Summary
Vi beskriver en fremgangsmåde til frembringelse Precision-cut Lung Skiver (PCLS) og immunfarvning dem at visualisere lokaliseringen af forskellige immun celletyper i lungen. Vores protokol kan udvides til at visualisere placeringen og funktionen af mange forskellige celletyper under en række betingelser.
Abstract
Inhalation af allergener og patogener fremkalder flere ændringer i en række forskellige immuncelletyper i lungen. Flowcytometri er en kraftfuld teknik til kvantitativ analyse af celleoverfladeproteiner på immunceller, men det giver ingen oplysninger om de lokaliserings- og trækmønstre disse celler i lungen. Tilsvarende kan kemotaksiassays udføres for at undersøge mulighederne for celler til at reagere på kemotaktiske faktorer in vitro, men disse assays ikke reproducere det komplekse miljø af det intakte lunge. I modsætning til disse førnævnte teknikker, kan placeringen af individuelle celletyper i lungen let visualiseres ved generering Precision-cut Lung Skiver (PCLS), farvning dem med kommercielt tilgængelige, fluorescerende mærkede antistoffer, og visualisere sektionerne ved konfokal mikroskopi. PCLS kan anvendes til både levende og lungevæv faste, og skiverne kan omfatte områder som stort som et tværsnit af en hel lap. Vi har anvendt denne protokol til succes visualisere placeringen af en lang række forskellige celletyper i lungen, herunder forskellige former for dendritiske celler, makrofager, neutrofile, T-celler og B-celler, såvel som strukturelle celler, såsom lymfe, endotel- og epitelceller. Evnen til at visualisere cellulære interaktioner, såsom dem mellem dendritiske celler og T-celler, i levende, tredimensional lungevæv, kan afsløre, hvordan celler bevæge sig inden i lungen og interagere med hinanden ved steady state og under inflammation. Således, når de anvendes i kombination med andre fremgangsmåder, såsom flowcytometri og kvantitativ PCR, kan PCLS bidrage til en omfattende forståelse af cellulære begivenheder, der ligger til grund for allergiske og inflammatoriske sygdomme i lungerne.
Introduction
Efter inhalation af proinflammatoriske stimuli såsom lipopolysaccharid (LPS), der er en koordineret bevægelse af immunceller til, i og fra lungerne. For eksempel er neutrofile hurtigt rekrutteret til lungeparenkymet og luftveje. Desuden nogle professionelle antigenpræsenterende celler kendt som konventionelle dendritceller (CDCS) undergå en forholdsvis kompliceret migrationsmønster 1, 2. CDCS kan identificeres under anvendelse af flowcytometri, delvist baseret på deres visning af overfladen markering, CD11. Distinct undergrupper af DC'er kan skelnes ved den differentielle overfladeekspression af CD103 og CD11b 3. Ved at erhverve inhaleret antigen, nogle CDCS forlade lunge og migrerer gennem lymfekarrene til lunge-drænende lymfeknuder (LN), hvor de præsenterer peptider for antigen-specifikke T-celler 4. Dette er et kritisk tidlig begivenhed i indledningen af adaptive immun responses. Af ukendte årsager, dog ikke alle CDCS der erhverver inhalerede antigener forlader lungerne, og mange af disse celler forbliver i dette organ i flere måneder 5, 6. Denne observation kan delvis forklares ved den udviklingsmæssige herkomst af disse celler, fordi monocyt-afledte CD11c + celler, der mangler kemokinreceptoren, CCR7, ikke er i stand til at migrere til regionale LN 7, 8. Det forekommer sandsynligt, at migrationen potentiale CDCS også bestemmes, i det mindste delvis af deres anatomiske position i lungen. Imidlertid er den præcise lokalisering af disse forskellige populationer af CDCS i lungen ikke fuldt karakteriseret. En forbedret kendskab til immun celle lokalisering i lungen, og af de molekyler, der dirigerer det, der er behov for en bedre forståelse af, hvordan immunsystemet i lungerne bliver aktiveret.
PCLS er ved at blive øgetly anvendes som en ex vivo fremgangsmåde til at visualisere cellulær positionering og celle-celle-interaktioner, samtidig med at den strukturelle integritet af lungen arkitektur 9, 10. PCLS er blevet brugt til at studere lunger mange arter, herunder mus, kvæg, aber, får, heste og mennesker 11. En stor fordel ved denne teknik er, at ca. 20 skiver kan fremstilles ud fra en enkelt lap af et muselunge, hvorved antallet af dyr, der er nødvendige for individuelle eksperimenter. Stort set alle immuncelletyper, herunder DC'er, makrofager, neutrofiler og T-celler, er til stede i PCLS og opretholde deres normale strukturer.
PCLS kan også anvendes til at studere calciumsignalering og kontraktilitet af luftvejs og glatte muskelceller efter behandling med acetylcholin 12 eller methacholin 13. I denne fremgangsmåde kun en lille del af lungen er enalyzed mikroskopisk, men en undersøgelse rapporterede, at målinger af luftvejs sammentrækning i PCLS varierer kun ca. 10% fra skive til skive, og denne varians er sammenlignelig med den set ved anvendelse lungefunktionsundersøgelse i intakte dyr 14. Andre forskere har anvendt PCLS som en ex vivo fremgangsmåde til at studere ændringer i cytokinekspression og celleoverflademarkører efter inkubation med LPS 15. PCLS har også været anvendt i en ex vivo model for hypoksisk pulmonal vasokonstriktion i små intra-acinære arterier. Disse skibe er placeret i den del af lungen, som ikke kan opnås ved hjælp af andre procedurer, herunder optagelser fra dissekerede arterielle segmenter eller analyse af subpleurale fartøjer 16. Vores laboratorium har primært anvendt PCLS at visualisere immuncelle lokalisering i levende lungevæv ved steady state efter en in vivo inflammatoriske stimulus. De procedurer, vi har udviklet til dette er som følger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal eksperimentelle procedurer, der er beskrevet i dette papir blev godkendt af NIEHS Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1. Lung Fremstilling
- Hus mus mellem 6 og 12 ugers alderen i specifikke patogenfrie betingelser i overensstemmelse med de retningslinjer, som Institutional Animal Care og brug Udvalg.
BEMÆRK: afbildet mus kan enten være naive, eller behandles, afhængigt af den enkelte forskers særlige interesser. Her beskriver vi immuncelle lokalisering i naive mus og i mus behandlet med 100 ug ovalbumin (OVA) og 0,1 ug lipopolysaccharid (LPS), under anvendelse af phosphatbufret saltvand (PBS) som et køretøj i et totalt volumen på 50 pi. Til oropharyngeally indgyde OVA / LPS i luftvejene blev dyrene bedøvet med isofluran inhalering og ophængt lodret ved deres tænder med en elastik. Tungen blev forsigtigt gribes med pincet og holdt til den ene side for at forhindre synkning og 50 & #181; L af OVA / LPS opløsning deponeret på bagsiden af mundhulen som tidligere beskrevet 17. - Aflive musen med intraperitoneal injektion af natriumpentobarbital (100 mg / kg), og pin dyret til en polystyren base.
- Åbn bughulen med en saks ved at skære i huden og bughinden fra midten af maven op til kæben. Træk tarmene til side med pincet eller den matte kant af saksen, og klippe den nedre vena cava at dræne blodet væk fra lungerne. Punktere membranen med den skarpe spids af saksen for at tillade udvidelse af brystkassen, er omhyggelig med ikke at skære i lungerne.
- Klare spytkirtler og andet væv væk fra luftrøret ved at gribe fat i vævet og manuelt trække det væk fra det underliggende luftrøret med pincet. Lav et lille snit i luftrøret på den forreste side af den tykkeste bånd af brusk ved hjælp fine pincet eller saks, og pas på ikke at skære hele vejen selvom traChea. Snittet vil være lige stor nok til at tillade en 20 G nål til at passere igennem.
- Glide et 1,5 inch, 20 G nål på en sektion af polyethylenrør, hvorefter ca. 1 cm af rør forbi enden af nålen. Skær slangen i en vinkel på ca. 45 ° til affase enden, sæt kanylen til en 1 ml sprøjte, og indlæse sprøjten ved at trække 0,8 ml varm (40 ° C) 2% agarose med lavt smeltepunkt op gennem nålen.
- Anbring enden af slangen ind i indsnit i luftrøret og langsomt injicere agarose i lungerne. Uden at flytte nålen eller sprøjte, tape sprøjten til polystyren base at sikre nålen forbliver i luftrøret.
BEMÆRK: Efter injektion, vil lungerne være større og oppustet i brystet. De rigtige lapper udvider først, derefter den venstre lap. Hvis kun en lap udvider sig, er nålen er indsat for dybt (forbi bronkier), og det vil være nødvendigt at trække det lidt ud, før du fortsætter. Denne del afprocedure skal gøres relativt hurtigt, før agarosen begynder at størkne. - Placer musen, med basen og sprøjten stadig sidder i luftrøret, i et koldt rum eller køleskab i mindst 10 min. Hvis det er nødvendigt, kan dyret holdes der i op til flere timer, selv om du fortsætter til billedet cellemigration ved hjælp af video mikroskopi.
- Når musen er kold, omhyggeligt udskære agarose-oppustede lunger med saks, og placere dem i en 3 cm skål med iskoldt PBS. Hold på is.
- Vælge den ønskede lap for væv udskæring (fx den højre overlegen lap). Sørg for, at indre del af lungen (hvor det forbinder til luftrør) vender nedad i fadet.
BEMÆRK: lap brugt og dens orientering på stemplet vil bestemme størrelsen af skibe og luftveje, der vil være synlige. Den her beskrevne orientering er ideel til visualisering af store luftveje, og parenkym. Mus har en stor venstre lap og fire mindre lapper til højre. TilPCLS billeddannelse efter indføring af allergener i lungerne via svælg og intranasal aspiration, er den rigtige overlegne lap typisk snit, dels fordi det er en bekvem størrelse, men også fordi inhalerede midler dispergere ensartet i den. Men andre lapper, især den venstre lap, kan også blive undersøgt. Når man sammenligner musestammer eller behandlinger, er det vigtigt at sammenligne den samme lap.
2. Lung Skiveskæring
BEMÆRK: skiver under anvendelse af et automatiseret slicer, metal køleblok, stemplet og metal sprøjte, ifølge producentens instruktioner.
- Sætte en lille dråbe alle formål, no-run gel superlim på stemplet og sprede limen i en cirkulær bevægelse, idet man ikke lade limen røre siderne af metallet sprøjten. Hvis limen berører sider af sprøjten, vil den lim sprøjten og stemplet sammen.
- Umiddelbart efter at dække stemplet med lim Klem forsigtigt denudskåret lap med pincet med luftrøret nedad, duppe den på en væv til fjernelse af overskydende væske og omhyggeligt placere den på toppen af stemplet. Skær nogen ekstra væv, der strækker sig ud over kanten af stemplet.
- Bevæge stemplet ned, så siderne af metal sprøjten bevæge sig op og over vævet, hvilket skaber en brønd med lungen limet i bunden, ikke mere end nogle centimeter dyb. Tape omkring bunden af metallet sprøjten for at holde denne position på plads.
- Hæld forsigtigt 2% lavtsmeltende agarose ved 40 ° C ind i brønden, så det netop dækker toppen af lap.
- Surround metallet sprøjten med iskold nedkøling blok og afkøle lap og agarose til 1 - 2 min.
BEMÆRK: En kortere tid afkøling af agarose omgiver vævet kunne føre til nedbrydning af agarosen under udskæring, hvilket kan resultere i et ujævnt skåret PCLS. - Indlæse prøven sprøjten i den automatiserede slicer og fylde buffertanken med iskoldt PBS. Juster trin motordrev med modellen sprøjten og fjern stykke tape fra bunden. Drej kontakten til den hurtigt fremad (FF) position, indtil trin motordrevet bare rører bagsiden af stemplet.
- Juster frisk blad med modellen sprøjte. Sæt vævstykkelse kontinuert / enkelt skive, oscillation og hastighed i opskæringsmaskinen. For eksempel væv tykkelse: 150 um, kontinuerlig klipning (fortsat.), Svingning: 9, og hastighed: 3 - 4. Tryk start. Ovenstående indstillinger skal justeres til de specifikke automatiserede pålægsmaskine specifikationer.
- Hjælp af en tynd spatel eller pensel, indsamle PCLS én ad gangen, som de falder i buffertanken og placere dem i en 24-brønds plade indeholdende iskold PBS.
BEMÆRK: Det er vigtigt at holde skiverne for at bevare sammenhængen mellem forsøgene. Selvom hver lunge er forskellige afhængigt af alder, køn og vægt, den 10. skive, for eksempel, generelt giver tilsvarende størrelse luftveje.
- Designe et panel af fluorescensmærkede antistoffer baseret på celletypen af interesse, idet der tages højde for potentielt fluorescerende spektral overlapning og detektionsevnen af mikroskopet.
BEMÆRK: Som et eksempel et panel for DC delmængde opdagelse er som følger: CD11 / alfa X integrin - BrilliantViolet (BV) 605 (Excitation: 405 nm, Peak emission: 605 nm), CD324 / Ecadherin - Alexa 488 (AF488 ) (Excitation: 488 nm, Peak emission: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - Phycoerythrin (PE) (Excitation: 561 nm, Peak emission: 578 nm), CD103 / alfa E integrin - allophycocyanin (APC) (Excitation: 633 nm Peak emission: 660 nm). Fluorescens spektrale viewer værktøjer (se Materialer List) er nyttige til at designe paneler. - Foretage en antistofcocktail indeholdende de ønskede antistoffer.
- For statisk PCLS billeddannelse, tilsættes 800 pi farvning buffer, 100 pi Fc blocker, 50 pi normalt museserum og 50 pi normalt rotteserum til et 1,5 ml microcentrifugelse rør til et samlet volumen på 1 ml. For levende celler, brug 800 pi Leibovitz medium (1x) indeholdende 10% FBS (Leibovitz-10) i stedet for farvning buffer.
- Tilføje antistoffer til at justere en ønsket slutkoncentration af hvert antistof. Overfør antistofopløsningen til en 3 cm skål, og holde i mørke indtil den er klar til brug.
BEMÆRK: Slutkoncentrationerne skal optimeres for hvert enkelt antistof (sædvanligvis 1 - 5 pg / ml).
- Vælge en PCLS med en anatomisk område af interesse, såsom store luftveje eller periferien af lungen, og placere i 3 cm skål indeholdende 1 ml antistofopløsning.
- Plet PCLS i mørke, på is, rocking langsomt i 30 eller 60 min.
- For statisk PCLS billedbehandling, gå videre til afsnittet 4. levende celler, fortsætte til afsnit 5.
4. Statisk Billeddannelse af PCLS
- Efter 60 minutters inkubation af PCLS med antistoffer, fjern antistofopløsningen fra skålen og skyl than skærer to gange med 1 ml iskold PBS.
- Pipetter 50 pi PBS på en 3 cm rund glasbund skålen. Ved hjælp af en spatel eller pensel, overføre de farvede PCLS til drop, forsigtigt manipulere skive, indtil den er flad og spredt ud. Fjern PBS med en pipette. Den skive skal ligge så fladt som muligt. De ovenstående procedurer skal udføres hurtigt for at undgå fotoblegning.
- Placere 1 dråbe stuetemperatur montering medium på udsnittet og forsigtigt droppe et dækglas i brønden af pladen. Holde PCLS i mørke ved 4 ° C i op til en time før billeddannelse.
- Når du ser under et konfokalmikroskop, brug en 20X objektiv (se Materialer List). Brug "flise" værktøj til at finde og markere kanterne af vævet i indstillingen "konvekse skrog". Dette vil medvirke til at reducere den tid af flisen scanning.
- Mens indstilling z-stakken rækkevidde, kontrollerer med flere områder af skiven, især langs kanterne, at de opstillede intervallerer hensigtsmæssige.
BEMÆRK: z-område vil sandsynligvis nødt til at være større end tykkelsen af selve væv, fordi det er meget vanskeligt at få vævet til at lægge helt flad. For eksempel med en 150 um tyk PCLS, z-stakken område vil sandsynligvis skal indstilles til 200 - 250 um til at rumme stød og kurver i udsnittet. Afhængigt af z-stack rækkevidde og størrelsen af vævet, vil hver fuld lunge scanning tage mellem 7 - 12 timer med en 20X objektiv. Hver lunge er unik, og indstillingerne skal justeres for hver eksperiment.
5. Levende Cell Imaging af PCLS
- Efter 30 minutters inkubation af PCLS med antistoffer, fjern antistofopløsningen fra skålen og skyl skiverne to gange med 1 ml kold Leibovitz-10.
- Pipetter frisk 50 pi Leibovitz-10 i en slids af en kamre dækglas (8 slots). Brug en spatel til at overføre PCLS til mediet, forsigtigt manipulere det, indtil den skive er flad og spredt ud. Ovennævnte procedurerskal udføres hurtigt for at undgå fotoblegning.
- Fjern mediet 50 uL ved hjælp af en pipette. Den skive er at ligge så fladt som muligt.
BEMÆRK: Det er acceptabelt, hvis kanterne af skive er vendt op lodret mod væggen af kammeret. Desuden om muligt et metal platin vægt kan anvendes til at forankre udsnittet før man går videre til næste trin. Se vedlagte Materialer List for et eksempel på platintråd, der kan skæres og bøjes i små vægte. - I et 4 ° C koldt rum, blandes 100 pi af vækstfaktor-reducerede, phenolrødfrit ekstracellulær matrix med 100 pi Leibovitz-10. Bruge forhånd afkølede pipettespidser for dette, eller den ekstracellulære matrix vil størkne i spidsen.
BEMÆRK: Denne forholdet mellem matrix og medium (1: 1) skaber en gel tæt nok til at holde PCLS nede i vævskultur-betingelser. - pipette forsigtigt matrix for at blande, og omhyggeligt pipette oven på PCLS, og sørg for, at gelen går på toppen af lung skive, og at udsnittet ikke flyder op på toppen af gelen. Gelen skal fungere som en vægt, forankre PCLS ned på bunden af pladen.
- overføre omhyggeligt med kamre dækglas til et 37 ° C inkubator og lad matrixen størkne for ~ 5 min.
- Overføre hele kamre dækglas på foropvarmede fase af et konfokalt mikroskop. Opretholde kammeret ved 37 ° C under hele billeddannelse. CO 2 forsyning er ikke påkrævet under celleinkubation ved brug Leibovitz medium.
- Indstil z-stack rækkevidde og flise interval baseret på det ønskede interval mellem rammer. Når du ser under et konfokalmikroskop, brug en 20X objektiv (se Materialer List). Brug "flise" værktøj til at betegne det område af interesse i vævet, ved hjælp af indstillingen "centreret grid" (fx en 2x2 centreret gitter).
- Mens indstilling z-stakken rækkevidde, kontrollerer med flere områder af udsnittet at de opstillede intervaller er hensigtsmæssige.
BEMÆRK: zrange vil sandsynligvis svare til tykkelsen af vævet. Hver lunge er unik, og indstillingerne skal justeres for hver eksperiment. 2x2 fliser og 10 z-stakke vil generelt resultere i ~ 1 ramme / 2 min. Sikre autofokus funktion aktiveres før start af eksperimentet for at minimere xy og z-drift under billeddannelse periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At identificere placeringen af to DC delmængder, CD11b hi CDCS og CD103 + CDCS, PCLS fra C57BL / 6-mus blev skåret og farvet med monoklonale antistoffer (mAb'er) specifikt for CD11, CD88, CD103, og CD324 (E-cadherin). Antistoffer mod CD324 plet luftvejsepitelceller og CD88 vises på makrofager og neutrofiler, men ikke CDCS 8. Dette tillod os at skelne CDCS fra CD11c + makrofager, og at observere det rumlige forhold af hver celletype til luftvejene (figur 1). Vi fandt, at CD11b hi CDCS lokalisere i parenkym, hvorimod CD103 + CDCS bor primært omkring luftvejene og subpleurale område. Selvom CD103 + CDCS let blev detekteret ved direkte farvning af celleoverflade CD103 i dette forsøg er påvisningen af CD11b hi CDCS påberåbt fravær af CD88 og CD103-farvning. For direkte at identificere CD11bhi CDCS, vi først forsøgt at plet PCLS anvendelse af et anti-CD11b mAb (klon M1 / 70), som er meget udbredt i immunhistokemi og flowcytometri. Men denne mAb havde en høj baggrund og lav specificitet i denne ansøgning, uanset hvilken fluorochromer blev konjugeret til mAb (figur 2A, og data ikke vist). Derimod antistoffer mod CD172a (SIRP1α) farvet CD11b hi CDCS 18, men ikke strukturelle celler eller CD103 + CDCS (figur 2B, og data ikke vist). På egen hånd, kan antistoffer mod CD172a ikke diskriminere mellem CDCS og monocytter eller makrofager. Men ved co-farvning med antistoffer mod CD88 og CD172a, var vi i stand til at skelne alveolære makrofager (CD172a - CD88 +) fra interstitielle makrofager (CD172a + CD88 +), og CD11b hi CDCS (CD172a + CD88 -), og viser, at de sidstnævnte celler fortrinsvis lokaliseres iparenkym, ikke sub-epithelial område (figur 2C - F), i overensstemmelse med vore resultater ved indirekte farvning af disse celler.
Undersøgelse af intra-væv migrering af leukocytter kræver visualisering af strukturelle celler, herunder lymfekarrene, hvorigennem DC'er trafik fra perifere væv til regionale LN. I huden og LN, er lymfekar ofte identificeret ved hjælp af monoklonale antistoffer til LYVE-1 eller Podoplanin. Vi fandt imidlertid, at i PCLS, mAb'er mod LYVE-1 og Podoplanin plette en række andre celletyper, herunder vaskulært endotel og alveoleepithelet (data ikke vist). Disse monoklonale antistoffer er derfor af begrænset praktisk anvendelse til specifikt at identificere lymfekar i PCLS. Dog mAb'er mod CD90.2 (Thy1.2), en velkendt T-celle-markør, mærkede lymfatiske strukturer, som tidligere vist i andre væv 19, 20 (figur 3A, B Prox1 promotoren 21 (figur 3A, C). PROX1 er en mester transskription faktor, der er nødvendig for lymfangiogenese 22. Prox1 TdTomato transgene mus udviser lyst fluorescerende lymfekar i lungerne og andre væv, såsom leveren, linse, dentate gyrus og neuroendokrine celler fra binyremarven 21. Faktisk er disse to mærkningsfremgangsmåder gav overlappende farvningsmønstre (figur 3D). Ved anvendelse af disse tilgange mærkning, var vi i stand til at bestemme, at CD103 + CDCS var til stede i adskillige anatomiske områder, herunder CD324-udtrykkende luftvejsepitel, lymfekarrene og subpleurale område (figur 3A, E).
Ud over den statiske billeddannelse, cellebevægelse og celle til cell interaktioner kan registreres ved hjælp af levende celler af PCLS (Film 1). PCLS blev frisk fremstillet fra mus, der havde modtaget injektioner af GFP-udtrykkende OT-II T-celler og inddrypning af OVA og LPS, farvet med mAb'er mod CD103 (rød) og luftvejsepitelet (CD324, blå), og blev afbildet til at spore bevægelse af CD103 + CDCS og T-celler 16 timer efter OVA / LPS instillation. I løbet af videoen (4 h), den dynamiske bevægelse af CD103 + DC'er (rød) og de adoptivt overførte OVA-specifikke T-celler (grøn) og deres interaktion er klart synlige (Film 1).
Figur 1. Distinct Anatomisk Steder i CDC Undergrupper som afsløret ved PCLS Farvning og konfokal mikroskopi. A) Hele PCLS fra en ubehandlet C57BL / 6 mus lunge farvet med forskellige antistoffer. Farven på hvert molekyle indikeres af dens skriftfarve (øverst til højre). Individuel og kombinatorisk farvning giver følgende farver til celletyper af interesse: CD103 + CDCS (CD103 + CD11 + CD88 -, hvid), CD11b hi CDCS (CD11c + CD103 - CD88 -, rød), makrofager (CD11 + CD88 +; gul ), neutrofiler (CD11c - CD88 +, grøn) og luftvejs epitelceller (CD324 +, blå). B - D) Højere forstørrelse af indsatsene i A. B) CD11b hi CDCS lokalisere i parenkym. C) CD103 + CDCS omkring luftvejene. D) CD103 + CDCS under den viscerale lungehinden. Hvide søjler angiver 50 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Farvning af DC'er og makrofager. A) Farvning af PCLS med antistoffer mod CD11 (blå) giver en høj baggrund i PCLS. B) Antistoffer mod CD172a (grøn) har en forholdsvis lav baggrund i PCLS og større specificitet for CD11b + -celler. C) Hele PCLS af C57BL / 6-mus farvet med mAb'er hvis farve er angivet med skrifttypefarve (øverst til højre). CD11 (rød), CD88 (cyan), CD172a (grøn) og CD324 (blå). CD11b hi CDCS (CD11c + CD88 - CD172a +, gul), alveolære makrofager (CD11c + CD88 + CD172a -; lyserødt) interstitielle makrofager (CD11c + CD88 + CD172a +; hvid), neutrofiler (CD11 - CD88 +, cyan) og luftveje (CD324 +, blå). D - F) Højere forstørrelse af indsatseneafbildet i C. D) Sub-pleural område. E) Sub-epitel område. F) interstitium. Interstitielle makrofager lokaliseres i parenchym, og alveolære makrofager er i alveoler. Umærkede hvide søjler angiver 50 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Mærkning af Strukturelle Celler i PCLS. A) Hele PCLS fremstillet ud fra Prox1 tdTomato mus, og farvet med mAb'er mod CD90.2 (grøn), CD103 (hvid) og CD324 (blå). Prox1-udtrykkende celler (rød) er genetisk mærket med TdTomato under regulering af Prox1 promotoren (Prox1-TdTomato). B - E) Højere forstørrelse af indsatte i
Film 1. T-celler Interagere med CD103 + CDCS i Lung. Live-cell imaging af CD103 + CDCS (rød) interagerer med T-celler (grøn). CD4 + T-celler isoleret fra OVA-specifikke OT-II Nur77 GFP-mus blev stimuleret med milt-DC'er og OVA in vitro, og adoptivt overført til Rag - / - mus. 2 timer senere modtager mus blev behandlet, with OVA / LPS inddrypning til luftvejene. 16 timer efter OVA / LPS behandling blev PCLS foretaget, farves og afbildes i 4 timer ved 37 ° C. Tidsregistrering billede (min) er vist. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne protokol blev oprindeligt udviklet til at visualisere placeringen af to delmængder af CDCS i lungerne. Imidlertid kan denne protokol let tilpasses til at studere mange forskellige celletyper, og samtidig opretholde cellelevedygtighed og den tredimensionale arkitektur af lungen. Den sidstnævnte træk er en vigtig fordel i forhold cellekultursystemer og letter identifikation af sjældne celletyper. Fremgangsmåden er baseret på dannelsen af PCLS fra lungen, og en passende kombination af antistoffer til at identificere specifikke celletyper samtidig minimere baggrundsfarvning. I vid udstrækning, dette er en empirisk øvelse, fordi antistoffer, der fungerer godt i andre programmer, herunder flowcytometri, ikke nødvendigvis fungerer godt til farvning PCLS. Vi har allerede gjort betydelige fremskridt i denne henseende, men efterforskerne, der ønsker at studere celletyper ikke behandles her kan have til at teste forskellige antistoffer og optimere fluorokromer og koncentrationer. Brug af protokollen beskrevet her, fandt vi, at CD103 + CDCS og CD11b hi CDCS bor på forskellige lokaliseringer i lungerne. Ved steady state blev CD103 + CDCS detekteret omkring luftvejene og i subpleurale region, hvorimod CD11b hi CDCS primært blev fundet i parenchyma. Selvom den protokol beskriver vi her er ikke egnet til farvning intracellulære molekyler, er det nyttigt til billeddannelse celleoverflademarkører, samt sekretoriske molekyler. Således var vi i stand til at detektere kemokiner, CCL21 og CCL19, i PCLS (data ikke vist). Hvis kun svage fluorescerende signaler ses under anvendelse af primære antistoffer, er det muligt at anvende sekundære antistoffer til at supplere disse signaler.
En stor udfordring ved udførelse af levende celler video-billeddannelse af PCLS var at tilstrækkeligt forankre vævet i dyrkningsmedium for at forhindre betydelig XY og z-drift i 4-h mikroskopi periode. For at løse dette, vi eksperimenteredemed forskellige forhold af Leibovitz medium til ekstracellulær matrix, som er fast ved stuetemperatur, og bestemte en 1: 1-forhold opretholdt en stabil, 3D-struktur med cellelevedygtighed. Under post-billedbehandling, vi også anvendt en række ImageJ plug-ins, kaldet TurboReg og StackReg at eliminere enhver yderligere utilsigtede xy eller z-shift (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx? id = 18226). Brug af autofokus redskab for konfokalmikroskop, blev området af interesse holdes i fokus, især i z-interval, under hele scanningen periode. En anden udfordring i den levende celle billeddannelse af PCLS var at udnytte den flise scanning, z-stak, tidsserier, og autofokusfunktioner af mikroskopet. For at minimere tiden mellem hvert billede, skal en balance mellem den tid at scanne hver flise. For at optimere scanningen tid i hver forskningsprojekt, z-stak nummer, fliser, og scanningshastigheder skal justeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at erklære.
Acknowledgments
Vi takker Jeff Tucker, Erica Scappini, og Agnes Janoshazi for deres hjælp med mikroskopi, Ligon Perrow for hendes ledelse af musen koloni, og Jun Chen og Michael Sanderson om hjælp med vævet pålægsmaskine, og Michael Fessler og Derek Cain for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af murene gren af NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), som igen er sponsoreret af Department of Health and Human Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
