל תחומי העניין הספציפיים של חוקר. כאן, אנו מתארים לוקליזציה תא חיסון בעכברים נאיביים בעכברים שטופלו 100 מיקרוגרם ovalbumin (OVA) ו 0.1 מיקרוגרם lipopolysaccharide (LPS), באמצעות פוספט בופר (PBS) ככלי בהיקף כולל של 50 μL. כדי oropharyngeally להנחיל OVA / LPS לתוך דרכי הנשימה, חיות היו מורדמים עם שאיפה isoflurane ו מושעה אנכית על ידי השיניים שלהם עם גומייה. הלשון היתה תפס בעדינות עם מלקחיים והחזיק לצד אחד כדי למנוע בליעה, ו 50 & #181; L של פתרון OVA / LPS שהופקד בחלק האחורי של חלל הפה כפי שתוארו לעיל 17. - להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneal של pentobarbital נתרן (100 מ"ג / ק"ג), ואת הסיכה חיה לבסיס פוליסטירן.
- פתח את חלל הבטן עם מספריים על ידי חיתוך העור הצפק מאמצע הבטן עד הלסת. משוך את המעיים הצידה עם מלקחיים או בצד הקהה של המספריים, וחתוך את הווריד הנבוב הנח לנקז דם הרחק ריאות. נקב את הסרעפת עם קצה חד של מספריים כדי לאפשר הרחבת בית החזה, נזהרים שלא לחתוך את הריאות.
- בלוטות רוק מנקים ורקמות אחרות הרחק קנה הנשימה על ידי גרירה של הרקמה ידנית משייכתו הרחק קנה נשימה הבסיסית עם מלקחיים. ביצוע חתך קטן קנה הנשימה בצד הקדמי של הלהקה העבה של סחוס באמצעות מלקחיים קנס או מספריים, נזהרים שלא לחתוך כל הדרך למרות traצ'יאה. החתך יהיה גדול מספיק כדי לאפשר מחט 20 G כדי לעבור.
- חלק מחט 1.5 אינץ ', 20 G על קטע של צינורות פוליאתילן, והשאיר כ 1 סנטימטר של צינורות מעבר לסוף המחט. חותכים את צינורות בזווית של כ 45 מעלות כדי שפוע הקצה, לצרף את המחט למזרק 1 מ"ל, ולטעון את המזרק על ידי ציור 0.8 מ"ל של חם (40 מעלות צלזיוס) 2% נקודת התכה נמוכה agarose דרך המחט.
- מניחים את הקצה של הצינור לתוך החתך של קנה הנשימה לאט להזריק את agarose לתוך הריאות. מבלי להזיז את המחט או מזרק, ידביק את המזרק לבסיס פוליסטירן כדי להבטיח את המחט נשארת בתוך קנה הנשימה.
הערה: לאחר הזרקה, הריאות תהיינה גדולות מנופח בתוך החזה. האונות התקינה להרחיב הראשונה, ואחריה האונה השמאלית. אם רק אחד אונה מתרחבת, המחט הוכנסה עמוקה מדי (בעבר הסמפונות), וזה יהיה צורך לשלוף אותו מעט לפני שתמשיך. חלק זה שלהליך שצריך לעשות יחסית מהר, לפני agarose מתחיל לגבש. - מניח את העכבר, עם בסיס המזרק עדיין מוכנס בתוך קנה הנשימה, בחדר או מקרר קר עבור דק '10 לפחות. במידת צורך, החיה יכולה להישמר שם עד כמה שעות, גם אם שימשיך נדידת תאי תמונה על ידי מיקרוסקופ וידאו.
- לאחר העכבר הוא קר, בזהירות שיחתוך את הריאות מנופח agarose באמצעות מספריים, ומניחים אותם בצלחת 3 ס"מ עם קרח קר PBS. שמור על הקרח.
- בחר את האונה הרצויה עבור חיתוך רקמות (למשל, באונה מעולה מימין). ודא שהחלק הפנימי של הריאות (במקום חיבור שלו קנה נשימה) הוא עם הפנים כלפי מטה בצלחת.
הערה: האונה בשימוש והכיוון שלה על הבוכנה יקבע את גודל כלי ובדרכי הנשימה כי יהיה גלוי. האורינטציה המתוארת כאן היא אידיאלית עבור להדמיה של דרך נשימה גדולה, ואת parenchyma. יש עכברים אונה אחת גדולה שמאל ארבע אונות קטנות בצד הימין. להדמית PCLS הבא כניסתה של אלרגנים לתוך הריאות באמצעות לוע תחתון או שאיפת אפי, באונה המעולה התקינה מחולקת בדרך כלל, בין שאר משום שמדובר בגודל נוח, אבל גם בגלל סוכנים בשאיפה לפיזור אחיד בתוכה. עם זאת, אונות אחרות, במיוחד באונה השמאלית, יכולות להיות גם למדו. כאשר משווים זני עכבר או טיפולים, חשוב להשוות אותו האונה.
2. חיתוך ריאות
הערה: הפוך פרוסים באמצעות מבצעה אוטומטי, מתכת קירור בלוק, בוכנה במזרק מתכת, בהתאם להוראות היצרן.
- שים טיפה קטנה של כל המטרה, דבק מגע ג'ל ללא ריצה על הבוכנה ולהפיץ את הדבק בתנועה מעגלית, נזהר שלא לתת הדבק לגעת בצידי מזרק המתכת. אם הדבק נוגע בצידי המזרק, זה יהיה להדביק את מזרק בוכנה ביחד.
- מיד לאחר כיסוי הבוכנה עם דבק, בעדינות לתפוס אתאונה ניכרת עם מלקחיים עם הצד קנה הנשימה למטה, מורחת אותו על רקמה להסיר עודפי נוזלים, ובזהירות למקם אותו על גבי הבוכנה. חתוך כל רקמה נוספת משתרעת מעבר לקצה הבוכנה.
- הזז את הבוכנה כלפי מטה כדי שהצדדים של מזרק המתכת לעלות מעל הרקמה, יצירה היטב עם הריאות מודבקות בתחתית, לא יותר מאשר כמה סנטימטרים עמוקים. סרט סביב החלק התחתון של מזרק המתכת להחזיק בעמדה זו במקום.
- יוצקים בזהירות נמוכה להמיס agarose 2% ב 40 ° C לתוך הבאר, כך שהוא רק מכסה את החלק העליון של האונה.
- הקף את המזרק מתכת עם בלוק מצמרר-קר קרח לקרר את האונה ו agarose עבור 1 - 2 דקות.
הערה: קירור זמן קצר של agarose סביב הרקמה עלולה להוביל להתפוררות agarose במהלך חיתוך, אשר עלול לגרום PCLS לחתוך בצורה לא אחידה. - טען את המזרק הדגים לתוך מבצעה האוטומטי למלא את טנק החיץ עם PBS הקר כקרח. יישר את צעד כונן מנוע עם המזרק דגימה ולהסיר את הנייר דבק מלמטה. הפעל את המתג קדימה מהר (FF) עמד עד שכונן מנוע הצעד פשוט נוגע בחלק האחורי של הבוכנה.
- יישר את הלהב הטרי עם מזרק הדגימה. עובי רקמת סט, רציף / יחיד פרוס, תנודה ומהירות של מבצעה. לדוגמא, עובי רקמה: 150 מיקרומטר, חיתוך רציף (המשך.), תנודה: 9, ומהירות: 3 - 4. לחצו על Start. ההגדרות שלמעלה צריכות להיות מותאמים מפרטי מבצעה האוטומטיים הספציפיים.
- בעזרת מרית או מכחול דק, לאסוף את PCLS אחד בכל פעם כפי שהם נופלים לתוך טנק החיץ ומניחים אותם בצלחת 24-היטב המכילה קרח קר PBS.
הערה: חשוב לשמור על הפרוסות על מנת לשמור על עקביות בין ניסויים. למרות כל הריאה משתנה בהתאם לגיל, מין ומשקל, פרוסה 10 th, למשל, בדרך כלל תשואות בגודל דרכי הנשימה בצורה דומה.
- עיצוב פאנל של נוגדנים מתויג fluorescently בהתאם לסוג התא של עניין, תוך התחשבות הפוטנציאל חפיפה ספקטרלית ניאון ואת יכולות זיהוי של המיקרוסקופ.
הערה: כדוגמה, פאנל לגילוי משנה DC הוא כדלקמן: CD11c / אלפא integrin X - BrilliantViolet (BV) 605 (עירור: 405 ננומטר, שיא פליטת: 605 ננומטר), CD324 / E-cadherin - אלקסה 488 (AF488 (עירור): 488 ננומטר, פליטת שיא: 519 ננומטר), CD88 / C5Ra1 - Phycoerythrin (PE) (עירור: 561 ננומטר, פליטת שיא: 578 ננומטר), CD103 / אלפא E integrin - Allophycocyanin (APC) (עירור: 633 ננומטר , פליטת שיא: 660 ננומטר). כלי קרינה הצופה ספקטרלי (ראו רשימת חומרים) שימושיים לעיצוב פנלים. - תן קוקטייל נוגדנים המכיל את הנוגדנים הרצויים.
- עבור הדמיה PCLS סטטי, להוסיף 800 μL חיץ מכתים, 100 חוסם Fc μL, 50 μL סרום עכבר רגיל, ו 50 μL סרום חולדה נורמלית microcentrifu 1.5 מ"לצינור gation עבור נפח כולל של 1 מיליליטר. הדמיה תא חי, להשתמש 800 בינוני של μL ליבוביץ (1x) המכיל 10% FBS (ליבוביץ-10) במקום חיץ מכתים.
- הוספת נוגדנים כדי להתאים ריכוז סופי רצוי של כל נוגדן. מעבירים את הפתרון נוגדן לצלחת 3 ס"מ, ולשמור בחושך עד מוכן לשימוש.
הערה: הריכוזים הסופיים צריכות להיות מותאמת עבור כל נוגדן בודד (בדרך כלל 1 - 5 מיקרוגרם / מיליליטר).
- בחר PCLS עם שטח אנטומי של עניין, כגון דרכי הנשימה גדול או בפריפריה של הריאה, ומניחים בצלחת 3 ס"מ המכיל פתרון נוגדן 1 מ"ל.
- PCLS הכתם בחושך, על קרח, נדנדה לאט במשך דקות 30 או 60.
- עבור הדמיה PCLS סטטי, המשך לסעיף 4. הדמיה תא חי, המשך לסעיף 5.
4. הדמיה סטטי של PCLS
- לאחר 60 דקות דגירה של PCLS עם נוגדנים, להסיר את פתרון נוגדן מצלחת ולשטוף tהוא פרוסות פעמיים עם 1 מ"ל קרח קר PBS.
- פיפטה 50 μL PBS על צלחת זכוכית התחתונה עגול 3 ס"מ. בעזרת מרית או מכחול, להעביר את PCLS מוכתם עד הטיפה, מניפולציה של הפרוסה בעדינות עד שהוא שטוח ופרש. הסר את PBS עם טפטפת. הפרוסה צריכה לשקר שטוחה ככל האפשר. התהליך המתואר לעיל צריך להתבצע במהירות כדי למנוע photobleaching.
- מניחים 1 טיפה של המדיום גובר בטמפרטורת החדר על פרוסה בעדינות ושחרר coverslip זכוכית לתוך הבאר של צלחת. שמור PCLS בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שעה לפני הדמיה.
- בעת ההצגה תחת מיקרוסקופ confocal, להשתמש מטרת 20X (ראה רשימת חומרים). השתמש באפשרות "אריח" לאתר ולסמן את הקצוות של הרקמה בסביבה "קמור". זה יעזור להפחית את זמן סריקת האריח.
- בעוד הגדרת טווח Z- מחסנית, מאמת ברמת אזורים מרובים של הפרוסה, במיוחד לאורך הקצוות, כי טווחי הסטמתאימים.
הערה: טווח z סביר להניח שיידרש להיות גדול מ העובי של הרקמה עצם כי זה מאוד קשה לקבל את הרקמה להניח שטוחה לחלוטין. לדוגמה, עם PCLS עבה 150 מיקרומטר, בטווח Z- מחסנית סביר להניח שאתה צריך להיות מוגדר 200 - 250 מיקרומטר כדי להכיל בליטות עקומות של הפרוסה. בהתאם לטווח Z- מחסנית ואת הגודל של הרקמות, כל סריקת ריאות מלאה תיקח בין 7 - 12 h עם מטרת 20X. ריאות הן ייחודיות וההגדרות חייבות להיות מותאמות עבור כל ניסוי.
5. הדמיה של תא חי PCLS
- לאחר 30 דקות הדגירה של PCLS עם נוגדנים, להסיר את הפתרון נוגדן מצלחת ולשטוף את פרוסות פעמיים עם 1 מ"ל קר ליבוביץ-10.
- פיפטה הטרי 50 μL ליבוביץ-10 לתוך חריץ אחד של coverglass חדרים (8 חריצים). להשתמש במרית להעביר את PCLS למדיום, בעדינות מניפולציה אותו עד הפרוסה שטוחה פרושים. התהליך המתואר לעילצריך להתבצע במהירות כדי למנוע photobleaching.
- הסר את המדיום 50 μL בעזרת פיפטה. הפרוסה היא לשכב שטוחה ככל האפשר.
הערה: זה מקובל אם הקצוות של הפרוסה הם הורמו למעלה אנכיים על הקיר של החדר. יתר על כן, אם קיים, משקל פלטינה מתכת יכול לשמש כדי לעגן את הפרוסה לפני שתמשיך לשלב הבא. ראה רשימת חומרים המצורפת למשל אחד של חוט פלטינה שניתן לגזור כפוף לתוך משקולות קטנות. - בחדר קר 4 ° C, לערבב 100 μL של צמיחה מופחתת גורם, מטריקס האדום ללא פנול עם 100 μL ליבוביץ-10. השתמש בעצות פיפטה precooled לכך, או מטריקס יהיה לגבש בקצה.
הערה: יחס זה של מטריקס ובינוני (1: 1) יוצרת ג'ל סמיך מספיק כדי להחזיק את PCLS למטה בתנאים-בתרבית רקמה. - בעדינות פיפטה המטריצה לערבב, ו פיפטה בזהירות על גבי PCLS, ולוודא כי הג'ל ממשיך העליון של lung פרוסה, וכי הפרוסה שלא תצוף למעלה על גבי הג'ל. הג'ל אמור לעבוד כמו משקל, עיגון PCLS מטה אל החלק התחתון של הצלחת.
- להעביר בזהירות את coverglass החדרים חממה 37 ° C ולתת המטריצה לחזק עבור ~ 5 דק '.
- העבר coverglass החדרים כולו על הבמה המחוממת מראש של מיקרוסקופ confocal. שמור על החדר ב 37 מעלות צלזיוס במשך הדמיה. אספקת CO 2 אינה נדרשת במהלך הדגירה התא בעת שימוש בינוני של ליבוביץ.
- הגדר את טווח טווח אריח Z- מחסנית מבוסס על המרווח הרצוי בין מסגרות. בעת ההצגה תחת מיקרוסקופ confocal, להשתמש מטרת 20X (ראה רשימת חומרים). השתמש באפשרות "אריח" כדי לציין את האזור של עניין הרקמה, באמצעות הגדרת "ממורכז רשת" (למשל, רשת מרוכז 2x2).
- בעוד הגדרת טווח Z- מחסנית, מאמת ברמת אזורים מרובים של הפרוסה כי טווחי הסט מתאימים.
הערה: ZRAnge צפויה להיות שווה את עובי הרקמה. ריאות הן ייחודיות וההגדרות חייבות להיות מותאמות עבור כל ניסוי. אריחי 2x2 ו 10 Z- ערימות יגרמו בדרך כלל ~ 1 מסגרת / 2 דקות. ודא שפונקציית המיקוד האוטומטי מופעלת לפני תחילת הניסוי כדי למזער XY ו- Z-נדידה בתקופת ההדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לזהות את המיקום של שני תת DC, cDCs היי CD11b ו CD103 + cDCs, PCLS C57BL / 6 עכברים נחתכו מוכתם נוגדנים חד שבטיים (מבז) הספציפיים CD11c, CD88, CD103, ו CD324 (E-cadherin). נוגדנים לתאי האפיתל בדרכי הנשימה כתם CD324, ו CD88 מוצג על מאקרופאגים נויטרופילים, אך לא cDCs 8. זה איפשר לנו להבחין cDCs מן CD11c + מקרופאגים, כדי לבחון את הקשר המרחבי של כל סוג תא אל דרכי הנשימה (איור 1). מצאנו כי cDCs היי CD11b למקם את parenchyma, ואילו CD103 + cDCs מתגוררים בעיקר סביב דרכי הנשימה ואת אזור subpleural. למרות CD103 + cDCs התגלו בקלות על ידי מכתים ישיר של CD103 פני תא בניסוי זה, הגילוי של CD11b היי cDCs הסתמך על היעדר מכתים CD88 ו CD103. כדי ישירות לזהות CD11bהיי cDCs, ניסינו הראשון PCLS כתם באמצעות מב אנטי CD11b (שיבוט M1 / 70), אשר נמצא בשימוש נרחב אימונוהיסטוכימיה cytometry הזרימה. עם זאת, מב זה היה רקע גבוה וספציפי נמוכים בבקשה זו, לא משנה איזו fluorochromes היו מצומד אל מב (איור 2 א, ו מידע לא מוצג). לעומת זאת, נוגדנים ל CD172a (SIRP1α) מוכתם CD11b היי cDCs 18, אבל לא התאים מבניים או CD103 + cDCs (איור 2B, וכן מידע לא מוצג). ביום משלהם, נוגדנים ל CD172a לא יכול להפלות בין cDCs ומונוציטים או מקרופאגים. עם זאת, על ידי שיתוף מכתים עם נוגדנים כנגד CD88 ו CD172a, הצלחנו להבחין מקרופאגים המכתשית (CD172a - CD88 +) מ מקרופאגים ביניים (CD172a + CD88 +), ו cDCs היי CD11b (CD172a + CD88 -), ולהראות כי התאים האחרונים למקם מעדיפים אתparenchyma, לא באזור תת-אפיתל (2C איור - F), בהסכם עם שהושגו התוצאות שלנו על ידי מכתים עקיף של תאים אלה.
לחקר נדידת התוך-רקמה של לויקוציטים דורש ויזואליזציה של תאים מבניים, כולל אלה של הלימפה, שדרכו תנועה DCs מרקמות היקפי LNs האזורי. בעור LNs, כלי הלימפה מזוהה לעתים קרובות באמצעות מבז כדי LYVE-1 או Podoplanin. עם זאת, מצאנו כי ב PCLS, מבז כדי LYVE-1 ו- Podoplanin להכתים מגוון של סוגי תאים אחרים, כולל האנדותל של כלי הדם ואת אפיתל המכתשית (מידע לא מוצג). מבז אלה הם אפוא שימוש מעשי מוגבל לזיהוי כלי הלימפה במיוחד PCLS. עם זאת, מבז כדי CD90.2 (Thy1.2), סמן תא ידוע T, מבנים הלימפה שכותרתו, כפי שהוצג קודם ברקמות אחרות 19, 20 (איורים 3 א, ב Prox1 21 (איור 3 א, ג). PROX1 הוא גורם שעתוק master הדרוש lymphangiogenesis 22. Prox1 tdTomato עכברים טרנסגניים מפגינים כלי הלימפה ניאון בהירים בתוך הריאות ורקמות אחרות כגון כבד, עדשה, תאי gyrus ו נוירואנדוקריניים משונן של לשד הכליה 21. ואכן, שיטות התיוג שני אלה נתנו דפוסי מכתים חופפים (איור 3D). באמצעות גישות תיוג אלה, הצלחנו לקבוע כי CD103 + cDCs נכחו בכמה אזורים אנטומיים, כולל אפיתל CD324-להביע בדרכי הנשימה, את lymphatics, והאזור subpleural (איור 3A, E).
בנוסף הדמיה סטטי, תנועת תא תא CELאינטראקציות l ניתן להקליט באמצעות הדמיה של תא חי PCLS (סרט 1). PCLS הוכנו טרי מעכברים שקיבלו זריקות של תאי GFP להביע OT-II T ו החדרה של ביציות LPS, מוכתם מבז נגד CD103 (אדום) ו האפיתל בדרכי הנשימה (CD324, כחול), ו הם צילמו כדי לעקוב אחר תנועה של CD103 + cDCs ו- T תאים 16 שעות לאחר החדרת OVA / LPS. במהלך הוידאו (4 h), התנועה הדינמית של CD103 + DCS (אדום) ואת תאי T הועבר adoptively ספציפי OVA (ירוק) ואת האינטראקציה שלהם גלויים לעין (סרט 1).
איור 1. מיקומים אנטומי מובהק של קבוצות משנה CDC כפי שנחשף על ידי PCLS מכתים Confocal מיקרוסקופית. א) PCLS שלמים מתוך ריאות עכבר מטופל C57BL / 6 מוכתם נוגדנים שונים. הצבע מולקולה כל מסומן על ידי צבע הגופן שלה (למעלה מימין). מכתים הפרט קומבינטורית נותן את הצבעים הבאים עבור סוגי תאים של עניין: CD103 + cDCs (CD103 + + CD11c CD88 -; לבן), CD11b היי cDCs (CD11c + CD103 - CD88 -; אדום), מקרופאגים (CD11c + CD88 +; צהוב ), נויטרופילים (CD11c - CD88 +; ירוק) ותאי אפיתל בדרכי הנשימה (CD324 +; כחול). B - D) גדלה גבוהה של השיבוצים א. B) cDCs היי CD11b למקם את parenchyma. ג) CD103 + cDCs סביב דרכי הנשימה. D) CD103 + cDCs מתחת הצדר הקרבי. ברים לבנים לציון 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מכתים של DCS ו המקרופאגים. א) מכתים של PCLS עם נוגדנים ל CD11b (כחול) נותן רקע גבוה PCLS. B) נוגדנים CD172a (ירוק) יש רקע יחסי נמוך PCLS וספציפית יותר עבור CD11b + תאים. ג) PCLS השלם של C57BL / 6 עכברים מוכתמים מבז שצבע מסומן על ידי צבע גופן (למעלה מימין). CD11c (אדום), CD88 (ציאן), CD172a (ירוק) ו CD324 (כחול). CDCs היי CD11b (CD11c + CD88 - CD172a +; צהוב), מקרופאגים המכתשית (CD11c + CD88 + CD172a -; ורוד), מקרופאגים ביניים (CD11c + CD88 + CD172a +; לבן), נויטרופילים (CD11c - CD88 +; ציאן) ו דרכי הנשימה (CD324 +; כחול). D - F) הגדלה גבוהה של שיבוציםמתואר C. D) אזור תת-צדר. E) תת-האפיתל באזור. F) interstitium. מקרופאגים ביניים למקם את parenchyma, מקרופאגים המכתשית נמצאים alveoli. ברים לבנים ללא תווית לציון 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
תיוג איור 3. תאים מבניים PCLS. א) שלמים PCLS שהוכן Prox1 tdTomato העכבר, ומוכתם מבז כדי CD90.2 (ירוק), CD103 (לבן) ו CD324 (כחול). Prox1 להביע תאים (אדום) מסומנים גנטי עם tdTomato תחת הרגולציה של אמרגן Prox1 (Prox1-tdTomato). B - E) הגדלה גבוהה של הבלעה
תאי סרט 1. T אינטראקציה עם CD103 + cDCs הבריאה. הדמיה של תא חי CD103 + cDCs (אדום) אינטראקציה עם תאי T (ירוק). תאי CD4 + T מבודדים מעכברים ספציפי OVA OT-II Nur77 GFP היו מגורה עם DCs הטחול ואת OVA במבחנה, והועברו adoptively לתוך Rag - / - עכבר. שנינות 2 h מאוחר, עכבר הנמען טופלOVA h / LPS החדרה אל דרכי הנשימה. 16 שעות לאחר טיפול OVA / LPS, PCLS נעשה, מוכתם צלם במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. זמן הקלטת תמונה (דקות) מוצג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון הזה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן פותח במקור כדי להמחיש את מיקומם של שתי תת של cDCs בתוך הריאה. עם זאת, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד סוגי תאים שונים, תוך שמירה על כדאיות התא ואת הארכיטקטורה תלת ממדי של הריאה. התכונה השנייה היא יתרון חשוב על פני מערכות תרבית תאים ומקל זיהוי של סוגי תאים נדירים. השיטה מסתמכת על הדור של PCLS מן הריאות, וכן שילוב מתאים של נוגדנים לזהות סוגי תאים ספציפיים תוך מזעור מכתים רקע. במידה רבה, זהו תרגיל אמפירי בגלל נוגדנים שפועלים היטב ביישומים אחרים, כולל זרימת cytometry, לא בהכרח יעבוד גם עבור מכתים PCLS. כבר עשינו התקדמות ניכרת בתחום זה, אך החוקרים כי המבקשים ללמוד סוגי תאים לא התייחס כאן ייתכן שיהיה צורך לבדוק נוגדנים שונים לייעל fluorochromes וריכוזי. באמצעות פרוטוקול המתואר כאן, מצאנו כי CD103 + cDCs ו CD11b cDCs היי מתגוררים בבית localizations בולט הריאה. על מצב יציב, CD103 + cDCs התגלו סביב דרכי הנשימה ובאזור subpleural, ואילו cDCs היי CD11b נמצאו בעיקר parenchyma. אף על פי הפרוטוקול מתואר כאן אינו מתאים מכתים מולקולות תאיות, הוא שימושי עבור סמנים פני תא הדמיה, וכן מולקולות הפרשה. לפיכך, הצלחנו לזהות את וכמוקינים, CCL21 ו CCL19, ב PCLS (מידע לא מוצג). אם אותות ניאון חלשים רק נראים באמצעות נוגדנים ראשוניים, אפשר להשתמש נוגדנים משני להגביר אותות אלה.
אחד אתגרים גדולים בעת ביצוע הדמיה-וידאו תא חי של PCLS היה לעגן את הרקמה מספיק במדיום התרבות למנוע xy- משמעותי z-נדידה בתקופת מיקרוסקופיה 4-h. כדי להתמודד עם זה, אנחנו ניסוייםעם יחס שונה של המדיום של ליבוביץ מטריקס, המהווה מוצק בטמפרטורת החדר, וקבעה 1: יחס 1 שמר על מבנה יציב, 3D עם כדאיות התא. במהלך עיבוד פוסט-תמונה, ואנחנו גם נצלנו סדרה של תוספות ImageJ, שנקראה TurboReg ו StackReg כי לחסל כל XY המקרי נוספת או z-משמרת (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx? id = 18,226). שימוש בכלי המיקוד האוטומטי של מיקרוסקופ confocal, באזור של עניין הוחזק בפוקוס, במיוחד לטווח z, בתקופת סריקה כולו. אתגר נוסף במהלך ההדמיה תא חי של PCLS היה ניצול הסריקה אריח, Z- מחסנית, סדרות עתיות, ופונקציות פוקוס אוטומטי של המיקרוסקופ. כדי לצמצם את הזמן בין כל מסגרת, יש לאזן בין משך הזמן סריקת כל אריח. כדי לייעל את זמן הסריקה בכל פרויקט מחקר, מספר Z- מחסנית, אריחים, ומהירויות סריקה צריכות להיות מותאם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין מחברי ניגוד העניינים להכריז.
Acknowledgments
אנו מודים ג'ף טאקר, אריקה Scappini, ואגנס Janoshazi עזרתם עם מיקרוסקופיה, Ligon Perrow לניהול לה המושבה העכבר, ו- Jun חן ומיכאל סנדרסון לעזרה עם מבצעה רקמה, ומייקל Fessler ודרק קין על קריאה ביקורתית של את כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי הסניף העירוני של NIEHS, NIH (זיא ES102025-09), אשר בתורו בחסות מח' בריאות ושירותי אנוש.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
