Summary
نحن تصف طريقة لتوليد قطع الدقة الرئة شرائح (PCLS) والمناعية لهم لتصور توطين مختلف أنواع الخلايا المناعية في الرئة. ويمكن تمديد بروتوكول لدينا تصور موقع وظيفة العديد من أنواع مختلفة من الخلايا في إطار مجموعة من الشروط.
Abstract
استنشاق المواد المسببة للحساسية والجراثيم يثير عدة تغييرات في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المناعية في الرئة. التدفق الخلوي هو أسلوب قوية للتحليل الكمي للبروتينات سطح الخلية في الخلايا المناعية، لكنه لا يقدم أي معلومات عن التوطين والهجرة أنماط من هذه الخلايا داخل الرئة. وبالمثل، المقايسات الكيميائي يمكن أن يؤديها لدراسة إمكانية الخلايا على الاستجابة للعوامل الكيميائي في المختبر، ولكن هذه المقايسات لا تتكاثر في بيئة معقدة في الرئة سليمة. وعلى النقيض من هذه التقنيات المذكورة أعلاه، وموقع من أنواع الخلايا الفردية داخل الرئة يمكن تصور بسهولة عن طريق توليد خفض الدقة والرئة شرائح (PCLS)، تلطيخ لهم المتاحة تجاريا الأجسام المضادة، الموسومة fluorescently، وتصور المقاطع بواسطة المجهر متحد البؤر. PCLS يمكن أن تستخدم في كل من يعيش وأنسجة الرئة ثابتة، ويمكن للشرائح تشمل مناطق كبيرة مثل شريحة من الفص كامل. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لتصور بنجاح مكان وجود مجموعة واسعة من أنواع الخلايا في الرئة، بما في ذلك أنواع متميزة من الخلايا الجذعية، الضامة، العدلات، وخلايا T والخلايا B، وكذلك خلايا هيكلية مثل اللمفاوية، البطانية، و الخلايا الظهارية. القدرة على تصور التفاعلات الخلوية، مثل تلك التي بين الخلايا الجذعية وخلايا T، في العيش، وأنسجة الرئة ثلاثية الأبعاد، يمكن أن تكشف عن كيفية تحرك الخلايا داخل الرئة وتتفاعل مع بعضها البعض في حالة مستقرة وخلال الالتهاب. وهكذا، عندما تستخدم بالاقتران مع إجراءات أخرى، مثل التدفق الخلوي وPCR الكمي، PCLS يمكن أن تسهم في فهم شامل من الأحداث الخلوية التي تكمن وراء أمراض الحساسية والتهابات الرئة.
Introduction
عقب استنشاق من المحفزات الموالية للالتهابات مثل lipopolysaccharide في (LPS)، وهناك حركة منسقة من الخلايا المناعية إلى داخل، ومن الرئة. على سبيل المثال، يتم تجنيد العدلات بسرعة في لحمة الرئة والشعب الهوائية. وبالإضافة إلى ذلك، بعض مستضد الخلايا المهنية المعروفة باسم الخلايا الجذعية التقليدية (جان تنمية المجتمعات المحلية) تخضع لنمط الهجرة معقدة نسبيا 1 و 2. ويمكن تحديد جان تنمية المجتمعات المحلية باستخدام التدفق الخلوي، ومقرها في جزء منها على العرض الخاصة بها من علامة السطح، CD11c و. فرعية متميزة من البلدان النامية يمكن تمييزها عن طريق التعبير عن سطح التفاضلية للCD103 وCD11b 3. على الحصول على مستضد استنشاق بعض جان تنمية المجتمعات المحلية الخروج من الرئة وتهاجر من خلال الأوعية الليمفاوية إلى استنزاف الرئة الغدد الليمفاوية (LNS) حيث أنها تقدم الببتيدات لمستضد محددة الخلايا T 4. هذا حدث في وقت مبكر حاسما في بدء ص المناعة التكيفيةesponses. لأسباب غير معروفة، ولكن، ليس كل جان تنمية المجتمعات المحلية التي تحصل على مستضدات استنشاق ترك الرئة، وتبقى العديد من هذه الخلايا في هذا الجهاز لعدة أشهر 5، 6. هذه الملاحظة يمكن تفسيرها جزئيا من أصل التنموي من هذه الخلايا لالوحيدات المستمدة CD11c و+ خلايا تفتقر إلى مستقبلات chemokine، CCR7، غير قادرين على الهجرة إلى LNS الإقليمية 7 و 8. ويبدو من المرجح أن إمكانيات هجرة جان تنمية المجتمعات المحلية ويتحدد أيضا، على الأقل جزئيا، من خلال وضع تشريحي في غضون الرئة. ومع ذلك، لا تتميز بشكل كامل التعريب الدقيق لهذه مجموعات مختلفة من جان تنمية المجتمعات المحلية في الرئة. معرفة محسنة لتوطين الخلايا المناعية في الرئة، والجزيئات التي توجه إليها، وهناك حاجة لفهم أفضل لكيفية عمل نظام المناعة في الرئة يصبح تفعيلها.
PCLS يجري يتزايدتستخدم لاي كنهج خارج الحي لتصور المواقع الخلوية وخلية خلية التفاعلات، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية للبنية الرئة 9، 10. وقد استخدمت PCLS لدراسة الرئتين لكثير من الأنواع، بما في ذلك الفئران والأبقار والقرود والأغنام والخيول، والبشر (11). والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أن ما يقرب من 20 شرائح يمكن إعداد من الفص واحد من الرئة الماوس، مما يقلل من عدد الحيوانات اللازمة لإجراء التجارب الفردية. تقريبا جميع أنواع الخلايا المناعية، بما في ذلك البلدان النامية، الضامة، العدلات، والخلايا T، موجودة في PCLS والحفاظ على هياكلها العادية.
يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة PCLS إشارات الكالسيوم وانقباض الخلايا الهوائية والعضلات الملساء بعد العلاج مع أستيل 12 أو 13 ميثاكولين. في هذا النهج، سوى جزء صغير من الرئة هوalyzed مجهريا، ولكن ذكرت إحدى الدراسات أن قياسات انكماش الهوائية في PCLS تختلف حوالي 10٪ فقط من شريحة إلى شريحة، وهذه الفرق هي مماثلة لتلك التي شوهدت باستخدام اختبارات وظائف الرئة في الحيوانات سليمة 14. وقد استخدم باحثون آخرون PCLS كنهج خارج الحي لدراسة التغيرات في التعبير خلوى وسطح الخلية علامات بعد الحضانة مع LPS 15. كما استخدمت PCLS في نموذج المجراة سابقا من تضيق الأوعية الرئوية نقص الأوكسجين في الشرايين الصغيرة داخل عنيبية. تقع هذه السفن في جزء من الرئة التي لا يمكن الوصول إليها باستخدام إجراءات أخرى، بما في ذلك تسجيلات من شرائح الشريانية تشريح أو تحليل السفن تحت الجنبة 16. وقد استخدمت مختبرنا في المقام الأول PCLS لتصور توطين الخلايا المناعية في أنسجة الرئة يعيش في حالة مستقرة وبعد في الجسم الحي تحفيز التهابات. الإجراءات وضعنا لذلك هي على النحو التالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على إجراءات حيوانات التجارب وصفها في هذه الورقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات معهد علوم الصحة البيئية (IACUC).
1. إعداد الرئة
- الفئران منزل ما بين 6 و 12 أسابيع من العمر في ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض وفقا للمبادئ التوجيهية التي قدمتها لجان رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.
ملاحظة: يمكن تصوير الفئران أن يكون إما ساذجا، أو معاملة، اعتمادا على المصالح الخاصة لكل الباحث. هنا، نحن تصف توطين الخلايا المناعية في الفئران ساذجة وفي الفئران التي عولجت مع 100 ميكروغرام ألبومين البيض (OVA) و 0.1 ميكروغرام lipopolysaccharide في (LPS)، وذلك باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) كوسيلة في حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر. لغرس oropharyngeally OVA / LPS في الشعب الهوائية، وتخدير الحيوانات مع استنشاق الأيزوفلورين وعلقت عموديا أسنانهم مع الشريط المطاطي. وقد أدرك اللسان بلطف مع ملقط وعقد لجانب واحد لمنع البلع، و 50 & #181؛ L من الحل OVA / LPS المودعة في الجزء الخلفي من تجويف الفم كما هو موضح سابقا (17). - الموت ببطء الفأر مع حقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم (100 ملغ / كلغ)، ويعلقون الحيوان إلى قاعدة البوليسترين.
- فتح تجويف البطن مع مقص عن طريق قطع الجلد والغشاء البريتوني من منتصف البطن حتى الفك. سحب الأمعاء جانبا مع ملقط أو حافة مملة من مقص، وقص الوريد الأجوف السفلي لاستنزاف الدم بعيدا عن الرئتين. ثقب الحجاب الحاجز مع طرف حاد من مقص للسماح توسيع القفص الصدري، والحرص على عدم قطع الرئتين.
- الغدد اللعابية واضحة وغيرها من الأنسجة بعيدا عن القصبة الهوائية عن طريق الاستيلاء على الأنسجة وجرها بعيدا عن القصبة الهوائية الأساسية مع ملقط يدويا. إجراء شق صغير في القصبة الهوائية على الجانب الأمامي من سمكا عصابة من الغضروف باستخدام ملقط غرامة أو مقص، والحرص على عدم قطع كل وسيلة على الرغم من أن هيئة تنظيم الاتصالاتشيا. فإن شق تكون كبيرة بما يكفي للسماح للإبرة 20 G بالمرور.
- الشريحة 1.5 بوصة، و 20 G إبرة على قسم من أنابيب البولي ايثيلين، وترك حوالي 1 سم من الأنابيب بعد نهاية الإبرة. قطع الأنابيب في زاوية ما يقرب من 45 درجة إلى شطبة النهاية، إرفاق الإبرة إلى حقنة 1 مل، وتحميل حقنة عن طريق رسم 0.8 مل من الحارة (40 درجة مئوية) 2٪ نقطة انصهار منخفضة الاغاروز حتى من خلال إبرة.
- ضع نهاية الأنبوب في شق القصبة الهوائية وحقن ببطء الاغاروز إلى الرئتين. دون تحريك إبرة أو حقنة، الشريط المحقنة إلى قاعدة البوليسترين لضمان تبقى الإبرة في القصبة الهوائية.
ملاحظة: بعد الحقن، والرئتين تكون أكبر وتضخم في الصدر. الفص الأيمن توسيع أولا، ثم الفص الأيسر. إذا توسع فص واحد فقط، وقد تم إدخال الإبرة بعمق (الماضي القصبات الهوائية)، وسيكون من الضروري أن تخلعها قليلا قبل المتابعة. هذا الجزء منيحتاج الإجراء الذي يتعين القيام به بسرعة نسبيا، قبل أن يبدأ الاغاروز لترسيخ. - ضع الماوس، مع قاعدة والمحاقن لا يزال إدراجها في القصبة الهوائية، في غرفة باردة أو الثلاجة لمدة 10 دقيقة على الأقل. إذا لزم الأمر، والحيوان يمكن أن تبقى هناك لمدة تصل إلى عدة ساعات، حتى لو الشروع في الهجرة الخلية الصورة بواسطة المجهر الفيديو.
- وبمجرد أن الفأر هو بارد، استئصال بعناية الرئتين في تضخيم الاغاروز باستخدام مقص، ووضعها في طبق 3 سم مع الجليد PBS الباردة. الحفاظ على الجليد.
- اختيار الفص المطلوب للتشريح الأنسجة (على سبيل المثال، والحق الفص العلوي). تأكد من أن الجزء الداخلي من الرئة (حيث يصل إلى القصبة الهوائية) وجهه لأسفل في الطبق.
ملاحظة: الفص استخدامها وسوف توجهها على المكبس تحديد حجم السفن والخطوط الجوية التي من شأنها أن تكون واضحة. التوجه هو موضح هنا مثالية لرؤية الخطوط الجوية الكبيرة، وحمة. الفئران لها واحد الفص الأيسر كبير وأربعة فصوص صغيرة على اليمين. إلى عن علىالتصوير PCLS بعد إدخال المواد المسببة للحساسية في الرئتين عبر فموي بلعومي أو طموح الأنف، هو مقطوع عادة الفص العلوي الأيمن، في جزء منه لأنه هو حجم مناسب، ولكن أيضا بسبب عوامل استنشاق تفريق موحد داخلها. ومع ذلك، فصوص الأخرى، وخاصة الفص الأيسر، ويمكن أيضا أن تدرس. عند المقارنة بين سلالات الماوس أو العلاج، من المهم أن يقارن نفسه الفص.
2. الرئة التقطيع
ملاحظة: تأكد شرائح باستخدام تقطيع الآلي، والمعادن تبريد كتلة، الغواص والمحاقن المعدنية، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- وضع قطرة صغيرة من جميع الأغراض، لا تديرها هلام superglue على المكبس ونشر الغراء في حركة دائرية، مع الحرص على عدم السماح للالغراء تلمس الجانبين من الحقنة المعدنية. إذا الغراء اللمسات الجانبين من الحقنة، وسوف الغراء حقنة والغطاس معا.
- فورا بعد تغطية الغطاس مع الغراء، فهم بلطفالفص رفعه مع ملقط مع الجانب القصبة الهوائية أسفل، ربت على منديل ورقي لإزالة السائل الزائد، وبعناية وضعه على رأس المكبس. تقليم قبالة أي نوع من الأنسجة إضافية تتجاوز حافة المكبس.
- تحرك المكبس إلى أسفل بحيث الجانبين من الحقنة المعدنية تتحرك صعودا وأكثر من الأنسجة، وخلق تماما مع الرئة لصقها في الجزء السفلي، أي أكثر من عدة سنتيمترات عميقة. الشريط حول الجزء السفلي من حقنة معدنية لعقد هذا الموقف في المكان.
- بعناية صب 2٪ منخفضة ذوبان الاغاروز في 40 ° C في البئر بحيث أنها تغطي فقط الجزء العلوي من الفص.
- تحيط حقنة معدنية مع كتلة تقشعر لها الأبدان الجليد الباردة وتبريد الفص والاغاروز 1 - 2 دقيقة.
ملاحظة: التبريد وقت أقصر من الاغاروز المحيطة الأنسجة يمكن أن يؤدي إلى تفكك الاغاروز تشريح، والتي قد تؤدي إلى خفض PCLS بشكل غير متساو خلال. - تحميل حقنة العينة في تقطيع اللحم الآلي وملء خزان العازلة مع الجليد الباردة PBS. محاذاة خطوة محرك السيارات مع حقنة العينة وإزالة قطعة من الشريط من الجزء السفلي. بدوره التحول إلى موقف سريع إلى الأمام (FF) حتى محرك السيارات الخطوة مجرد تلامس الجزء الخلفي من المكبس.
- محاذاة شفرة جديدة مع حقنة العينة. مجموعة سمك الأنسجة، المستمر / شريحة واحدة، التذبذب والسرعة في تقطيع اللحم. على سبيل المثال، سمك الأنسجة: 150 ميكرون، القطع المستمر (تابع)، التذبذب: 9، وسرعة: 3 - بداية 4. برس. يجب أن يتم تعديلها للمواصفات تقطيع الآلية المحددة الإعدادات أعلاه.
- باستخدام ملعقة رقيقة أو الفرشاة، وجمع PCLS في وقت واحد حيث أنها تقع في خزان العازلة ووضعها في لوحة 24-جيدا تحتوي على الجليد الباردة PBS.
ملاحظة: من المهم للحفاظ على شرائح من أجل الحفاظ على التناسق بين التجارب. على الرغم من كل الرئة تختلف حسب العمر والجنس والوزن، وشريحة ال 10، على سبيل المثال، عادة ينتج الحجم بالمثل الهوائية.
- تصميم لوحة من الأجسام المضادة الموسومة fluorescently استنادا إلى نوع من الخلايا في المصالح، مع الأخذ بعين الاعتبار احتمال التداخل الطيفي الفلورسنت وقدرات الكشف المجهر.
ملاحظة: وكمثال على ذلك، لجنة للكشف فرعية DC هي على النحو التالي: CD11c و/ ألفا X إنتغرين - BrilliantViolet (BV) 605 (الإثارة: 405 نانومتر، ذروة الانبعاثات: 605 نانومتر)، CD324 / E-كادهيرين - اليكسا 488 (AF488 ) (الإثارة: 488 نانومتر، والانبعاثات الذروة: 519 نانومتر)، CD88 / C5Ra1 - فيكوإيريترين (PE) (الإثارة: 561 نانومتر، والانبعاثات الذروة: 578 نانومتر)، CD103 / ألفا E إنتغرين - Allophycocyanin (APC) (الإثارة: 633 نانومتر ، والانبعاثات الذروة: 660 نانومتر). مضان أدوات المشاهد الطيفية (انظر قائمة المواد) هي مفيدة لتصميم اللوحات. - تقديم كوكتيل الأجسام المضادة التي تحتوي على الأجسام المضادة المطلوبة.
- للتصوير PCLS ثابت، إضافة 800 ميكرولتر عازلة تلطيخ، و 100 ميكرولتر فك بلوكر، 50 ميكرولتر مصل الفأر العادي، و 50 ميكرولتر العادي الفئران المصل إلى 1.5 مل microcentrifuأنبوب gation لإجمالي حجم 1 مل. لتصوير الخلايا الحية، استخدم 800 ميكرولتر المتوسطة يبوفيتش (1X) تحتوي على 10٪ FBS (يبوفيتش 10) بدلا من العازلة تلطيخ.
- إضافة أجسام مضادة لضبط التركيز النهائي المطلوب من كل الأجسام المضادة. نقل الحل الضد إلى طبق 3 سم، ونضع في الظلام حتى جاهزة للاستخدام.
ملاحظة: تركيزات النهائي في حاجة إلى أن يكون الأمثل لكل الأجسام المضادة الفردية (عادة 1-5 ميكروغرام / مل).
- اختيار PCLS بمساحة التشريحية للاهتمام، مثل الخطوط الجوية الكبيرة أو محيط الرئة، ووضع في طبق 3 سم، ويحتوي على 1 مل من محلول الأجسام المضادة.
- PCLS وصمة عار في الظلام، على الجليد، هزاز ببطء لمدة 30 أو 60 دقيقة.
- للتصوير PCLS ثابت، انتقل إلى القسم 4. لتصوير الخلايا الحية، انتقل إلى القسم 5.
4. ساكنة التصوير من PCLS
- بعد 60 دقيقة حضانة PCLS مع الأجسام المضادة، وإزالة حل الأجسام المضادة من الطبق وشطف ركان شرائح مرتين مع 1 مل الجليد PBS الباردة.
- ماصة 50 ميكرولتر PBS على 3 سم جولة طبق من الزجاج السفلي. باستخدام ملعقة أو الفرشاة، ونقل PCLS الملون إلى الانخفاض، والتلاعب بلطف شريحة حتى أنها مسطحة، وانتشرت. إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة. شريحة يجب الاستلقاء قدر الإمكان. تحتاج إلى أن يؤديها بسرعة لتجنب photobleaching من الإجراءات المذكورة أعلاه.
- وضع 1 قطرة من درجة حرارة الغرفة المتوسطة المتزايدة على شريحة وإسقاط بلطف ساترة الزجاج في بئر من لوحة. الحفاظ PCLS في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ساعة قبل التصوير.
- عند عرض تحت المجهر متحد البؤر، واستخدام الهدف 20X (انظر قائمة المواد). استخدام أداة "بلاط" لتحديد مكان وبمناسبة حواف النسيج في الإعداد "بدن محدب". هذا وسوف تساعد على تقليل وقت الفحص البلاط.
- أثناء إعداد مجموعة ض المكدس، تحقق في مجالات متعددة من شريحة، وخصوصا على طول الحواف، أن نطاقات مجموعةهي مناسبة.
ملاحظة: إن المدى ض المرجح أن تحتاج إلى أن تكون أكبر من سمك الأنسجة نفسها لأنه من الصعب جدا الحصول على الأنسجة لوضع مسطح تماما. على سبيل المثال، مع PCLS سميكة 150 ميكرون، وسوف تحتاج مجموعة ض المكدس المرجح أن يتم تعيين إلى 200-250 ميكرون لاستيعاب المطبات والمنحنيات في شريحة. اعتمادا على مجموعة ض المكدس وحجم الأنسجة، وكل فحص الرئة الكامل يستغرق ما بين 7-12 ساعة مع هدف 20X. كل الرئة هي فريدة من نوعها ويجب تعديلها إعدادات كل تجربة.
5. يعيش التصوير خلية من PCLS
- بعد 30 دقيقة حضانة PCLS مع الأجسام المضادة، وإزالة حل الأجسام المضادة من الطبق وشطف شرائح مرتين مع 1 مل الباردة يبوفيتش 10.
- ماصة الطازجة 50 ميكرولتر يبوفيتش 10 إلى فتحة واحدة من ساترة غرف (8 فتحات). استخدام ملعقة لنقل PCLS إلى المتوسطة، والتلاعب برفق حتى شريحة مسطحة، وانتشرت. الإجراءات المذكورة أعلاهتحتاج إلى أن يؤديها بسرعة لتجنب photobleaching من.
- إزالة المتوسطة 50 ميكرولتر باستخدام ماصة. شريحة وأن الاستلقاء قدر الإمكان.
ملاحظة: فمن المقبول إذا انقلبت حواف شريحة عموديا على جدار الغرفة. وعلاوة على ذلك، إن وجدت، على وزن البلاتين معدن يمكن أن تستخدم لترسيخ شريحة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. انظر قائمة المواد المرفقة لمثال واحد من سلك البلاتين التي يمكن قص وعازمة في الأوزان الصغيرة. - في 4 ° C الغرفة الباردة، مزيج 100 ميكرولتر من النمو انخفاض عامل، الفينول مجانا الحمراء المصفوفة خارج الخلية مع 100 ميكرولتر يبوفيتش 10. استخدام نصائح ماصة precooled لهذا، أو أن المصفوفة خارج الخلية يصلب في الطرف.
ملاحظة: هذه النسبة من المصفوفة والمتوسطة (1: 1) بإنشاء هلام كثيفة بما فيه الكفاية لعقد PCLS أسفل في ظروف الأنسجة الثقافة. - ماصة بلطف مصفوفة لخلط، وماصة بعناية على رأس PCLS، والتأكد من أن الجل يذهب على رأس لونانوغرام شريحة، وأن شريحة لا تطفو على أعلى من هلام. هلام يجب أن تعمل بمثابة الوزن، وترسيخ PCLS أسفل على الجزء السفلي من لوحة.
- نقل بعناية ساترة غرف ل37 ° C حاضنة والسماح للمصفوفة ترسيخ ب ~ 5 دقائق.
- نقل ساترة تشامبيريد كامل على مرحلة ما قبل تحسنت المجهر متحد البؤر. الحفاظ على غرفة في 37 ° C طوال التصوير. ليس مطلوبا CO 2 العرض خلال حضانة الخلية عند استخدام المتوسطة يبوفيتش.
- تعيين نطاق مجموعة ض المكدس والبلاط واستنادا إلى الفاصل الزمني المطلوب بين الإطارات. عند عرض تحت المجهر متحد البؤر، واستخدام الهدف 20X (انظر قائمة المواد). استخدام أداة "البلاط" للدلالة على المنطقة من الاهتمام في الأنسجة، وذلك باستخدام "شبكة محورها" إعداد (على سبيل المثال، وهو 2X2 تركز الشبكة).
- أثناء إعداد مجموعة ض المكدس، تحقق في مجالات متعددة من شريحة التي يتراوح مجموعة مناسبة.
ملاحظة: ZRوانجى على الأرجح يساوي سمك الأنسجة. كل الرئة هي فريدة من نوعها ويجب تعديلها إعدادات كل تجربة. والبلاط 2X2 و 10 مداخن ض ينتج بصفة عامة ~ 1 إطار / 2 دقيقة. تأكد من تشغيل وظيفة التركيز التلقائي قبل بدء التجربة للحد س ص و z العائمة خلال فترة التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحديد الموقع من مجموعتين فرعيتين DC، CD11b جان تنمية المجتمعات المحلية مرحبا وCD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية، PCLS من C57BL / 6 الفئران قطعت وملطخة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS) محددة لCD11c و، CD88، CD103، وCD324 (E-كادهيرين). يتم عرض الأجسام المضادة للخلايا الظهارية CD324 صمة عار مجرى الهواء، وCD88 على الضامة والعدلات، ولكن ليس جان تنمية المجتمعات المحلية 8. وهذا ما سمح لنا أن نميز جان تنمية المجتمعات المحلية من CD11c و+ الضامة، ومراقبة العلاقة المكانية من كل نوع من الخلايا في الشعب الهوائية (الشكل 1). وجدنا أن CD11b جان تنمية المجتمعات المحلية مرحبا توطين في لحمة، في حين CD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية يقيمون أساسا حول الشعب الهوائية ومنطقة تحت الجنبة. وعلى الرغم من CD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية تم الكشف بسهولة عن طريق تلطيخ المباشر للCD103 سطح الخلية في هذه التجربة، والكشف عن CD11b مرحبا اعتمد جان تنمية المجتمعات المحلية على عدم وجود CD88 وتلطيخ CD103. للتعرف مباشرة CD11bمرحبا جان تنمية المجتمعات المحلية، حاولنا أولا أن PCLS وصمة عار باستخدام-CD11b مكافحة ماب (استنساخ M1 / 70)، والذي يستخدم على نطاق واسع في المناعية والتدفق الخلوي. ومع ذلك، كان هذا ماب خلفية ارتفاع وانخفاض خصوصية في هذا التطبيق، بغض النظر عن التي تم مترافق fluorochromes إلى ماب (الشكل 2A، ولا تظهر البيانات). على النقيض من ذلك، والأجسام المضادة لCD172a (SIRP1α) ملطخة CD11b مرحبا جان تنمية المجتمعات المحلية 18، ولكن الخلايا لا الهيكلية أو CD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية (الشكل 2B، ولا تظهر البيانات). من تلقاء نفسها، يمكن أن الأجسام المضادة لCD172a لا تميز بين جان تنمية المجتمعات المحلية وحيدات أو الضامة. ومع ذلك، عن طريق المشاركة في تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد CD88 و CD172a، كنا قادرين على التمييز الضامة السنخية (CD172a - CD88 +) من الضامة الخلالية (CD172a + CD88 +)، وCD11b مرحبا جان تنمية المجتمعات المحلية (CD172a + CD88 -)، وتبين أن الخلايا الأخيرة توطين تفضيلي فيحمة، وليس منطقة دون الظهارية (الشكل 2C - F)، وذلك بالاتفاق مع نتائجنا التي تم الحصول عليها عن طريق تلطيخ غير المباشر لهذه الخلايا.
دراسة الهجرة داخل الأنسجة من الكريات البيض تتطلب التصور الخلايا الهيكلية، بما فيها الأوعية اللمفاوية، التي من خلالها حركة المرور البلدان النامية من الأنسجة الطرفية إلى LNS الإقليمية. في الجلد وLNS، وغالبا ما يتم تحديد الأوعية اللمفاوية باستخدام MABS إلى LYVE-1 أو Podoplanin. ومع ذلك، وجدنا أن في PCLS، MABS إلى LYVE-1 وPodoplanin وصمة عار مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك بطانة الأوعية الدموية وظهارة السنخية (لا تظهر البيانات). لذا من الاستخدام العملي محدود هذه MABS هي لتحديد على وجه التحديد الأوعية اللمفاوية في PCLS. ومع ذلك، MABS إلى CD90.2 (Thy1.2)، وهي معروفة علامة الخلية T، الهياكل اللمفاوية المسمى، كما هو موضح سابقا في الأنسجة الأخرى 19، 20 (أرقام 3A، B Prox1 21 (الشكل 3A، C). PROX1 هو عامل النسخ الرئيسي الذي هو ضروري لlymphangiogenesis 22. Prox1 TdTomato الفئران المعدلة وراثيا يحمل الأوعية اللمفاوية الفلورسنت الزاهية في الرئتين والأنسجة الأخرى مثل الكبد، عدسة، التلفيف المسنن والغدد الصم العصبية خلايا النخاع الكظرية 21. في الواقع، أعطت هذه الطرق وضع العلامات نمطين تلطيخ متداخلة (الشكل 3D). باستخدام هذه الطرق وضع العلامات، وتمكنا من تحديد أن CD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية كانوا موجودين في عدة مناطق تشريحية، بما في ذلك CD324، معربا عن ظهارة الهوائية والأوعية اللمفاوية، ومنطقة تحت الجنبة (الشكل 3A، E).
بالإضافة إلى التصوير ثابت، حركة الخلية والخلية إلى سليمكن تسجيل التفاعلات لتر باستخدام التصوير الخلية الحية من PCLS (فيلم 1). أعدت PCLS حديثا من الفئران التي تلقت حقن الخلايا OT-II T، معربا عن GFP وتقطير من OVA وLPS، ملطخة MABS ضد CD103 (الحمراء)، وظهارة الهوائية (CD324 والأزرق)، وتم تصوير لتعقب حركة الخلايا CD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية وT 16 ساعة بعد OVA / LPS تقطير. وعلى مدار الفيديو (4 ساعات)، والحركة الديناميكية للCD103 + البلدان النامية (أحمر) ونقل adoptively خلايا T-OVA معين (الأخضر) وتفاعلها هي واضحة للعيان (فيلم 1).
الشكل 1. المواقع التشريحية متميزة من مركز السيطرة على الأمراض مجموعات فرعية كما كشفت عنها PCLS تلطيخ ومتحد البؤر المجهري. A) PCLS كامل من دون علاج C57BL / 6 الرئة الماوس ملطخة مختلف الأجسام المضادة. لون يشار كل جزيء من لون الخط في (أعلى اليمين). تلطيخ الفردي واندماجي يعطي الألوان التالية لأنواع الخلايا في المصالح: CD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية (CD103 + CD11c و+ CD88 -، البيضاء)، CD11b مرحبا جان تنمية المجتمعات المحلية (CD11c و+ CD103 - CD88 -، أحمر)، الضامة (CD11c و+ CD88 +، أصفر )، العدلات (CD11c و- CD88 +، الخضراء) والخلايا الظهارية مجرى الهواء (CD324 +، الأزرق). B - D) التكبير العالي للإدراجات في A. B) CD11b جان تنمية المجتمعات المحلية مرحبا توطين في لحمة. C) CD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية في جميع أنحاء الهوائية. D) CD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية تحت غشاء الجنب الحشوي. أشرطة بيضاء تدل 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تلطيخ من البلدان النامية والضامة. A) تلون PCLS مع الأجسام المضادة لCD11b (الأزرق) يعطي خلفية عالية في PCLS. B) الأجسام المضادة لCD172a (الأخضر) لديهم خلفية منخفضة نسبيا في PCLS وزيادة خصوصية لCD11b خلايا +. C) PCLS كامل من C57BL / 6 الفئران ملطخة MABS الذي دل عليه لون الخط (أعلى اليمين) لون. CD11c و(الحمراء)، CD88 (السماوي)، CD172a (الخضراء) وCD324 (الأزرق). CD11b جان تنمية المجتمعات المحلية مرحبا (CD11c و+ CD88 - CD172a +، الأصفر)، الضامة السنخية (CD11c و+ CD88 + CD172a -، وردي)، الضامة الخلالية (CD11c و+ CD88 + CD172a +، أبيض)، العدلات (CD11c و- CD88 +. السماوي) و الهوائية (CD324 +، الأزرق). D - F) التكبير العالي للإدراجاتيصور في C. D) منطقة الجنبي الفرعية. E) شبه الظهارية المنطقة. F) الخلالي. الضامة الخلالية توطين في لحمة، والبلاعم السنخية هي في الحويصلات الهوائية. أشرطة بيضاء غير المسماة دلالة 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. وضع البطاقات التعريفية على خلايا الهيكلية في PCLS. A) PCLS كامل أعدت من Prox1 tdTomato الماوس، وملطخة MABS إلى CD90.2 (الأخضر)، CD103 (أبيض) وCD324 (الأزرق). خلايا، معربا عن Prox1 (الحمراء) وصفت وراثيا مع TdTomato تحت تنظيم المروج Prox1 (Prox1-TdTomato). B - E) التكبير العالي للأقحم في
الفيلم 1. T خلايا تتفاعل مع CD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية في الرئة. تصوير الخلايا الحية من CD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية (الحمراء) التي تتفاعل مع خلايا T (الخضراء). وقد حفز CD4 + T الخلايا المعزولة من الفئران OVA محددة GFP OT-II Nur77 مع البلدان النامية الطحال وOVA في المختبر، ونقل adoptively إلى خرقة - / - الماوس. في وقت لاحق 2 ساعة، والتعامل مع الماوس المتلقي الطرافةح OVA / LPS تقطير لمجرى الهواء. 16 ساعة بعد العلاج OVA / LPS، أدلى PCLS، ملطخة وتصوير لمدة 4 ساعات في 37 ° C. ويظهر تسجيل صورة (دقيقة) وقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تطوير هذا البروتوكول هو موضح هنا أصلا لتصور مواقع اثنين من مجموعات فرعية من جان تنمية المجتمعات المحلية داخل الرئة. ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لدراسة العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، مع الحفاظ على سلامة الخلية والهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد في الرئة. الميزة الأخيرة هي ميزة هامة على أنظمة زراعة الخلايا ويسهل التعرف على أنواع الخلايا نادرة. ويعتمد هذا الأسلوب على توليد PCLS من الرئة، وتوليفة مناسبة من الأجسام المضادة للتعرف على أنواع معينة من الخلايا وتقليل تلوين الخلفية. إلى حد كبير، وهذا هو ممارسة التجريبية لأن الأجسام المضادة التي تعمل بشكل جيد في تطبيقات أخرى، بما في ذلك التدفق الخلوي، لا تعمل بالضرورة جيدا لتلطيخ PCLS. لقد حققنا بالفعل تقدما كبيرا في هذا الصدد، ولكن المحققين الذين يرغبون في دراسة أنواع الخلايا لم تعالج هنا قد تضطر إلى اختبار الأجسام المضادة المختلفة وتحسين fluorochromes وتركيزات. باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا، وجدنا أن CD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية وCD11b جان تنمية المجتمعات المحلية مرحبا يقيم في تعريب متميزة في الرئة. في حالة مستقرة، تم الكشف عن CD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية في جميع أنحاء الهوائية وفي المنطقة تحت الجنبة، في حين تم العثور على CD11b جان تنمية المجتمعات المحلية مرحبا في المقام الأول في لحمة. على الرغم من أن البروتوكول وصفنا هنا ليست مناسبة للتلطيخ الجزيئات داخل الخلايا، فإنه من المفيد للعلامات سطح الخلية والتصوير، وكذلك جزيئات إفرازية. وهكذا، تمكنا من كشف كيموكينات، CCL21 وCCL19، في PCLS (لا تظهر البيانات). إذا رأينا إشارات الفلورسنت ضعيفة فقط باستخدام الأجسام المضادة الأولية، فإنه من الممكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية لتضخيم تلك الإشارات.
وكان تحديا كبيرا عند إجراء الحية خلية الفيديو تصوير PCLS لترسيخ بما فيه الكفاية الأنسجة في مستنبت لمنع xy- كبيرة و z العائمة خلال فترة الفحص المجهري 4-ساعة. ولمعالجة ذلك، نحن جربتمع نسب مختلفة من المتوسطة يبوفيتش إلى المصفوفة خارج الخلية، وهي مادة صلبة في درجة حرارة الغرفة، وتحدد 1: حافظت نسبة 1 مستقر، هيكل 3D مع بقاء الخلية. أثناء معالجة مرحلة ما بعد الصورة، ونحن أيضا استخدام سلسلة من يماغيج المكونات الإضافية، ودعا TurboReg وStackReg التي تقضي على أي س ص عرضية أو ض تحول إضافي (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx؟ معرف = 18226). باستخدام أداة الضبط التلقائي للبؤرة المجهر متحد البؤر، أبقى المنطقة من اهتمام في التركيز، خصوصا في Z المدى، خلال فترة المسح بأكملها. وهناك تحد آخر أثناء تصوير الخلايا الحية من PCLS تم الاستفادة من مسح البلاط، ض المكدس، السلاسل الزمنية، ومهام ضبط تلقائي للصورة المجهر. لتقليل الوقت بين كل إطار، لا بد من إيجاد توازن بين الوقت الذي يقضيه مسح كل البلاط. لتحسين وقت الفحص في كل مشروع بحثي، عدد ض المكدس، والبلاط، وسرعات المسح تحتاج إلى تعديل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح إلى إعلان.
Acknowledgments
نشكر جيف تاكر، إريكا سكابيني، وأغنس جانوشازي لمساعدتهم مع المجهر، ليغون بيرو لإدارة لها من مستعمرة الماوس، وجون تشن ومايكل ساندرسون للمساعدة في تقطيع اللحم والأنسجة، ومايكل فيسلر وديريك كين لقراءة نقدية لل المخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل فرع جماعية من معهد علوم الصحة البيئية، NIH (ضياء ES102025-09)، والذي بدوره برعاية وزارة الصحة والخدمات الإنسانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
