Summary
Bu hassas kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve akciğerde çeşitli immün hücre tipleri lokalizasyonunu görselleştirmek için bunları immünolojik boyama için bir yöntem tarif eder. Bizim protokol, çeşitli koşullar altında konum ve birçok farklı hücre tiplerinin fonksiyonunu görselleştirmek için uzatılabilir.
Abstract
alerjenler ve patojenlerin solunması akciğer immün hücre tiplerinde çeşitli birden çok değişiklik ortaya çıkarmaktadır. Akış sitometrisi bağışıklık hücreleri üzerinde hücre yüzey proteinlerinin kantitatif analizi için güçlü bir tekniktir, ancak bu akciğer içinde, bu hücrelerin lokalizasyonunda ve göç desen hakkında bilgi vermez. Benzer şekilde, kemotaksi deneyleri, in vitro olarak kemotaktik faktörlere yanıt hücrelerinin değişim potansiyelini araştırmak için yapılabilir, ancak bu deneyler, sağlam akciğer kompleks ortam yeniden yoktur. Bu yukarıda sözü edilen tekniklerin aksine, akciğer içinde tek tek hücre tiplerinde konumu hali hazırda ticari olarak temin edilebilir, flüoresan etiketli antikorlar ile boyanması, hassas-kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve konfokal mikroskopi ile bölümleri görselleştirme ile görselleştirilebilir. PCLS canlı her ikisi için kullanılan ve akciğer dokusunun sabit ve dilimler bütün bir lob kesiti kadar büyük alanları kapsayabilir edilebilir. Başarıyla dendritik hücrelerin farklı tipleri, makrofajlar, nötrofiller, T hücreleri ve B hücreleri gibi, örneğin lenfatik endotelyal gibi yapısal hücreleri dahil olmak üzere akciğerde hücre tipleri, çeşitli konumunu görselleştirmek için bu protokolü kullanılır, ve adres epitel hücreleri. Hücreler akciğer içinde hareket etmesi ve kararlı bir halde ve enflamasyon sırasında birbirleri ile nasıl etkileşime, canlı, üç boyutlu akciğer dokusunda dendritik hücreleri ve T hücreleri arasındaki gibi hücresel etkileşimler, görselleştirmek için yeteneği, ortaya çıkarabilir. gibi akış sitometrisi ve kantitatif PCR gibi başka prosedürler ile bir arada kullanıldığında Böylece, PCLS akciğerin allerjik ve enflamatuar hastalıkların altında yatan hücresel etkinlikleri kapsamlı bir anlayış katkıda bulunabilir.
Introduction
Bu tür lipopolisakarit (LPS) gibi pro-enflamatuar uyarılara solunması sonra, orada içinde, bağışık hücrelerin koordineli hareketi ve akciğer. Örneğin, nötrofiller hızla akciğer parankimi ve hava yoluna alınsın. Buna ek olarak, geleneksel bir dendritik hücreler (CDCS) olarak bilinen bir profesyonel antijen sunan hücreler, nispeten karmaşık göç desen, 1, 2 geçer. CDCS yüzey işaretleyici, kendi ekranında CD11c kısmen, akış sitometrisi kullanılarak tespit dayalı olabilir. DClerin Farklı alt-kümeleri CD103 ve CD11b 3 ayırıcı yüzey ifadesi ile ayırt edilebilir. Nefes yoluyla antijene aldıktan sonra, bir CDCS akciğer çıkmak ve antijen-spesifik T hücrelerinin 4 peptidleri sunan akciğer lenf düğümleri (LN) lenf damarları içinden yer değiştirmektedir. Bu adaptif bağışıklık r başlatılmasında kritik bir erken olaydıresponses. Bilinmeyen nedenlerden dolayı, ancak, inhale antijenleri elde tüm CDCS akciğere bırakmaz ve bu hücrelerin çoğunun, birkaç ay 5 için bu organda 6 kalır. Monosit türevli CD11c + kemokin reseptörü, CCR7 yoksun hücreler, bölgesel LN 7, 8 göç etmek mümkün olduğu için bu gözlem, bu hücrelerin gelişim kökenli ile açıklanabilir. CDCS göç potansiyeli de akciğer içindeki anatomik pozisyona göre, en azından kısmen, tespit edilir gibi görünmektedir. Bununla birlikte, akciğerdeki CDCS bu farklı popülasyonlarda kesin yeri tam olarak karakterize edilmemiştir. Akciğer içinde ve yöneltmek moleküllerin bağışıklık hücre lokalizasyonu iyileştirilmiş bir bilgi, akciğerin bağışıklık sistemi aktive olur nasıl daha iyi anlamak için gereklidir.
PCLS olmak artıyorakciğer yapısının 9, 10 yapısal bütünlüğünü korurken, ly, hücresel konum ve hücre-hücre etkileşimleri görselleştirmek için bir eks vivo yaklaşımı olarak da kullanılır. PCLS fareler, sığır, maymun, koyun, at, ve insanlar 11 dahil olmak üzere birçok türün, akciğerlerini incelemek için kullanılmıştır. Bu tekniğin önemli bir avantajı, yaklaşık 20 dilim böylece ayrı ayrı deneyler için gerekli hayvan sayısını azaltmak, bir fare akciğer Tek bir lobdan elde hazırlanabilir olmasıdır. DCler, makrofajlar, nötrofiller ve T hücreleri dahil olmak üzere hemen hemen tüm immün hücre tipleri, PCLS içinde mevcut olan ve normal yapısını korur.
PCLS de asetilkolin 12 veya metakolin 13 ile tedaviden sonra, kalsiyum sinyal ve solunum yolu düz kas hücrelerinin kasılma incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşımda, akciğer sadece küçük bir kısmı, birmikroskobik alyzed ancak bir çalışma PCLS hava yolu daralması ölçümleri dilim dilim sadece yaklaşık% 10 farklılık gösterir ve bu varyans intakt hayvanlarda 14 akciğer fonksiyon testleri kullanılarak görülenle kıyaslanabilir olduğunu bildirdi. Diğer araştırmacılar, LPS 15 ile inkübe edildikten sonra, sitokin ekspresyon ve hücre yüzey markörlerinin değişiklikleri incelemek için bir eks vivo yaklaşımı olarak PCLS kullandık. PCLS aynı zamanda küçük içi asinar arterlerde pulmoner hipoksik vazokonstriksiyon bir ex vivo modelinde kullanılmıştır. Bu damarlar kesilmiş arter segmentler veya kalmanın damar 16 analizinden kayıtları gibi diğer prosedürler, ulaşılamıyor akciğer kısmında yer almaktadır. Bizim laboratuvar öncelikle bir in vivo ateşli güdünün ardından bağışıklık hücresi kalıcı halde canlı akciğer dokusunda lokalize edilmesini ve görselleştirmek için PCLS kullanmıştır. aşağıdaki gibi biz bunun için geliştirdik yöntemlerdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu yazıda anlatılan Hayvan deneysel prosedürler NIEHS Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Akciğer hazırlanması
- Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri tarafından sağlanan yönergelere uygun olarak spesifik patojen free koşullarda yaş 6 ve 12 hafta arasında Ev fareleri.
NOT: görüntülenmistir fareler her araştırmacının ilgi alanlarına bağlı olarak naif veya tedavi olabilir. Burada, 50 uL bir toplam hacimde bir taşıyıcı olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) kullanılarak, naif farelerde ve 100 ug ovalbumin (OVA) ve 0.1 ug lipopolisakkarit (LPS) ile tedavi edilen farelerde bağışıklık hücresi lokalizasyonunu tarif etmektedir. oropharyngeally solunum yolları içine OVA / LPS aşılamak için, hayvanlar izofluran teneffüs ile anestezi uygulandı ve dikey olarak bir lastik bant ile dişleri ile süspansiyon haline getirildi. dil forseps ile yavaşça tutulur ve yutma önlemek için bir tarafa yapılan ve 50 # edildi181; ağız boşluğu arka biriken OVA / LPS çözeltisi L önceden 17 tarif. - sodyum pentobarbital (100 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile fare euthanize ve polistiren tabanına hayvan pin.
- çeneye karın kadar ortasından deri ve periton keserek makas ile karın boşluğuna açın. forseps veya makas donuk kenarı ile bir kenara bağırsak çekin ve akciğer uzak kan akıtmak için inferior vena cava makasla kesme. akciğerler kesmek için dikkatli olmak göğüs kafesinin genişlemesine izin vermek üzere makas sivri ucu ile diyafram ile delikler.
- Şeffaf tükürük bezleri ve forseps ile altta yatan trakea uzak çekerek manuel dokuyu kapma ve uzakta trakeadan diğer doku. tra olsa tüm yol kesmek için dikkatli olmak, ince forseps veya makas kullanılarak kıkırdak en kalın bandın ön tarafında Nefes borusunda küçük bir kesi olunChea. kesik, bir 20 G iğne ile geçmesine imkan vermek için yeterince büyük olmalıdır.
- iğnenin ucundan ileriye boru, yaklaşık 1 cm bırakarak, polietilen boru donanımının bir bölümü üzerine bir 1.5 inç, 20 G iğne kaydırın. agaroz kadar iğne içinden sıcak 0.8 mL (40 ° C),% 2 düşük bir erime noktasına çizerek şırınga, son konik bir 1 ml şırınga iğne takılır ve yük için yaklaşık 45 ° 'lik bir açı ile hortumu kesilir.
- Trakea kesi içine boru ucunu yerleştirin ve yavaş yavaş akciğerlere agaroz enjekte edilir. iğne ya da şırınga hareket olmadan, iğne trakeanın kalmasını sağlamak için polistiren tabanına şırınga bantlayın.
NOT: Enjeksiyondan sonra, akciğerler göğüs içinde büyük ve şişirilmiş olacaktır. Doğru lob, ilk önce sol lobu genişletin. Sadece bir lob genişletir, iğne (bronş geçen) çok derin olarak yerleştirilen edilmiş ve devam etmeden önce hafifçe çekmek için gerekli olacaktır. bu bölümüProsedür agaroz katılaşmaya başlamadan önce, nispeten hızlı bir şekilde yapılması gerekir. - En az 10 dakika süreyle bir baz ve bir soğuk odada yine hava borusu içinde yerleştirilmiş bir şırınga ya da buzdolabı, fare yerleştirin. Gerekirse, hayvan birkaç saate kadar, hatta video mikroskobu ile görüntü hücre göçü geçmeden eğer orada tutulabilir.
- Fare soğuk sonra, dikkatli bir şekilde makas kullanılarak agaroz şişirilmiş akciğerler eksize ve buz gibi soğuk PBS ile 3 cm uzunluğunda bir tabağına yerleştirin. buz üzerinde tutun.
- Doku dilimleme için istenen lobu (örneğin sağ superior lob) seçin. Emin (o trakea bağlanır) akciğerin iç kısmı tabak yüz aşağı olduğundan emin olun.
Not: lob kullanılmıştır ve pistonu oryantasyon görünür olacak damar ve solunum yollarının boyutunu belirleyecektir. Burada anlatılan oryantasyon büyük hava yollarının görselleştirme ve parankimindeki için idealdir. Fareler bir büyük sol lobu ve sağda dört küçük dilimleri vardır. İçinuygun bir boyut olduğu için değil, aynı zamanda inhalasyon ajanları içindeki eşit dağılması nedeniyle orofaringeal veya intranazal aspirasyon yoluyla akciğerlere alerjenlere açıklanması sonrasında PCLS görüntüleme, sağ superior lob genellikle kısmen kesitli edilir. Ancak, diğer lob, özellikle sol lob da incelenebilir. Fare suşları veya tedaviler karşılaştırırken, aynı lobu karşılaştırmak önemlidir.
2. Akciğer Dilimleme
NOT: üreticinin talimatlarına göre metal blok, pistonu ve metal şırınga soğutma, otomatik dilimleme makinesi kullanılarak dilimleri olun.
- Pistonun üzerine çok amaçlı küçük bir damla, hiçbir işletilen jel superglue koyun ve tutkal metal şırınga kenarlarına dokunmasına izin için özen, dairesel bir hareketle tutkal yayıldı. tutkal, şırınganın tarafı ile temas ettiği şırınga tutkal ve dalma pistonunu olacaktır.
- Hemen yapıştırıcı ile piston kapsayan sonra, yavaşça kavramakAşağı trakea tarafı forseps ile eksize lob, fazla sıvının çıkması, ve dikkatli bir şekilde pistonun üzerine yerleştirmek için bir doku üzerine hafifçe sürün. Pistonun kenarının ötesine uzanan herhangi bir ilave dokusu kesin.
- Metal şırınganın kenarları yukarı ve doku üzerinde, böylece oluşturma aşağı pistonu hareket iyi derin birkaç santimetre daha fazla, alt yapıştırılmış akciğer. Metal şırınga altındaki etrafında Teyp etapta bu konumda tutun.
- sadece lobun üst kaplayacak şekilde dikkatli bir şekilde de içine, 40 ° C'de,% 2 az eriyen agaroz dökün.
- buz soğukluğunda soğutma bloğu metal şırınga Surround ve 1 lob ve agaroz serin - 2 dakika.
Not: çevreleyen dokudan agaroz daha kısa bir zaman soğutma bir düzensiz kesme PCLS neden olabilir, dilimleme sırasında agaroz parçalanmasına neden olabilir. - Otomatik dilimleyicinin içine numune şırınga yükleyin ve buz PBS ile tampon tankı doldurun. hizalama Numune şırınga ile motorlu sürücü adım ve alttan bant parçasını çıkarın. step motor sürücü sadece pistonun arkasına dokunana kadar hızlı ileri (FF) konumuna getiriniz.
- Numune şırınga ile taze bıçak hizalayın. dilimleyici Set doku kalınlığı, sürekli / tek bir dilim, salınım ve hızı. Örneğin doku kalınlığı: 150 um, sürekli kesme (devam). salınım: 9, ve hızı: 3 - 4. başlar. Yukarıdaki ayarları belirli otomatikleştirilmiş dilimleyici özelliklerine ayarlanması gerekebilir.
- bunlar tampon tankına dökülmesini ve buz soğuk PBS içeren bir 24-çukurlu plaka içinde koyun gibi ince bir spatula ya da fırça kullanılarak, her seferinde PCLS bir toplar.
NOT: deneyler arasında tutarlılığı sağlamak amacıyla dilimleri tutmak önemlidir. Her akciğer, yaş, cinsiyet ve ağırlığına bağlı olarak farklı olmasına rağmen, 10. dilim, örneğin, genel olarak benzer solunum aygıtı elde edilir.
- ki potansiyel floresan spektral üste binme ve bir mikroskop tespit alma yetenekleri, ilgi konusu hücre türüne göre fluoresan ışığı ile işaretlenmiş antikor paneli tasarlama.
NOT: Bir örnek olarak, DC alt seti tespiti için bir panel: CD11c / alfa X integrin - BrilliantViolet (BV), 605 (Uyarım: 405 nm, tepe emisyon: 605 nm), CD324 / E-kadherin - Alexa 488 (AF488 ) (Uyarım 488 nm, tepe emisyon: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - Fikoeritrin (PE) (Uyarım 561 nm, tepe emisyon: 578 nm), CD103 / alfa e integrin - Allofikosiyanin (APC), (Uyarım: 633 nm Peak emisyon: 660 nm). Floresans spektral görüntüleyici araçları (Malzeme listesi) panelleri tasarlamak üzere kullanılır. - istenen antikorları ihtiva eden bir antikor kokteyli olun.
- Statik PCLS görüntüleme için, 1.5 ml microcentrifu 800 uL boyama tamponu, 100 uL Fc blocker, 50 uL normal fare serumu ve 50 ul normal sıçan serumu eklemek1 mL toplam hacim için yükümlülüğüne tüpü. canlı hücre görüntüleme, yerine boyama tamponu% 10 FBS (Leibovitz-10) ihtiva eden 800 uL Leibovitz ortamı (1 kez) kullanın.
- Her bir antikorun bir istenen son konsantrasyonunu ayarlamak için antikor ekleyin. 3 cm'lik çanak antikor çözüm aktarın ve kullanıma hazır oluncaya kadar karanlıkta tutun.
Not: (- 5 ug / mL, genellikle 1) son konsantrasyonları gerekir her bir antikor için optimize edilmesi.
- Bu tür büyük solunum yolları veya akciğer periferinde gibi ilgi, bir anatomik bölgenin bir PCLS seçin ve 1 ml antikor çözeltisi ihtiva eden 3 cm tabak içinde yer.
- 30 ya da 60 dakika boyunca yavaş yavaş sallanan buz üzerinde karanlıkta leke PCLS,.
- Statik PCLS görüntüleme için, canlı hücre görüntüleme için bölüm 4. geçin bölüm 5 geçin.
PCLS 4. Statik Görüntüleme
- antikorlarla PCLS 60 dakika inkübasyondan sonra, t çanak antikor çözüm kaldırmak ve durulamao 1 mL buz gibi soğuk PBS ile iki kez dilimler.
- 3 cm yuvarlak cam alt tabak üzerine pipetle 50 uL PBS ile yıkandı. Bir spatula ya da fırça kullanılarak, düz kadar yavaşça dilim manipüle damla lekeli PCLS transferi ve yayılmış. Bir pipet ile PBS çıkarın. dilim mümkün olduğu kadar düz olmalıdır. Yukarıdaki prosedürler photobleaching önlemek için hızla yapılması gerekir.
- dilime oda sıcaklığı montaj orta 1 damla yerleştirilir ve hafifçe plakasının her bir oyuğuna, cam bir lamel bırakın. Görüntüleme önce bir saat kadar 4 ° C'de karanlıkta PCLS tutun.
- Konfokal mikroskop altında görüntülerken, bir 20X objektif (Malzeme Listesi bakınız) kullanın. "Dışbükey" ayarında doku kenarlarını bulmak ve işaretlemek için "çini" aracını kullanın. Bu karo taramanın süresini azaltmaya yardımcı olacaktır.
- z yığın aralığı belirlenmesinde, özellikle de kenarlarında, dilimin çok alanlarda kontrol grubu aralıkları buuygundur.
NOT: z aralığı, doku tamamen düz bir şekilde almak çok zordur, çünkü dokunun kendisinin kalınlığından daha büyük olması gereken muhtemel olacaktır. dilim darbe ve eğrileri karşılamak için 250 um - Örneğin, bir 150 mikron kalınlığında PCLS ile, z-yığın aralığı muhtemelen 200 ayarlanması gerekecektir. 20X objektif ile 12 saat - z-yığın aralığı ve doku boyutuna bağlı olarak, her bir tam akciğer tarama 7 arasında sürer. Her akciğer tektir ve ayarları her deney için ayarlanmalıdır.
PCLS 5. Canlı Hücre Görüntüleme
- antikorlarla PCLS 30 dakika inkübasyondan sonra, çanak antikor çözüm kaldırmak ve Leibovitz-10 soğuk 1 mL'si ile iki kere dilimleri yıkayın.
- Pipet taze 50 uL Leibovitz-10 bölmeli coverglass (8 yuva) uzunlamasına bir içine. , Orta PCLS aktarmak için bir spatula kullanın dilim düz olana kadar yavaşça manipüle ve yaymak. yukarıdaki prosedürlerihtiyaç photobleaching önlemek için hızla yapılacak.
- Bir pipet kullanarak 50 mcL orta çıkarın. dilim mümkün olduğu kadar düz yatan tutulmayacaktır.
Not: dilim kenarları bölmenin duvarına dikey olarak ters çevrilmiş durumunda kabul edilebilir bir durumdur. Bundan başka, eğer varsa, bir metal platin ağırlığı bir sonraki aşamaya geçmeden önce, dilim sabitlemek için kullanılabilir. kesilmiş ve küçük ağırlıkların içine bükülebilir platin tel biri, örneğin bağlı Malzeme Listesi bakınız. - 4 ° C soğuk oda içinde, bir faktör-düşük büyüme, 100 uL Leibovitz-10 ile fenol kırmızısı içermeyen hücre dışı matrisin 100 uL karıştırın. Bunun için önceden soğutulmuş pipet uçları kullanın veya hücre dışı matris ucu sertleşir.
Not: matris ve ortamın Bu oran (1: 1), doku-kültür koşullarında PCLS basılı kadar yoğun bir jel oluşturur. - Yavaşça karıştırmak için matris pipet ve dikkatle jel lu üstüne gider emin olarak PCLS üstünde pipetdilim ng ve dilim jel üstünde yüzerek gelmez. Jel plakanın altına doğru aşağı PCLS ankraj, bir ağırlık olarak çalışması gerekir.
- Dikkatli bir şekilde 37 ° C inkübatör odacıklı coverglass aktarmak ve matris ~ 5 dakika boyunca katılaşmaya sağlar.
- Konfokal mikroskop önceden ısıtılmış aşamasında üzerine tüm odacıklı coverglass aktarın. görüntüleme boyunca 37 ° C'de bölmeyi muhafaza edin. Leibovitz ortamı kullanıldığında CO2 kaynağı cep inkübasyon sırasında gerekli değildir.
- çerçeveler arasında arzu edilen aralığına göre z-yığın aralığı ve kiremit aralığını ayarlayın. konfokal mikroskop altında görüntülerken, bir 20X objektif (Malzeme Listesi bakınız) kullanın. (Örneğin, bir 2x2 merkezli ızgara) "merkezli grid" ayarını kullanarak, dokuda ilgili bölgeyi belirtmek için "çini" aracını kullanın.
- z yığın aralığı ayarı da, ayar aralıkları uygun dilimin çok alanlarda kontrol edin.
NOT: zrange dokunun kalınlığını eşit olasılıkla. Her akciğer tektir ve ayarları her deney için ayarlanmalıdır. 2x2 çini ve 10 Z-yığınları, genellikle yaklaşık 1 kare / 2 dakika ile sonuçlanacaktır. Emin olun otomatik odaklanma fonksiyonu görüntüleme döneminde xy ve z-sürüklenme en aza indirmek için deneye başlamadan önce devreye girer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C57BL / 6 farelerinden alınan iki DC alt-konumunu, CD11b hi CDCS ve CD103 + CDCS, PCLS belirlemek için kesilmiş ve CD11c özgü monoklonal antikor (mAb) ile boyanmıştır, CD88, CD103, CD324 ve (E-kadherin). CD324 leke hava yolu epitelial hücreler ile antikorlar ve CD88 makrofajlar ve nötrofiller, ancak CDCS 8 gösterilir. Bu, CD11c + makrofajlardan CDCS ayırt etmek ve hava yolları (Şekil 1), her hücre türü uzaysal ilişkilerini gözlemlemek için izin verdi. Biz CD103 + CDCS öncelikle hava yolları ve subplevral alanı çevresinde bulunan ise CD11b hi CDCS parenkima lokalize olduğunu bulduk. CD103 + CDCS hali hazırda, bu deneyde hücre yüzeyi CD103 doğrudan boyanması ile tespit edilmiştir, ancak, CD11b tespit hi CDCS CD88 ve CD103 boyanma olmaması dayanıyordu. doğrudan CD11b tanımlamak içinyüksek CDCS, ilk yaygın immünohistokimyada kullanılabilir ve akış sitometrisi bir anti-CD 11 b mAb (klon M1 / 70) kullanarak, leke PCLS çalıştı. Bununla birlikte, bu mAb fluorochromes mAb konjüge (Şekil 2A ve veriler gösterilmemiştir) edildi bakılmaksızın, bu başvuruda, yüksek bir arka plan ve düşük özgüllük. Buna karşılık, CD172a (SIRP1α) antikorlarının CD11b yüksek CDCS 18 boyanmış, yapısal olmayan hücreleri ya da CD103 + CDCS (Şekil 2B ve veriler gösterilmemiştir). kendi başlarına, CD172a için antikorlar CDCS ve monositler veya makrofajlar ayrımı olamazdı. Geçiş makrofajlardan (CD172a + CD88 +) ve CD11b yüksek CDCS (CD172a + CD88 -) - Bununla birlikte, CD88 ve CD172a karşı antikorları ile birlikte boyama ile biz alveoler makrofajları (CD88 + CD172a) ayırt etmek mümkün ve göstermek bu ikinci hücreler tercihen lokalizeparankima, değil alt epitel alanı (Şekil 2C - F) anlaşmada bizim bulgularımız bu hücrelerin dolaylı boyama ile elde ile.
lökositlerin içi doku göç çalışma çevre dokulardan olan DH'ler trafik yoluyla bölgesel LN için lenfatiklerin de dahil olmak üzere yapısal hücrelerinde, görselleştirme gerektirir. Cilt ve LN olarak, lenfatik damarlar genellikle LYVE-1 veya podoplanin için mAbs kullanılarak tanımlanır. Bununla birlikte, PCLS olarak, mAb-1 LYVE ve podoplanin vasküler endotel ve alveol epiteline (veriler gösterilmemiştir) da dahil olmak üzere başka hücre tipleri, çeşitli leke bulunmuştur. Bu mAb'ler özellikle PCLS içinde lenfatik damarları tanımlamak için bu nedenle sınırlı pratik kullanımı vardır. Bununla birlikte, CD90.2 (Thy1.2), iyi bilinen bir T hücre markeri, etiketli lenfatik yapılara mAb'ler diğer dokular 19, 20 (Şekil 3A, B daha önce gösterildiği gibi Prox1 promotör 21 (Şekil 3A, C) transkripsiyonel kontrolü altında bir transgen tarafından şifrelenen tdTomato floresan proteini olduğu gibi. PROX1 lenfanjiyogenezin 22 için gerekli olan bir ana transkripsiyon faktörüdür. Prox1 tdTomato transgenik fareler, adrenal medulla 21 karaciğer, lens, dentat girus ve nöroendokrin hücreleri gibi akciğer ve diğer dokularda parlak floresan lenfatik damarların sergiler. Gerçekten de, bu iki etiketleme yöntemleri örtüşen boyanma (Şekil 3D) vermiştir. Bu etiketleme yaklaşımı kullanarak, CD103 + CDCS CD324 eksprese solunum yolu epitelinde, lenf ve subplevral alan (Şekil 3A, E) de dahil olmak üzere bazı anatomik alanlarda mevcut olduğunu tespit etmek mümkün.
Statik görüntüleme, hücre hareketi ve hücrenin yanı sıra cel içinl etkileşimleri PCLS (Film 1) canlı hücre görüntüleme kullanılarak kaydedilebilir. PCLS taze GFP-ifade eden OT-II, T hücreleri ve OVA ve LPS damlatılma enjeksiyonlarını almıştır farelerden hazırlandı, CD103 (kırmızı) ve solunum yolu epitelinde (CD324, mavi) karşı mAb'lerle boyanmış ve izlemek için görüntülenmiştir CD103 + CDCS ve T hücrelerinin hareketi OVA / LPS uygulamasından sonra 16 saat. Video (4 saat) boyunca, CD103 + DC'lere (kırmızı) ve uyarlayıcı şekilde transfer OVA-spesifik T hücrelerinin (yeşil) ve bunların etkileşiminin dinamik hareketi açıkça görülebilir (Film 1) bulunmaktadır.
PCLS Boyama ve konfokal mikroskop ile ortaya çıktığı gibi CDC altkümelerinin 1. Farklı anatomik yerler Şekil. A), çeşitli antikorlar ile boyanmış, muamele edilmemiş, C57BL / 6 fare akciğer Tüm PCLS. rengi her bir molekülün (üst sağ) yazı tipi renk ile belirtilir. Sarı; CD11c + CD88 + (, makrofajlar (-;; beyaz CD103 + CD11c'nin + CD88), CD11 hi CDCS (kırmızı CD11c + CD103 - - CD88) CD103 + CDCS: Bireysel ve kombinatoryal boyama aşağıdaki ilgi hücre tipleri için renkleri verir ), nötrofil (CD11c - CD88 +, yeşil) ve solunum yolu epitel hücreleri (CD324 +; mavi). B - D) A metne olan yüksek büyütme. B) CD11b hi CDCS parankimi lokalize. C) CD103 + solunum yolları etrafında CDCS. Viseral plevra altında D) CD103 + CDCS. Beyaz barlar 50 um belirtmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
DH'ler ve makrofajlar Şekil 2. boyanması. CD11b (mavi) antikorları ile PCLS A) Boyama PCLS yüksek bir arka plan verir. CD172a (yeşil B) antikorlar) CD11b + hücreleri için bir PCLS nispeten düşük arka plan ve yüksek bir spesifisitesi vardır. C), rengi yazı tipi rengi (sağ üstte) ile gösterilir mAbs ile boyandı, C57BL / 6 farelerinin Tüm PCLS. CD11c (kırmızı), CD88 (camgöbeği), CD172a (yeşil) ve CD324 (mavi). CD 11 b hi CDCS (CD11c + CD88 - CD172a + san), alveoler makrofajlar (CD11c + CD88 + CD172a -, pembe), geçiş makrofajlar (CD11c + CD88 + CD172a +; beyaz), nötrofil (CD11c - CD88 +; mavi) ve üst solunum yolları (CD324 +; mavi). D - F) metne olan yüksek büyütmeC 'de gösterilen. D) Alt plevral alanı. E) Alt-epitel alanı. F) interstisyel. Geçiş makrofajlar parankimi lokalize ve alveolar makrofajlar alveollerde bulunmaktadır. Etiketsiz beyaz çubuklar 50 um belirtmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
PCLS yapısal Hücrelerin Şekil 3. Etiketleme. A) Tüm PCLS Prox1 tdTomato fareden hazırlandı ve CD90.2 (yeşil) için mAbs ile boyanmış, CD103 (beyaz) ve CD324 (mavi). Prox1-ifade eden hücreler (kırmızı), genetik olarak Prox1 promoteri (Prox1-tdTomato) kontrolü altında tdTomato ile etiketlenmiştir. B - D) içerlek Daha yüksek büyütme
Film 1. T Hücreleri Akciğeri CD103 + CDCS ile etkileşim. T hücreleri (yeşil) ile etkileşim CD103 + CDCS (kırmızı) Canlı hücre görüntüleme. OVA-spesifik OT-II Nur77 GFP farelerden izole CD4 + T hücreleri, in vitro olarak dalak DH'ler ve OVA ile uyarılmış ve adoptif Rag aktarılmıştır - / - fare. 2 saat sonra, alıcı fare muamele edilmiştir witsolunum yolu h OVA / LPS ile uygulanmasını kapsamaktadır. 16 saat OVA / LPS ile muameleden sonra, PCLS yapılmış boyandı ve 37 ° C'de 4 saat boyunca görüntülenmiştir. Zaman görüntü (dak) kayıt gösterilmiştir. Bu videoyu görüntülemek için buraya tıklayın. (Indirmek için sağ tıklayın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol başlangıçta akciğer içinde CDCS iki alt kümelerinin yerleri görselleştirmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokol, hali hazırda hücre canlılığı ve akciğer üç-boyutlu yapısını muhafaza ederken, bir çok farklı hücre tipleri incelemek için adapte edilebilir. İkinci özellik hücre kültürü sistemleri üzerinden önemli bir avantaj olduğunu ve nadir hücre tiplerinin tanımlanması kolaylaştırır. yöntem, akciğer PCLS oluşturulmasına dayanır ve bir arka plan renklendirmesini en aza indirerek antikorların uygun bir kombinasyonu, belirli hücre tipleri tespit etmek. Büyük ölçüde, bu akış sitometrisi de dahil olmak üzere diğer uygulamalarda, iyi çalışır antikorlar zorunlu olarak PCLS boyanması için iyi çalışmaz, çünkü ampirik bir uygulamadır. Biz zaten bu konuda önemli ilerleme kaydettiğini, ancak burada ele hücre tiplerini okumak isteyen araştırmacılar farklı antikorları test etmek ve fluorochromes ve konsantrasyonlarını optimize etmek gerekebilir. Burada anlatılan protokolü kullanarak, CD103 + CDCS ve CD11 hi CDCS akciğerde farklı lokalizasyonlarda olduğunu fark ettim. CD 11 b hi CDCS esas parankimi bulundu ise Durağan durumda, CD103 + CDCS, hava yolları etrafında subplevral bölgede tespit edildi. Burada tarif protokolü hücre içi molekülleri boyanması için uygun değildir, ancak, bu görüntüleme hücre yüzeyi işaretçileri, ayrıca salgı moleküller için yararlıdır. Böylece, PCLS olarak kemokinler, CCL21 ve CCL19 tespit etmek mümkün olmuştur (veriler gösterilmemiştir). zayıf floresan sinyalleri primer antikorlar kullanılarak görülür, bu sinyalleri amplifiye etmek için sekonder antikorlar kullanmak mümkündür.
PCLS canlı hücre video görüntüleme iletken büyük bir meydan okuma yeterince 4 saatlik mikroskopi döneminde önemli xy- ve z-akıntısını önlemek için kültür ortamında doku demirlemek etmekti. Bu sorunu çözmek için, deneylerFarklı, oda sıcaklığında katı olan hücre dışı matrise Leibovitz ortamı, oranları ve belirlenen bir 1: 1 oranında, hücre canlılığı ile, stabil, 3 boyutlu yapısını muhafaza. sonrası görüntü işleme sırasında, aynı zamanda herhangi bir ek tesadüfi xy veya z kayma (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx ortadan TurboReg ve StackReg adı ImageJ eklentileri, bir dizi kullanılabilir? id = 18226). konfokal mikroskop otomatik odak aracını kullanarak, ilgi bölgesi tüm tarama süresi boyunca, özellikle de z-aralığında, odak tutuldu. PCLS canlı hücre görüntüleme sırasında diğer zorluk mikroskobu kiremit taraması, z-yığını, zaman serileri ve otomatik odaklama fonksiyonları kullanılarak yapıldı. her çerçeve arasındaki süreyi en aza indirmek için, bir denge her karo tarayarak harcanan zaman arasında bir dengenin sağlanması gerekir. Her bir araştırma projesine tarama süresini optimize etmek için, z-yığın numarası, fayans, ve tarama hızı ayarlanması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ilan etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Biz mikroskobu ile yardım için Jeff Tucker, Erica Scappini ve Agnes Janoshazi ederim, eleştirel okuma fare kolonisinin onun yönetimi için Ligon Perrow ve Jun Chen ve Michael Sanderson doku dilimleme makinesi ile yardım ve Michael Fessler ve Derek Cain el yazması. Bu çalışma da Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı tarafından desteklenmektedir NIEHS, NIH (Zia ES102025-09), intramural dalı tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
