Summary
Vi beskriver en fremgangsmåte for å generere Precision snitt Lung Skiver (PCLS) og farging dem for å visualisere lokaliseringen av forskjellige immuncelletyper i lungen. Vår Protokollen kan utvides for å visualisere plasseringen og funksjonen av mange forskjellige celletyper under en rekke forskjellige forhold.
Abstract
Innånding av allergener og patogener fremkaller flere forandringer i en rekke av immuncelletyper i lungen. Strømningscytometri er en kraftfull teknikk for kvantitativ analyse av celleoverflateproteiner på immunceller, men det gir ingen informasjon om lokalisering og vandringsmønstrene av disse celler i lungene. På samme måte kan kjemotaksis analysen utføres for å studere mulighetene for cellene til å svare på kjemotaktiske faktorer in vitro, men disse analysene ikke reprodusere det komplekse miljø av det intakte lunge. I motsetning til disse nevnte metoder, kan plasseringen av de enkelte celletyper i lungene blir lett visualisert ved å generere Precision snitt Lung Skiver (PCLS), farging dem med kommersielt tilgjengelige, fluorescensmerket antistoff, og visualisering av seksjonene ved hjelp av konfokal mikroskopi. PCLS kan brukes for både direkte og fast lungevev, og skivene kan omfatte områder som stort som et tverrsnitt av en hel lobe. Vi har brukt denne protokollen for å kunne visualisere plasseringen av et stort utvalg av celletyper i lungen, inkludert forskjellige typer dendrittiske celler, makrofager, neutrofiler, T-celler og B-celler, så vel som strukturelle celler slik som lymfe, endotel, og epitelceller. Evnen til å visualisere cellulære interaksjoner, for eksempel de som er mellom dendrittiske celler og T-celler i levende, tredimensjonal lungevev kan avsløre hvordan celler bevege seg i lunge og kommuniserer med hverandre ved likevekt og ved betennelse. Således, når det brukes i kombinasjon med andre fremgangsmåter, slik som strømningscytometri og kvantitativ PCR, kan PCLS bidra til en omfattende forståelse av cellulære hendelser som ligger til grunn allergiske og inflammatoriske sykdommer i lungen.
Introduction
Etter inhalering av pro-inflammatoriske stimuli så som lipopolysakkarid (LPS), er det en koordinert bevegelse av immunceller inn i, innenfor og fra lungen. For eksempel er nøytrofile hurtig rekruttert til lunge parenchyma og luftveier. I tillegg er noen profesjonell antigenpresenterende celler som er kjent som konvensjonell dendrittiske celler (CDCS) gjennomgå en forholdsvis komplisert migrasjonsmønster 1, 2. CDCS kan identifiseres ved hjelp av flow cytometri, delvis basert på deres visning av de overflatemarkør, CD11c. Distinkte undergrupper av DC kan skilles ved differensial overflateekspresjon av CD103 og CD11b 3. Ved å anskaffe inhalert antigen, noen CDCS avslutte lunge og migrere gjennom lymfekarene til lunge-drenerende lymfeknuter (LNS) hvor de presenterer peptider til antigen-spesifikke T-celler 4. Dette er en kritisk tidlig begivenhet i initiering av adaptive immun responses. Av ukjente grunner, men ikke alle kabelfordelingsskap som skaffer inhalerte antigener forlater lunge, og mange av disse cellene forblir i det organ i flere måneder 5, 6. Denne observasjonen kan delvis forklares ved den utviklingsmessige opphav til disse cellene, fordi monocytt-avledede CD11c + celler som mangler kjemokinreseptoren, CCR7, er ute av stand til å migrere til regionale LNS 7, 8. Det synes sannsynlig at migreringen potensialet i kabelfordelingsskap bestemmes også, i det minste delvis, ved sin anatomisk stilling i lungene. Imidlertid er den nøyaktige lokalisering av disse forskjellige populasjoner av kabelfordelingsskap i lungen ikke fullstendig karakterisert. En forbedret kunnskap om immunceller lokalisering i lungen, og av de molekyler som styrer det, er nødvendig for en bedre forståelse av hvordan immunsystemet til lungen blir aktivert.
PCLS blir stadigly brukt som en ex vivo-metode for å visualisere mobilposisjonerings og celle-celleinteraksjoner, og samtidig opprettholde den strukturelle integriteten til lungen arkitekturen 9, 10. PCLS har blitt brukt til å studere lungene av mange arter, inkludert mus, storfe, aper, sauer, hester og mennesker 11. En stor fordel med denne teknikken er at omtrent 20 skiver kan fremstilles fra en enkelt lapp av en mus lunge, og dermed redusere antall dyr er nødvendig for individuelle eksperimenter. Praktisk talt alle immune celletyper, inkludert DCS, makrofager, nøytrofiler og T-celler, er til stede i PCLS og opprettholde sin normale strukturer.
PCLS kan også brukes til å studere kalsiumsignalisering og kontraktilitet av luftveis og glatte muskelceller etter behandling med acetylcholin 12 eller metakolin 13. Ved denne metode bare en liten del av lungen er enalyzed mikroskopisk, men en undersøkelse rapporterte at måling av luftveistrekningen i PCLS variere bare omtrent 10% fra skive til skive, og denne variasjonen er sammenlignbart med det som ses ved hjelp av lungefunksjonstester i intakte dyr 14. Andre forskere har brukt PCLS som en ex vivo-metode for å studere forandringer i cytokinekspresjon og celleoverflatemarkører etter inkubasjon med LPS 15. PCLS har også vært anvendt i en ex vivo-modell av hypoksisk pulmonær vasokonstriksjon i små intra-acinar arterier. Disse fartøyene er plassert i den del av lungen som ikke kan nås ved hjelp av andre fremgangsmåter, inkludert opptak fra dissekerte arterielle segmenter eller analyse av subpleural fartøy 16. Vårt laboratorium har først og fremst brukes til å visualisere PCLS immunceller lokalisering i levende lungevev ved stabil tilstand, og etter en in vivo-inflammatorisk stimulus. Prosedyrene vi har utviklet for dette er som følger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal eksperimentelle prosedyrer som er beskrevet i denne artikkelen ble godkjent av NIEHS Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. Fremstilling Lung
- Hus mus mellom 6 og 12 ukers alder i patogenfrie forhold i henhold til retningslinjer gitt av Institutional Animal Care og bruk komiteer.
MERK: avbildes mus kan være enten naive eller behandlet, avhengig av hver forskerens interesser. Her beskriver vi immune celle lokalisering i naive mus og hos mus behandlet med 100 ug ovalbumin (OVA) og 0,1 ug lipopolysakkarid (LPS), ved bruk av fosfatbufret saltvann (PBS) som et kjøretøy i et totalvolum på 50 ul. For å oropharyngeally innpode OVA / LPS inn i luftveiene, ble dyrene bedøvet med isofluran innånding og suspendert vertikalt med sine tenner med en gummistrikk. Tungen ble forsiktig grep med pinsett og holdt til en side for å hindre å svelge, og 50 & #181; L til OVA / LPS-løsning avsettes på baksiden av munnhulen som tidligere beskrevet 17. - Avlive mus med intraperitoneal injeksjon av natriumpentobarbital (100 mg / kg), og feste dyret til en polystyren base.
- Åpne bukhulen med saks ved å skjære huden og peritoneum fra midten av buken opp til kjeven. Trekk tarmen til side med pinsett eller kjedelig kanten av saksen, og snip inferior vena cava for å tappe blod fra lungene. Punktere membranen med den skarpe spissen av saksen for å tillate utvidelse av brystkassen, er forsiktig med ikke å skjære lungene.
- Klare spyttkjertler og annet vev bort fra luftrøret ved å gripe tak i vevet, og manuelt trekke det bort fra den underliggende luftrøret med pinsett. Lag et lite snitt i luftrøret på den fremre side av tykkeste band av brusk bruke fin pinsett eller saks, være forsiktig med å skjære hele veien selv om traChea. Snittet vil være akkurat stor nok til å tillate en 20 G nål for å passere gjennom.
- Skyv en 1,5 tommers, 20 G nål på en seksjon av et polyetylenrør, og etterlater ca. 1 cm av slangen forbi enden av nålen. Skjær ut røret ved en vinkel på omlag 45 ° for å avfase ende, feste kanylen til en 1 ml sprøyte, og laste inn i sprøyten ved å trekke 0,8 ml varm (40 ° C) 2% lavt smeltepunkt agarose opp gjennom nålen.
- Plassere enden av røret inn i snittet av luftrøret og injiser langsomt agarose ned i lungene. Uten å bevege nålen eller sprøyte, tape sprøyten til polystyren underlaget for å sikre at nålen forblir i luftrøret.
MERK: Etter injeksjonen vil lungene bli større og større i brystet. De riktige lobes utvide først, deretter venstre lapp. Hvis bare én flik ekspanderer det vist at nålen er satt inn for dypt (forbi bronkiene), og det vil være nødvendig for å trekke det ut litt før man går videre. Denne delen avProsedyren må gjøres relativt raskt, før agarose begynner å stivne. - Plasser mus, med basen og sprøyten fremdeles er satt inn i luftrøret, i et kjølerom eller kjøleskap i minst 10 min. Om nødvendig, kan dyret bli holdt der i opptil flere timer, selv om du fortsetter å avbilde cellemigrasjon av video mikroskopi.
- Når mus er kald, nøye skjære agarose-oppblåste lunger ved hjelp av en saks, og plassere dem i en 3 cm skål med iskald PBS. Hold på is.
- Velge den ønskede lobe for kutting vev (for eksempel, til høyre overlegen lapp). Sørg for at den indre delen av lungen (der den kobles til luftrøret) vender ned i fatet.
MERK: lapp blir brukt og dens orientering på stempelet vil bestemme størrelsen av skip og luftveier som vil være synlig. Den orientering som er beskrevet her er ideell for visualisering av store luftveiene, og parenchyma. Mus har en stor venstre lapp og fire mindre lapper til høyre. TilPCLS avbildning etter innføring av allergener i lungene via munnhule og svelg eller intranasal aspirasjon, vil den høyre overlegen lapp typisk i snitt, delvis fordi det er en praktisk størrelse, men også fordi inhalerte midler dispergeres jevnt i den. Imidlertid kan andre fliker, spesielt den venstre lapp, kan også bli studert. Når man sammenligner musestammer eller behandlinger, er det viktig å sammenligne samme lapp.
2. Lung Slicing
MERK: Lag stykker ved hjelp av en automatisert høvelen, metall kjøleblokken, plunger og metall sprøyte, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sette en liten dråpe av alle formål, ikke-run gel superlim på stempelet og spres limet i en sirkulær bevegelse, tar seg å ikke la limet berører sidene av metall sprøyten. Hvis limet berører sidene av sprøyten, vil det lim sprøyten og plungeren sammen.
- Umiddelbart etter dekker stempelet med lim, forsiktig gripeskåret ut lapp med pinsett med luftrøret siden ned, DAB den på et papir for å fjerne overskudd av væske, og forsiktig plassere den på toppen av stempelet. Skjær av eventuelle ekstra vev som strekker seg ut over kanten av stempelet.
- Flytt stempelet ned, slik at de sider av metallsprøyte bevege seg opp og over vev, som skaper en brønn med lungen limt på bunnen, ikke mer enn noen centimeter dyp. Tape rundt bunnen av metall sprøyte for å holde denne posisjonen på plass.
- Hell forsiktig 2% lavt smeltepunkt agarose ved 40 ° C inn i brønnen slik at det bare dekker toppen av fremspringet.
- Omgi metallet sprøyten med iskald kjøling blokk og avkjøle lobe og agarose i 1 - 2 minutter.
MERK: En kortere tid avkjøling av agarose omgivende vev kan føre til nedbryting av agarose under avskjæringen, noe som kan resultere i et ujevnt skåret PCLS. - Installering av prøven i sprøyten inn i automatiserte høvelen og fylle buffertanken med iskald PBS. Juster trinn motordrift med prøven sprøyten og fjerne den del av båndet fra bunnen. Vri bryteren til spole fremover (FF) stilling til trinnmotordrift bare berører baksiden av stempelet.
- Juster nytt blad med prøven sprøyte. Set vev tykkelse, kontinuerlig / enkelt stykke, oscillasjon og hastighet i skjæreren. For eksempel, vev tykkelse: 150 pm, kontinuerlig skjæring (forts.), Oscillation: 9, og hastighet: 3 - 4. Trykk start. Innstillingene ovenfor må justeres til de spesifikke automatiserte slicer spesifikasjoner.
- Ved hjelp av en tynn spatel eller pensel, samle PCLS en om gangen etter hvert som de faller ned i buffertanken, og plassere dem i en 24-brønners plate inneholdende iskald PBS.
MERK: Det er viktig å holde skiver for å opprettholde konsistens mellom eksperimenter. Selv om hver lunge er forskjellig avhengig av alder, kjønn og vekt, 10 th skive, for eksempel, generelt gir samme størrelse luftveiene.
- Utforme et panel av fluorescensmerket antistoff basert på den celletype av interesse, tar hensyn til potensiell fluorescerende spektral overlapping og deteksjons egenskapene til mikroskopet.
MERK: Som et eksempel, er et panel for DC undergruppe deteksjon som følger: CD11c / alfa-X grin - BrilliantViolet (BV) 605 (Eksitasjon: 405 nm, Peak emisjon: 605 nm), CD324 / E-cadherin - Alexa 488 (AF488 ) (Eksitasjon: 488 nm, Peak emisjon: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - Phycoerythrin (PE) (Eksitasjon: 561 nm, Peak emisjon: 578 nm), CD103 / alfa-E grin - allofykocyanin (APC) (Eksitasjon: 633 nm , Peak emisjon: 660 nm). Fluorescens spektrale viewer verktøy (se Materialer List) er nyttige å designe paneler. - Lage et antistoff cocktail inneholdende de ønskede antistoffer.
- For statisk PCLS avbildning, tilsett 800 ul farging buffer, 100 ul Fc blocker, 50 ul normalt museserum, og 50 ul normalt rotteserum til et 1,5 mL microcentrifuetter mistanke rør for et totalt volum på 1 ml. For levende celle avbildning bruke 800 ul Leibovitz medium (1x) inneholdende 10% FBS (Leibovitz-10) i stedet for farging buffer.
- Legg antistoffer for å justere en ønsket sluttkonsentrasjon på hvert antistoff. Overfør den antistoffløsning til en 3 cm skål, og holde i mørket inntil de er klare til bruk.
MERK: Sluttkonsentrasjonene må være optimalisert for hvert enkelt antistoff (vanligvis 1 - 5 ug / ml).
- Velge en PCLS med et anatomisk område av interesse, for eksempel store luftveiene eller periferi av lungen, og plasser i 3-cm skål inneholdende 1 ml antistoffoppløsning.
- Flekk PCLS i mørke, på is, gynge langsomt i 30 eller 60 min.
- For statisk PCLS bildebehandling, fortsett til punkt 4. For levende celle bildebehandling, fortsett til punkt 5.
4. Statisk Imaging of PCLS
- Etter 60 min inkubasjon av PCLS med antistoffer, fjerne antistoffløsningen fra fatet og skyll than skiver to ganger med 1 ml iskald PBS.
- Pipetter 50 mL PBS på en 3 cm rund glass-bunnskål. Ved hjelp av en slikkepott eller pensel, overføre de fargede PCLS til drop, forsiktig manipulere stykket før det er flatt og spre seg. Fjern PBS med en pipette. Stykket skal ligge så flat som mulig. De ovennevnte prosedyrer må utføres raskt for å unngå fotobleking.
- Plassere en dråpe romtemperatur montering medium på skive og forsiktig slippe et glass dekkglass i brønnen av platen. Hold PCLS i mørke ved 4 ° C i opp til en time før avbildning.
- Når du ser under et konfokal mikroskop, bruk en 20X objektiv (se Materialer List). Bruk "tile" verktøyet for å lokalisere og merke kantene av vevet i innstillingen "konvekse skrog". Dette vil bidra til å redusere den tiden av flis skanningen.
- Ved innstilling av z-stabelen rekkevidde, bekrefter på flere områder av stykket, særlig langs kantene, at de innstilte områdeneer aktuelle.
MERK: z-serien vil sannsynligvis trenger å være større enn tykkelsen av vevet seg selv fordi det er svært vanskelig å få vevet til å legge helt flat. For eksempel, med en 150 um tykk PCLS, z-stabelen serien vil sannsynligvis må settes til 200-250 pm for å imøtekomme støt og kurver i stykket. Avhengig av z-stabelen rekkevidde og størrelsen av vevet, vil hver hel lunge-scanning ta mellom 7 - 12 t med et 20X objektiv. Hver lunge er unik, og innstillingene må justeres for hver eksperiment.
5. Levende Cell Imaging av PCLS
- Etter 30 minutters inkubasjon av PCLS med antistoffer, fjerne antistoffløsningen fra fatet og skyll skivene to ganger med 1 ml kald Leibovitz-10.
- Pipetter frisk 50 mL Leibovitz-10 inn i en spalte av en kamret dekkglass (8) spalter. Bruk en slikkepott til å overføre PCLS til mediet, forsiktig manipulere den til stykket er flatt og spre seg. De ovennevnte fremgangsmåtermå utføres raskt for å unngå fotobleking.
- Fjern 50 ul medium ved hjelp av en pipette. Stykket er å ligge så flat som mulig.
MERK: det er akseptabelt dersom kantene av skiven er vippet opp loddrett mot veggen av kammeret. Videre, hvis det finnes, en metall platina vekt kan brukes til å forankre skive før man går videre til neste trinn. Se vedlagte Materialliste for ett eksempel på platinatråd som kan kuttes og bøyes til små vekter. - I et 4 ° C kaldt rom, blande 100 ul vekstfaktor-redusert, fenolrødt-fritt ekstracellulær matrix med 100 pl Leibovitz-10. Bruk forkjølt pipettespisser for dette, eller den ekstracellulære matrise vil stivne i spissen.
MERK: Dette forhold mellom matrisen og medium (1: 1) danner en gel tett nok til å holde PCLS nede i vev-dyrkningsbetingelser. - Forsiktig pipette matrisen å blande, og nøye pipette på toppen av PCLS, og pass på at gelen går på toppen av lung skive, og at skiven ikke flyter opp på toppen av gelen. Gelen bør fungere som en vekt, å forankre PCLS ned på bunnen av platen.
- overføre nøye kamret dekkglasset til en 37 ° C inkubator og la den stivne matriksen i ~ 5 min.
- Overføre hele kammer, med en dekkglass på den forvarmede stadium av et konfokalt mikroskop. Opprettholde kammeret ved 37 ° C gjennom hele billeddannelse. CO 2 forsyning er ikke nødvendig i løpet av celle inkubering ved bruk Leibovitz medium.
- Sett z-stabelen rekkevidde og fliser område basert på det ønskede intervall mellom rammene. Når du ser under et konfokal mikroskop, bruk en 20X objektiv (se Materialer List). Bruk "tile" verktøyet for å betegne området av interesse i vev, ved hjelp av "sentrert grid" omgivelser (for eksempel en 2x2 sentrert gitter).
- Ved innstilling av z-stabelen rekkevidde, bekrefter på flere områder av stykket som de innstilte områdene er hensiktsmessig.
MERK: zrange vil trolig være lik tykkelsen av vevet. Hver lunge er unik, og innstillingene må justeres for hver eksperiment. 2x2 fliser og 10 z-stabler vil generelt resultere i ~ en ramme / 2 min. Sikre den autofokusfunksjon aktiveres før forsøket ble påbegynt for å minimalisere xy og z-drift i løpet av avbildningsperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å identifisere plasseringen av to likestrøms undergrupper, CD11 hi kabelfordelingsskap og CD103 + CDCS, PCLS fra C57BL / 6-mus ble kuttet og farget med monoklonale antistoffer (mAbs) som er spesifikke for CD11c, CD88, CD103, CD324 og (E-cadherin). Antistoffer mot CD324 flekk luftveisepitelceller og CD88 vises på makrofager og nøytrofiler, men ikke CDCS 8. Dette tillot oss å skille kabelfordelingsskap fra CD11c + makrofager, og å observere den romlige forhold for hver celletype til luftveiene (figur 1). Vi har funnet at CD11 hi CDCS lokaliseres i parenchyma, mens CD103 + CDCS ligge hovedsakelig rundt luftveiene og subpleural området. Selv om CD103 + CDCS ble lett påvist ved direkte farging av celleoverflate CD103 i dette eksperiment, påvisning av CD11b hi CDCS avhengig av fravær av CD88 og CD103 farging. Å direkte identifisere CD11bhei CDCS, vi først forsøkt å flekk PCLS hjelp av en anti-CD11b mAb (klon M1 / 70), som er mye brukt i immunhistokjemi og flowcytometri. Men dette mAb hadde en høy bakgrunn og lav spesifisitet i denne søknaden, uavhengig av hvilken fluorokromer ble konjugert til mAb'et (figur 2A, og data ikke vist). I motsetning til dette, antistoffer mot CD172a (SIRP1α) farget CD11b hi CDCS 18, men ikke strukturelle celler eller CD103 + CDCS (figur 2B, og data ikke vist). På egen hånd, kan antistoffer mot CD172a ikke diskriminerer mellom kabelfordelingsskap og monocytter eller makrofager. Imidlertid, ved ko-farging med antistoffer mot CD88 og CD172a, var vi i stand til å skille alveolære makrofager (CD172a - CD88 +) fra mellomliggende makrofager (CD172a + CD88 +), og CD11 hi CDCS (CD172a + CD88 -), og viser at de sistnevnte cellene preferensielt lokaliseres iparenchyma, ikke under epitelareal (figur 2C - F), i overensstemmelse med våre resultater oppnådd ved indirekte farging av disse cellene.
Study of intra-vev migrering av leukocytter krever visualisering av strukturelle celler, inkludert de av lymfekarene, gjennom hvilke DC trafikk fra perifere vev til regionale LNS. I huden og LNS, blir lymfekar ofte identifiseres ved hjelp av mAbs til LYVE-1 eller Podoplanin. Imidlertid har vi funnet at i PCLS, mAbs til LYVE-1 og Podoplanin beis en rekke andre celletyper, inkludert vaskulære endotel og alveolar epitel (data ikke vist). Disse mAb er derfor av begrenset praktisk nytte for spesifikt å identifisere lymfatiske kar i PCLS. Imidlertid mAb mot CD90.2 (Thy1.2), en velkjent T-cellemarkør, merkede lymfatiske strukturer, som vist tidligere i andre vev 19, 20 (figurene 3A, B Prox1 promotoren 21 (figur 3A, C). PROX1 er en master-transkripsjonsfaktor som er nødvendig for lymphangiogenesis 22. Prox1 TdTomato transgene mus som utviser sterkt fluorescerende lymfekarene i lunger og andre vev så som lever, linse, dentate gyrus og nevroendokrine celler i binyremargen 21. Faktisk disse to merkingsmetoder ga overlappende fargemønstre (Figur 3D). Ved hjelp av disse fremgangsmåter for merking, var vi i stand til å fastslå at CD103 + CDCS var tilstede på flere anatomiske områder, blant annet CD324-uttrykk luftveisepitel, lymfekar, og det subpleural området (figur 3A, E).
I tillegg til statisk billeddannelse, cellebevegelse og celle til cell interaksjoner kan spilles inn ved hjelp av levende celle avbildning av PCLS (Film 1). PCLS ble nyfremstilt fra mus som hadde fått injeksjoner av GFP-uttrykkende OT-II-T-celler og instillasjon av OVA og LPS, farget med mAb mot CD103 (rød) og luftveisepitelet (CD324, blå), og ble fotografert for å spore bevegelse av CD103 + kabelfordelingsskap og T-celler 16 timer etter OVA / LPS instillasjon. I løpet av video (4 h), den dynamiske bevegelse av CD103 + DC (rød) og adoptivt overført OVA-spesifikke T-celler (grønn) og deres vekselvirkning er klart synlig (Film 1).
Figur 1. som anatomisk Lokalisering av CDC Delsett som vist ved PCLS Farging og konfokalmikroskopi. A) Hele PCLS fra en ubehandlet C57BL / 6 mus lunge farget med forskjellige antistoffer. Fargen på hvert molekyl er angitt med dens skriftfarge (øverst til høyre). Individ og kombinatoriske farging gir følgende farger for celletyper av interesse: CD103 + CDCS (CD103 + CD11c + CD88; -; hvitt), CD11b hi CDCS (CD11c + CD103 - CD88 -; rød), makrofager (CD11c + CD88 +; gul ), neutrofiler (CD11c - CD88 +, grønn) og luftveis-epitelceller (CD324 +, blå). B - D) Høyere forstørrelse av innfellinger i A. B) CD11 hi CDCS lokaliseres i parenchyma. C) CD103 + CDCS rundt luftveiene. D) CD103 + CDCS under visceral pleura. Hvite striper betegne 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Farging av DC og makrofager. A) Farging av PCLS med antistoffer mot CD11b (blå) gir en høy bakgrunn i PCLS. B) Antistoffer mot CD172a (grønn) har en forholdsvis lav bakgrunn i PCLS og større spesifisitet for CD11 + -celler. C) Antall PCLS av C57BL / 6 mus farget med mAb hvis farge er indikert med skriftfarge (øverst til høyre). CD11c (rød), CD88 (cyan), CD172a (grønn) og CD324 (blå). CD11 hi CDCS (CD11c + CD88 - CD172a +, gul), alveolære makrofager (CD11c + CD88 + CD172a -; rosa), interstitiell makrofager (CD11c + CD88 + CD172a +, hvit), neutrofiler (CD11c - CD88 +, cyan) og luftveiene (CD324 +; blått). D - F) Høyere forstørrelse av innfellingeravbildet i C. D) Sub-pleural område. E) Sub-epitelareal. F) interstitium. Mellomliggende makrofager lokalisere i parenchyma, og alveolære makrofager er i alveolene. Umerkede hvite striper angir 50 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Merking av Strukturelle Celler i PCLS. A) Hele PCLS fremstilt fra Prox1 tdTomato mus, og farget med mAb til CD90.2 (grønn), CD103 (hvit) og CD324 (blå). Prox1-uttrykkende celler (røde) er genetisk merket med TdTomato under regulering av Prox1 promoter (Prox1-TdTomato). B - E) Høyere forstørrelse av det innfelte i
Movie 1. T-celler reagerer med CD103 + CDCS i Lung. Levende celle avbildning av CD103 + CDCS (rød) som samvirker med T-celler (grønn). CD4 + T-celler isolert fra OVA-spesifikke OT-II Nur77 GFP-mus ble stimulert med spleniske DC og OVA in vitro, og adoptivt overført til Rag - / - mus. 2 t senere ble mottakeren mus behandlet viddh OVA / LPS instillasjon i luftveiene. 16 timer etter OVA / LPS-behandling ble gjort PCLS, farget og avbildes i 4 timer ved 37 ° C. Tid opptak av bilde (min) vises. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her ble opprinnelig utviklet for å visualisere plasseringen av to undergrupper av kabelfordelingsskap i lungene. Imidlertid kan denne protokollen lett tilpasses for å studere mange forskjellige celletyper, og samtidig opprettholde cellenes levedyktighet og den tredimensjonale arkitektur av lungen. Sistnevnte trekk er en viktig fordel i forhold til cellekultursystemer, og muliggjør identifikasjon av sjeldne celletyper. Metoden bygger på generering av PCLS fra lungen, og en passende kombinasjon av antistoffer for å identifisere spesifikke celletyper mens bakgrunnsfarging minimaliseres. I stor grad, er dette en empirisk øvelse fordi antistoffer som fungerer godt i andre anvendelser, blant annet flow-cytometri, ikke nødvendigvis fungere godt for farging PCLS. Vi har allerede gjort betydelig fremgang i denne forbindelse, men etterforskere som ønsker å studere celletyper ikke er adressert her kanskje teste forskjellige antistoffer og optimalisere fluorokromer og konsentrasjoner. Ved anvendelse av protokollen som er beskrevet her, har vi funnet at CD103 + kabelfordelingsskap og CD11 hi CDCS befinne seg på ulike lokasjoner i lungen. Ved stabil tilstand, ble CD103 + CDCS påvises omkring luftveiene og i subpleural region, mens CD11 hi CDCS ble hovedsakelig funnet i parenkym. Selv om den protokoll beskrives her er ikke egnet for farging intracellulære molekyler, er det nyttig for avbildning celleoverflatemarkører, så vel som sekretoriske molekyler. Således, var vi i stand til å detektere kjemokiner, CCL21 og CCL19, i PCLS (data ikke vist). Hvis bare svake fluorescente signalene blir sett ved hjelp av primære antistoffer, er det mulig å anvende sekundære antistoffer for å forsterke disse signalene.
En stor utfordring ved utføring av levende celle video-avbildning av PCLS var tilstrekkelig til å forankre vev i kulturmediet for å forebygge vesentlig XY og Z-drift i løpet av den 4-timers periode mikroskopi. For å løse dette, vi eksperimentmed forskjellige forhold mellom Leibovitz medium til ekstracellulær matriks, som er fast ved romtemperatur, og fast et 1: 1 forhold opprettholdes en stabil, 3D-struktur med cellenes levedyktighet. I løpet av post-bildebehandling, vi også benyttet en rekke ImageJ plug-ins, kalt TurboReg og StackReg at eliminere eventuelle ytterligere tilfeldig xy eller z-skift (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx? id = 18226). Ved hjelp av autofokus verktøy av det konfokale mikroskop, ble området av interesse holdes i fokus, særlig i z-rekkevidde, under hele avsøkningsperioden. En annen utfordring i levende celle avbildning av PCLS ble anvendelse av flisen skanningen, z-stabel, tidsserier, og autofokus funksjoner av mikroskopet. For å minimere tiden mellom hvert bilde, må en balanse bli truffet mellom tid brukt skanner hver flis. For å optimalisere skannetiden i hvert forskningsprosjekt, z-stack nummer, fliser, og skannehastigheter må justeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å erklære.
Acknowledgments
Vi takker Jeff Tucker, Erica Scappini, og Agnes Janoshazi for deres hjelp med mikroskopi, Ligon Perrow for hennes ledelse av musen kolonien, og Jun Chen og Michael Sanderson for å få hjelp med vevet slicer, og Michael Fessler og Derek Cain for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av egenutført gren av NIEHS, NIH (Zia ES102025-09), som igjen er sponset av Institutt for helse-og omsorgsminister.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
