Summary
Nous décrivons un procédé pour générer des tranches de poumon couper avec précision (PCLS) et les immunocoloration pour visualiser la localisation de divers types de cellules immunitaires dans le poumon. Notre protocole peut être étendu pour visualiser l'emplacement et la fonction de différents types de cellules dans une variété de conditions.
Abstract
L'inhalation d'allergènes et d'agents pathogènes provoque plusieurs changements dans une variété de types de cellules immunitaires dans les poumons. La cytométrie en flux est une technique puissante pour l'analyse quantitative des protéines de surface cellulaire sur les cellules immunitaires, mais il ne fournit aucune information sur les schémas de localisation et de migration de ces cellules dans le poumon. De même, les tests de chimiotaxie peuvent être effectués pour étudier le potentiel des cellules à répondre à des facteurs chimiotactiques in vitro, mais ces tests ne se reproduisent pas à l'environnement complexe du poumon intact. Contrairement à ces techniques mentionnées ci-dessus, l'emplacement des types cellulaires individuels dans le poumon peut être visualisé facilement en générant des tranches de poumon coupe de précision (PCLS), leur coloration avec disponibles dans le commerce, des anticorps par fluorescence marqués, et la visualisation des sections par microscopie confocale. PCLS peuvent être utilisés pour les vivre et les tissus pulmonaires fixes, et les tranches peuvent englober des domaines aussi grande qu'une section transversale d'un lobe entier. Nous avons utilisé ce protocole pour visualiser avec succès l'emplacement d'une grande variété de types de cellules dans les poumons, y compris les types distincts de cellules dendritiques, les macrophages, les neutrophiles, les lymphocytes T et les cellules B, ainsi que les cellules structurelles telles que lymphatique, endothéliale et cellules épithéliales. La capacité à visualiser les interactions cellulaires, telles que celles entre les cellules dendritiques et les cellules T, en temps réel, le tissu pulmonaire en trois dimensions, peut révéler comment les cellules se déplacent dans le poumon et interagir avec l'autre à l'état stable et pendant l'inflammation. Ainsi, lorsqu'il est utilisé en combinaison avec d'autres procédures, telles que cytométrie en flux et la PCR quantitative, PCLS peut contribuer à une compréhension globale des événements cellulaires qui sous-tendent les maladies allergiques et inflammatoires du poumon.
Introduction
À la suite de l'inhalation de stimuli pro-inflammatoires tels que lipopolysaccharide (LPS), il y a un mouvement coordonné de cellules immunitaires dans, à l'intérieur et du poumon. Par exemple, les neutrophiles sont rapidement recrutés pour le parenchyme pulmonaire et des voies respiratoires. En outre, certaines cellules présentatrices d'antigène professionnelles appelées cellules dendritiques classiques (CDCS) subissent un motif de migration relativement complexe 1, 2. CDCS peuvent être identifiés par cytométrie de flux, basés en partie sur leur affichage du marqueur de surface, CD11c. Sous - ensembles distincts de DC peuvent être distingués par l'expression de surface différentielle de CD103 et CD11b 3. Lors de l' acquisition de l' antigène inhalé, certains CDCS sortent du poumon et migrent à travers les vaisseaux lymphatiques vers les ganglions lymphatiques drainant __gVirt_NP_NN_NNPS<__ pulmonaires (__gVirt_NP_NNS_NNPS<__ LNS) où ils présentent des peptides à des cellules T spécifiques de l' antigène 4. Ceci est un événement précoce critique dans l'initiation de r immunitaire adaptatifEPONSES. Pour des raisons inconnues, cependant, tous les CDCS qui acquièrent des antigènes inhalés quittent le poumon, et bon nombre de ces cellules restent dans cet organe pendant plusieurs mois 5, 6. Cette observation peut être expliqué en partie par l'origine du développement de ces cellules car CD11c + dérivées de monocytes des cellules dépourvues du récepteur de chimiokines, CCR7, ne parviennent pas à migrer vers les ganglions régionaux 7, 8. Il semble probable que le potentiel de migration des CDCS est également déterminée, au moins en partie, par leur position anatomique dans le poumon. Cependant, la localisation précise de ces différentes populations de CDCS dans le poumon n'est pas complètement caractérisée. Une meilleure connaissance de la localisation des cellules immunitaires dans le poumon, et des molécules qui dirigent, est nécessaire pour une meilleure compréhension de la façon dont le système immunitaire du poumon est activé.
PCLS sont en augmentationly utilisé comme une approche ex vivo pour visualiser les interactions de positionnement cellulaire et cellule-cellule, tout en maintenant l'intégrité structurelle de l'architecture du poumon 9, 10. PCLS ont été utilisés pour étudier les poumons de nombreuses espèces, y compris les souris, les bovins, les singes, les moutons, les chevaux et les humains 11. Un avantage majeur de cette technique est que environ 20 tranches peuvent être préparées à partir d'un seul lobe d'un poumon de souris, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour des expériences individuelles. Pratiquement tous les types de cellules immunitaires, y compris les contrôleurs de domaine, les macrophages, les neutrophiles et les lymphocytes T, sont présents dans PCLS et de maintenir leurs structures normales.
PCLS peut également être utilisé pour étudier la signalisation du calcium et de la contractilité des voies respiratoires et les cellules musculaires lisses après le traitement avec acétylcholine 12 ou 13 méthacholine. Dans cette approche, seule une petite partie du poumon est unalyzed microscopiquement, mais une étude a rapporté que les mesures de la contraction des voies respiratoires dans PCLS varient seulement environ 10% de la tranche à tranche, et cet écart est comparable à celle observée en utilisant des tests de la fonction pulmonaire chez les animaux intacts 14. D' autres chercheurs ont utilisé PCLS comme une approche ex vivo pour étudier les changements dans l' expression des cytokines et des marqueurs de surface cellulaire après incubation avec du LPS 15. PCLS ont également été utilisés dans un modèle ex vivo de la vasoconstriction pulmonaire hypoxique dans les petites artères intra-acineuses. Ces navires sont situés dans la partie du poumon qui ne peut être atteint en utilisant d' autres procédures, y compris des enregistrements de segments artériels ou disséqués analyse des vaisseaux pleuraux 16. Notre laboratoire a principalement utilisé PCLS pour visualiser la localisation des cellules immunitaires dans le tissu pulmonaire en direct à l'équilibre et à la suite d' un stimulus inflammatoire in vivo. Les procédures que nous avons mis au point pour ce sont les suivantes.
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Protocol
procédures expérimentales animales décrites dans le présent document ont été approuvés par le soin des animaux NIEHS et le Comité d'utilisation (IACUC).
1. Préparation du poumon
- souris Maison de 6 à 12 semaines d'âge dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques conformément aux lignes directrices fournies par les soins des animaux et des institutions. Utiliser des comités
REMARQUE: Les souris peuvent être soit image nouvellement créée naïve, ou traité, en fonction des intérêts spécifiques de chaque chercheur. Ici, nous décrivons la localisation des cellules immunitaires chez des souris naïves et de souris traitées avec 100 ug d'ovalbumine (OVA) et 0,1 pg de lipopolysaccharide (LPS), en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en tant que véhicule dans un volume total de 50 ul. Pour instiller oropharyngeally OVA / LPS dans les voies respiratoires, les animaux ont été anesthésiés par inhalation isoflurane et suspendus verticalement par leurs dents avec une bande de caoutchouc. La langue a été doucement saisi avec une pince et tenue d'un côté pour éviter d'avaler, et 50 & #181; L de la solution d' OVA / LPS déposé au fond de la cavité buccale tel que décrit précédemment 17. - Euthanasier la souris avec une injection intraperitoneale de pentobarbital de sodium (100 mg / kg), et la broche de l'animal à une base de polystyrène.
- Ouvrir la cavité abdominale avec des ciseaux en coupant la peau et du péritoine à partir du milieu de l'abdomen jusqu'à la mâchoire. Tirer les intestins de côté avec une pince ou le bord terne des ciseaux, et couper la veine cave inférieure pour évacuer le sang hors des poumons. Perforer le diaphragme avec la pointe tranchante de la paire de ciseaux pour permettre l'expansion de la cage thoracique, en faisant attention à ne pas couper les poumons.
- glandes salivaires claires et d'autres tissus loin de la trachée en saisissant le tissu et en tirant manuellement loin de la trachée sous-jacente avec une pince. Faire une petite incision dans la trachée du côté antérieur de la bande de cartilage plus épaisses à l'aide de pinces fines ou des ciseaux, en faisant attention à ne pas couper tout le chemin que le trachea. L'incision sera juste assez grand pour permettre une aiguille 20 G de passer à travers.
- Glisser un 1,5 pouces, 20 aiguille G sur une section de tube en polyéthylène, en laissant environ 1 cm de tube au-delà de l'extrémité de l'aiguille. Couper le tube selon un angle d'environ 45 ° par rapport à biseauter l'extrémité, fixer l'aiguille à une seringue de 1 mL, et de charger la seringue en tirant 0,8 mL d'eau tiède (40 ° C) 2% de bas point de fusion d'agarose à travers l'aiguille.
- Placer l'extrémité du tube dans l'incision de la trachée et injecter lentement l'agarose dans les poumons. Sans déplacer l'aiguille ou une seringue, la seringue du ruban adhésif à la base de polystyrène pour assurer l'aiguille reste dans la trachée.
NOTE: Après l'injection, les poumons sera plus grande et gonflé à l'intérieur de la poitrine. Les lobes droit étendent d'abord, puis le lobe gauche. Si un seul lobe augmente, l'aiguille a été insérée trop profondément (passé la bronche), et il sera nécessaire de tirer légèrement avant de poursuivre. Cette partie dula procédure doit être fait relativement rapidement, avant que l'agarose commence à se solidifier. - Placez la souris, avec la base et la seringue encore insérée dans la trachée, dans une chambre froide ou un réfrigérateur pendant au moins 10 min. Le cas échéant, l'animal peut y être conservé pendant plusieurs heures, même si passer à la migration des cellules d'image par microscopie vidéo.
- Une fois que la souris est froid, exciser soigneusement les poumons gonflés agarose à l'aide de ciseaux, et placez-les dans un plat de 3 cm avec PBS glacé. Gardez sur la glace.
- Choisir le lobe désiré pour le tranchage de tissus (par exemple, le lobe supérieur droit). Assurez-vous que la partie intérieure du poumon (où il se connecte à la trachée) est face vers le bas dans le plat.
NOTE: Le lobe utilisé et son orientation sur le piston déterminera la taille des navires et des voies respiratoires qui seront visibles. L'orientation décrite ici est idéale pour la visualisation des grandes voies respiratoires et parenchyme. Les souris ont un grand lobe gauche et quatre lobes plus petits sur la droite. Pourimagerie PCLS suite à l'introduction d'allergènes dans les poumons par aspiration oropharyngée ou intranasale, le lobe supérieur droit est généralement sectionné, en partie parce qu'il est une taille pratique, mais aussi parce que les agents inhalés disperser uniformément à l'intérieur. Cependant, d'autres lobes, en particulier le lobe gauche, peuvent également être étudiés. Lorsque l'on compare les souches de souris ou de traitements, il est important de comparer le même lobe.
2. Slicing pulmonaire
REMARQUE: Faire des tranches à l'aide d'un trancheur automatique, bloc de refroidissement métallique, le piston et la seringue en métal, selon les instructions du fabricant.
- Mettez une petite goutte de tout usage, gel sans courir sur superglue le piston et la propagation de la colle dans un mouvement circulaire, en prenant soin de ne pas laisser la colle toucher les côtés de la seringue métallique. Si la colle en contact avec les côtés de la seringue, on colle la seringue et le piston ensemble.
- Immédiatement après avoir couvert le piston avec de la colle, saisir délicatement lelobe excisé avec une pince avec le côté de la trachée vers le bas, tamponner sur un tissu pour éliminer l'excès de liquide, et placer délicatement sur le dessus du piston. Coupez tout tissu supplémentaire allant au-delà du bord du piston.
- Déplacer le piston vers le bas de sorte que les côtés de la seringue métallique se déplacent vers le haut et sur le tissu, ce qui crée un puits avec le poumon collé au fond, pas plus de quelques centimètres de profondeur. Bande autour du fond de la seringue de métal pour maintenir cette position en place.
- Versez délicatement 2% d'agarose bas point de fusion à 40 ° C dans le puits de sorte qu'il couvre tout le sommet du lobe.
- Entourer la seringue métallique avec le bloc de refroidissement glacé et refroidir le lobe et l'agarose à 1 - 2 min.
REMARQUE: Un refroidissement plus courte de l'agarose entourant le tissu pourrait conduire à une désintégration de l'agarose pendant la coupe, ce qui pourrait se traduire par une PCLS coupé de façon inégale. - Charger la seringue d'échantillon dans la trancheuse automatique et remplir le réservoir tampon avec du PBS glacé. aligner la l'étape d'entraînement à moteur avec la seringue d'échantillon et retirer le morceau de ruban adhésif à partir du bas. Mettez l'interrupteur à la position avance rapide (FF) jusqu'à ce que le lecteur de moteur pas à pas touche juste à l'arrière du piston.
- Aligner la lame fraîche avec la seringue de prélèvement. Ensemble épaisseur du tissu, couper en continu / simple, l'oscillation et la vitesse dans la trancheuse. Par exemple, l'épaisseur du tissu: 150 um, de coupe continue (suite.), Oscillation: 9, et la vitesse: 3 - 4. Appuyez sur start. Les paramètres ci-dessus doivent être adaptés aux spécifications de trancheuse spécifiques automatisés.
- Utilisation d'une mince spatule ou d'un pinceau, recueillir le PCLS un à la fois comme ils tombent dans le réservoir de tampon et les placer dans une plaque à 24 puits contenant du PBS froid comme la glace.
NOTE: Il est important de garder les tranches afin de maintenir la cohérence entre les expériences. Bien que chaque poumon est différent selon l'âge, le sexe et le poids, la 10 e tranche, par exemple, les rendements généralement de taille similaire voies respiratoires.
- Concevoir un panel d'anticorps marqués par fluorescence en fonction du type de cellule d'intérêt, en tenant compte du potentiel de chevauchement spectral fluorescent et les capacités de détection du microscope.
REMARQUE: A titre d'exemple, un panneau pour la détection de sous-DC est le suivant: CD11c / alpha X intégrine - BrilliantViolet (BV) 605 (Excitation: 405 nm, émission de crête: 605 nm), CD324 / E-cadhérine - Alexa 488 (AF488 ) (excitation: 488 nm, émission de crête: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - phycoérythrine (PE) (excitation: 561 nm, émission de crête: 578 nm), CD103 / alpha E intégrine - allophycocyanine (APC) (excitation: 633 nm , l'émission de crête: 660 nm). outils de la visionneuse spectrales de fluorescence (voir Liste des matériaux) sont utiles pour concevoir des panneaux. - Faire un cocktail d'anticorps contenant les anticorps désirés.
- Pour l'imagerie de PCLS statique, ajouter 800 ul de tampon de coloration, bloqueur 100 ul de Fc, 50 ul de sérum de souris normale, et 50 ul de sérum de rat normal à 1,5 mL microcentrifutube de gation pour un volume total de 1 ml. Pour l'imagerie des cellules vivantes, en utilisant 800 uL de milieu de Leibovitz (1x) contenant 10% de FBS (Leibovitz-10) au lieu du tampon de coloration.
- Ajouter les anticorps à ajuster une concentration finale désirée de chaque anticorps. Transférer la solution d'anticorps à un plat de 3 cm, et de garder dans l'obscurité jusqu'à prêt à l'emploi.
REMARQUE: Les concentrations finales doivent être optimisés pour chaque anticorps individuel (habituellement 1-5 pg / ml).
- Choisir un PCLS avec une zone anatomique d'intérêt, tels que les grandes voies aériennes ou périphérie du poumon, et les placer dans le plat de 3 cm contenant la solution d'anticorps de 1 mL.
- PCLS de taches dans l'obscurité, sur la glace, à bascule lentement pendant 30 ou 60 minutes.
- Pour l'imagerie PCLS statique, passez à la section 4. Pour l'imagerie des cellules vivantes, passez à la section 5.
4. Imagerie statique de PCLS
- Après 60 minutes d'incubation avec des anticorps de PCLS, enlever la solution d'anticorps à partir de la capsule et rincer til tranche deux fois avec 1 ml PBS glacé.
- Pipeter 50 uL de PBS sur un plat rond de 3 cm à fond de verre. À l'aide d'une spatule ou d'un pinceau, transférer les PCLS colorées à la baisse, la manipulation doucement la tranche jusqu'à ce qu'il soit plat et étaler. Retirez le PBS avec une pipette. La tranche doit reposer le plus plat possible. Les procédures ci-dessus doivent être effectuées rapidement pour éviter photoblanchiment.
- Placer une goutte de milieu de montage à la température ambiante sur la tranche et déposer délicatement une lamelle de verre dans le puits de la plaque. Gardez PCLS dans l'obscurité à 4 ° C pendant jusqu'à une heure avant l'imagerie.
- Lors de la visualisation au microscope confocal, utilisez un objectif 20x (voir Liste des matériaux). Utiliser l'outil « tuile » pour localiser et marquer les bords du tissu dans le réglage « enveloppe convexe ». Cela permettra de réduire le temps de l'analyse des carreaux.
- Bien que le réglage de la gamme z-stack, vérifier à plusieurs zones de la tranche, en particulier le long des bords, que les plages de réglagesont appropriés.
NOTE: La z gamme sera probablement besoin d'être supérieure à l'épaisseur du tissu lui-même, car il est très difficile d'obtenir le tissu de poser complètement à plat. Par exemple, avec un PCLS épais de 150 um, la gamme z-stack aura probablement besoin d'être réglé à 200-250 um pour recevoir des bosses et des courbes dans la tranche. En fonction de la gamme z-pile et la taille du tissu, chaque analyse complète des poumons prendra entre 7 - 12 h avec un objectif 20X. Chaque poumon est unique et les réglages doivent être ajustés pour chaque expérience.
5. Imagerie cellulaire en direct de PCLS
- Après 30 minutes d'incubation avec des anticorps de PCLS, enlever la solution d'anticorps à partir de la capsule et rincer les tranches deux fois avec 1 mL froid Leibovitz-10.
- Pipette frais 50 uL Leibovitz-10 dans une fente d'une lamelle chambré (8 emplacements). Utilisez une spatule pour transférer les PCLS au milieu, la manipulation doucement jusqu'à ce que la tranche est plat et étaler. Les procédures ci-dessusdoivent être effectuées rapidement pour éviter photoblanchiment.
- Retirez le support de 50 pi à l'aide d'une pipette. La tranche doit être couché aussi plat que possible.
Remarque: il est acceptable si les bords de la tranche sont retournées à la verticale contre la paroi de la chambre. En outre, le cas échéant, d'un poids de platine métallique peut être utilisé pour ancrer la tranche avant de passer à l'étape suivante. Voir la liste des matériaux ci-joint pour un exemple de fil de platine qui peut être coupé et plié en petits poids. - Dans un 4 ° C chambre froide, mélanger 100 pi de facteur de réduction de la croissance, la matrice extracellulaire exempt de rouge de phénol avec 100 uL Leibovitz-10. Utilisez des embouts de pipette prérefroidis pour cela, ou la matrice extracellulaire se solidifie dans la pointe.
NOTE: Ce ratio de la matrice et le milieu (1: 1) crée un gel suffisamment dense pour maintenir les PCLS vers le bas dans des conditions de culture de tissus. - pipette doucement la matrice pour mélanger, et soigneusement la pipette au-dessus des PCLS, en veillant à ce que le gel va au-dessus du loung tranche et que la tranche ne flotte pas sur le dessus du gel. Le gel doit travailler en poids, l'ancrage des PCLS vers le bas sur la partie inférieure de la plaque.
- transférer soigneusement les couvre-objet chambré à un incubateur à 37 ° C et laisser se solidifier la matrice pendant environ 5 min.
- Transférer l'ensemble de la lamelle chambré sur la scène préchauffé d'un microscope confocal. Maintenir la chambre à 37 ° C tout au long de l'imagerie. Alimentation en CO 2 ne soit pas nécessaire au cours de l'incubation de la cellule lors de l' utilisation du milieu de Leibovitz.
- Définir la plage z-stack et la gamme carreaux sur la base de l'intervalle souhaité entre les trames. Lors de la visualisation au microscope confocal, utilisez un objectif 20x (voir Liste des matériaux). Utiliser l'outil « tuile » pour désigner la zone d'intérêt dans les tissus, en utilisant le réglage « de la grille centrée » (par exemple, une grille de 2x2 centré).
- Bien que le réglage de la gamme z-stack, vérifier à plusieurs zones de la tranche que les plages de réglage sont appropriées.
REMARQUE: ZRange sera probablement égale à l'épaisseur du tissu. Chaque poumon est unique et les réglages doivent être ajustés pour chaque expérience. 2x2 tuiles et 10 z piles entraînera généralement une trame ~ / 2 min. Assurer la fonction mise au point automatique est activé avant de commencer l'expérience pour minimiser xy et z dérive au cours de la période de formation d'image.
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Representative Results
Pour identifier l'emplacement de deux sous - ensembles à courant continu, CD11b hi CDCS et CD103 + CDCS, PCLS de souris C57BL / 6 ont été coupées et colorées avec des anticorps monoclonaux (mAb) spécifiques de CD11c, CD88, CD103, CD324 et (E-cadhérine). Les anticorps dirigés contre des voies respiratoires tache CD324 cellules épithéliales et CD88 est affiché sur les macrophages et des neutrophiles, mais pas CDCS 8. Ceci nous a permis de distinguer CDCS de CD11c + macrophages, et d'observer la relation spatiale de chaque type cellulaire dans les voies respiratoires (Figure 1). Nous avons constaté que CD11b hi CDCS localisent dans le parenchyme, alors que CD103 + CDCS résident principalement autour des voies respiratoires et la zone subpleural. Bien que CD103 + CDCS ont été facilement détectée par une coloration directe de CD103 de surface cellulaire dans cette expérience, la détection de CD11b salut CDCS invoqué l'absence de coloration CD88 et CD103. Pour identifier directement CD11bsalut CDCS, nous avons d' abord tenté de PCLS tache en utilisant un anticorps monoclonal anti-CD11b (clone M1 / 70), qui est largement utilisé en immunohistochimie et cytométrie de flux. Cependant, cette mAb avait un bruit de fond élevé et une faible spécificité dans cette application, quelle que soit la fluorochromes ont été conjugués à l'anticorps monoclonal (figure 2A, et les données non présentées). En revanche, les anticorps dirigés contre CD172a (SIRP1α) colorées CD11b salut CDCS 18, mais pas les cellules de structure ou CD103 + CDCS (figure 2B, et les données non présentées). À eux seuls, les anticorps dirigés contre CD172a ne pouvaient pas distinguer entre CDCS et les monocytes ou les macrophages. Cependant, en co-coloration avec des anticorps contre CD88 et CD172a, nous avons pu distinguer les macrophages alvéolaires (CD172a - CD88 +) des macrophages interstitiels (CD172a + CD88 +), et CD11b hi CDCS (CD172a + CD88 -), et montrent que ces dernières cellules se localisent préférentiellement dans laparenchymes, pas la zone sous-épithéliale (figure 2C - F), en accord avec nos résultats obtenus par coloration indirecte de ces cellules.
Etude de la migration intra-tissus des leucocytes nécessite la visualisation des cellules structurelles, y compris celles des vaisseaux lymphatiques, par lesquels le trafic des tissus périphériques DCs à LNS régionaux. Dans la peau et le LNS, les vaisseaux lymphatiques sont souvent identifiés à l'aide des anticorps monoclonaux à LYVE-1 ou podoplanin. Cependant, nous avons constaté que dans PCLS, mAbs à Lyve-1 et podoplanin tache une variété d'autres types de cellules, y compris l'endothélium vasculaire et de l'épithélium alvéolaire (données non présentées). Ces anticorps monoclonaux sont donc d'une utilité pratique limitée pour identifier spécifiquement les vaisseaux lymphatiques dans PCLS. Cependant, mAbs à CD90.2 (Thy1.2), un marqueur de cellules T bien connu, des structures lymphatiques marquées, comme indiqué précédemment dans d' autres tissus 19, 20 (figures 3A, B Prox1 21 (figure 3A, C). PROX1 est un facteur de transcription de base qui est nécessaire pour la lymphangiogenèse 22. Prox1 tdTomato souris transgéniques présentent des vaisseaux lymphatiques brillamment fluorescentes dans les poumons et d' autres tissus tels que le foie, le cristallin, corps godronné et les cellules neuroendocrines de la médullosurrénale 21. En effet, ces deux méthodes d'étiquetage ont donné des motifs de coloration qui se chevauchent (Figure 3D). L' utilisation de ces approches d'étiquetage, nous avons pu déterminer que CD103 + CDCS étaient présents dans plusieurs zones anatomiques, y compris l' épithélium des voies respiratoires CD324 exprimant, les vaisseaux lymphatiques, et la zone sous - pleurale (figure 3A, E).
En plus de l'imagerie statique, le mouvement des cellules et la cellule à CELInteractions L peuvent être enregistrés en utilisant l' imagerie des cellules vivantes de PCLS (Film 1). PCLS ont été fraîchement préparées à partir de souris qui avaient reçu des injections de GFP exprimant des cellules T OT-II et l'instillation d'OVA et de LPS, colorées avec des mAb contre CD103 (rouge) et l'épithélium des voies aériennes (CD324, bleu), et ont été imagées pour suivre la mouvement de CD103 + CDCS et les cellules T 16 heures après l' OVA / LPS instillation. Au cours de la vidéo (4 h), le mouvement dynamique de CD103 + DC (rouge) et les cellules T spécifiques OVA transférés adoptivement (vert) et leur interaction sont clairement visibles (film 1).
Figure 1. Emplacements des Distinct Anatomic Cdc Révélé par Sous - ensembles comme PCLS Coloration et Microscopie confocale. A) Le total des PCLS d'un C57BL non traité / 6 poumon de souris colorées avec différents anticorps. La couleur de chaque molécule est indiquée par sa couleur de police (en haut à droite). Coloration individuelle et combinatoire donne les couleurs suivantes pour les types de cellules d'intérêt: CD103 + CDCS (CD103 + CD11c + CD88 -, blanc), CD11b salut CDCS (CD11c + CD103 - CD88 -, rouge), les macrophages (CD11c + CD88 +; jaune ), les neutrophiles (CD11c - CD88 +, vert) et les cellules épithéliales des voies aériennes (CD324 +, bleu). B - D) un grossissement supérieur des EISN en A. B) CD11b hi CDCS localisent dans le parenchyme. C) CD103 + CDCS autour des voies respiratoires. D) CD103 + CDCS sous la plèvre viscérale. Les barres blanches représentent 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Coloration des contrôleurs de domaine et Macrophages. A) Coloration des PCLS avec des anticorps à CD11b (bleu) donne un bruit de fond élevé dans PCLS. B) Les anticorps anti-CD172a (vert) ont un arrière - plan relativement faible et une plus grande PCLS spécificité pour les cellules CD11b +. C) Le total PCLS de souris C57BL / 6 colorées avec mAb dont la couleur est indiquée par la couleur de police ( en haut à droite). CD11c (rouge), CD88 (cyan), CD172a (vert) et CD324 (bleu). CD11b hi CDCS (CD11c + CD88 - CD172a +, jaune), les macrophages alvéolaires (CD11c + CD88 + CD172a -; rose), les macrophages interstitiels (CD11c + CD88 + CD172a +; blanc), neutrophiles (CD11c - CD88 +; cyan) et des voies aériennes (CD324 +, bleu). D - F) plus fort grossissement des EISNreprésenté sur C. D) la zone de sous-pleural. E) les sous-épithéliale. F) interstitium. macrophages interstitiels localisent dans le parenchyme et les macrophages alvéolaires sont dans les alvéoles. barres blanches non marqués représentent 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Étiquetage des cellules structurelles dans PCLS. A) entiers PCLS préparées à partir de souris Prox1 tdTomato, et colorées avec des mAb de CD90.2 (vert), CD103 (blanc) et CD324 (bleu). les cellules exprimant Prox1 (rouge) sont génétiquement marquées avec tdTomato sous la régulation du promoteur de Prox1 (Prox1-tdTomato). B - E) grossissement supérieur de l'encart dans
Film 1. Cellules T Interagir avec CD103 + CDCS dans le poumon. Imagerie des cellules vivantes de CD103 + CDCS (rouge) coopérant avec des cellules T (vert). Cellules T CD4 + isolées à partir de souris Nur77 GFP spécifiques à OVA OT-II ont été stimulées avec des DC spléniques et OVA in vitro et transfert adoptif dans Rag - / - souris. 2 heures plus tard, la souris receveuse a été traité d'esprith OVA / LPS instillation aux voies aériennes. 16 h après le traitement OVA / LPS, PCLS ont été effectuées, colorées et imagées pendant 4 h à 37 ° C. d'enregistrement d'image Temps (min) est indiquée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Le protocole décrit ici a été initialement développé pour visualiser l'emplacement des deux sous-ensembles de CDCS dans le poumon. Cependant, ce protocole peut être facilement adapté à l'étude de différents types de cellules, tout en maintenant la viabilité des cellules et l'architecture en trois dimensions du poumon. Cette dernière caractéristique est un avantage important par rapport aux systèmes de culture cellulaire et facilite l'identification des types de cellules rares. La méthode repose sur la génération de PCLS du poumon, et une combinaison appropriée d'anticorps pour identifier les types de cellules spécifiques tout en minimisant la coloration de fond. Dans une large mesure, c'est un exercice empirique, car les anticorps qui fonctionnent bien dans d'autres applications, y compris cytométrie de flux, ne fonctionnent pas nécessairement pour la coloration PCLS. Nous avons déjà fait des progrès considérables à cet égard, mais les chercheurs qui souhaitent étudier les types cellulaires ne sont pas abordées ici peut avoir à tester différents anticorps et d'optimiser fluorochromes et les concentrations. En utilisant le protocole décrit ici, nous avons trouvé que hi CDCS CD103 + CDCS et CD11b résident à différentes localisations dans les poumons. À l' état d' équilibre, CD103 + CDCS ont été détectés autour des voies respiratoires et dans la région subpleural, alors que CD11b hi CDCS ont été principalement trouvés dans le parenchyme. Bien que le protocole, nous décrivons ici ne convient pas pour la coloration des molécules intracellulaires, il est utile pour les marqueurs de surface cellulaire d'imagerie, ainsi que des molécules sécrétoires. Ainsi, nous avons pu détecter le chimiokines, CCL21 et CCL19, dans PCLS (données non présentées). Si seuls les signaux fluorescents faibles sont observés en utilisant des anticorps primaires, il est possible d'utiliser des anticorps secondaires pour amplifier ces signaux.
Un défi majeur lors de la conduite d'imagerie vidéo-cellulaire en direct de PCLS était d'ancrer suffisamment le tissu dans un milieu de culture pour prévenir et z significative XY- dérive au cours de la période de microscopie à 4 h. Pour y remédier, nous avons expérimentéavec différents rapports de milieu de Leibovitz à la matrice extracellulaire, qui est solide à la température ambiante, et déterminé un rapport de 1: 1 maintenu stable, structure 3D avec la viabilité cellulaire. Au cours du traitement post-image, on utilise également une série de plug-ins ImageJ, appelé TurboReg et StackReg qui éliminent tout accessoire supplémentaire xy ou z-décalage (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx? id = 18226). En utilisant l'outil de mise au point automatique du microscope confocal, la région d'intérêt a été maintenu au point, en particulier dans la z-gamme, pendant toute la période de balayage. Un autre défi au cours de l'imagerie des cellules vivantes de PCLS utilisait le balayage de la tuile, z-stack, les séries chronologiques, et les fonctions de mise au point automatique du microscope. Pour réduire au minimum doit être atteint le temps entre chaque image, un équilibre entre le temps passé à la numérisation de chaque tuile. Pour optimiser le temps d'analyse dans chaque projet de recherche, le nombre z-pile, tuiles, et des vitesses de balayage doivent être ajustés.
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Disclosures
Les auteurs ont aucun conflit d'intérêt à déclarer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Jeff Tucker, Erica Scappini, et Agnes Janoshazi pour leur aide à la microscopie, Ligon Perrow pour sa gestion de la colonie de la souris, et Jun Chen et Michael Sanderson pour aider à la trancheuse de tissus, et Michael Fessler et Derek Cain pour la lecture critique le manuscrit. Ce travail a été financé par la branche intra-muros du NIEHS, le NIH (ZIA ES102025-09), qui est à son tour parrainé par le ministère de la Santé et des Services sociaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
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