Summary
We beschrijven een werkwijze voor het precisie-cut Lung Schijfjes (PCLS) en immunokleuring ze naar de lokalisatie van diverse immuun celsoorten te visualiseren in de longen. Ons protocol kan worden uitgebreid tot de locatie en de functie van vele verschillende celtypen te visualiseren onder verschillende omstandigheden.
Abstract
Inhalatie van allergenen en pathogenen opwekt meerdere wijzigingen in diverse immunologische celsoorten in de longen. Flowcytometrie is een krachtige techniek voor kwantitatieve analyse van celoppervlakte-eiwitten op immuuncellen, maar geeft geen informatie over de lokalisatie en migratie patronen van deze cellen in de longen. Evenzo kan chemotaxis assays worden uitgevoerd om het vermogen van cellen te bestuderen om te reageren op chemotactische factoren in vitro, maar deze testen niet reproduceren complexe omgeving van het intacte long. In tegenstelling tot deze bovengenoemde technieken kan de ligging van de verschillende celtypes in de longen gemakkelijk worden gevisualiseerd door het genereren precisie gesneden Lung Schijfjes (PCLS) kleuring hen commercieel verkrijgbare, fluorescent gemerkte antilichamen en visualiseren van de secties met confocale microscopie. PCLS kan worden gebruikt voor zowel live als longweefsel gefixeerd en de plakjes kan gebieden omvatten zo groot als een dwarsdoorsnede van een hele kwab. We hebben dit protocol gebruikt met succes visualiseren van de locatie van diverse celtypen in de long, waaronder verschillende soorten dendritische cellen, macrofagen, neutrofielen, T-cellen en B-cellen, en structurele cellen zoals lymfatische, endotheliale en epitheelcellen. Het vermogen om cellulaire interacties, zoals die tussen dendritische cellen en T-cellen, in levende, driedimensionale longweefsel zichtbaar, kan openbaren hoe cellen zich binnen de longen met elkaar bij steady state en bij inflammatie. Derhalve bij gebruik in combinatie met andere procedures, zoals stroomcytometrie en kwantitatieve PCR, kan PCLS bijdragen aan een beter begrip van cellulaire gebeurtenissen die allergische en inflammatoire longziekten grondslag liggen.
Introduction
Na inhalatie van pro-inflammatoire stimuli zoals lipopolysaccharide (LPS), is er een gecoördineerde beweging van immuuncellen in, binnen en uit de longen. Bijvoorbeeld worden neutrofielen snel aangeworven om het longparenchym en luchtwegen. Bovendien hebben sommige professionele antigeenpresenterende cellen bekend als conventionele dendritische cellen (CDCS) ondergaat een betrekkelijk ingewikkelde migratiepatroon 1, 2. CDCS kunnen worden geïdentificeerd met gebruik van doorstroomcytometrie, gedeeltelijk gebaseerd op de weergave van de oppervlaktemerker, CD11c. Verschillende subsets van DCs kan worden onderscheiden door het verschil oppervlakte-expressie van CD103 en CD11b 3. Bij het verwerven van geïnhaleerde antigeen, sommige CDCs verlaat de long en migreren door de lymfevaten to-long drainerende lymfeklieren (LN), waar ze presenteren peptiden op antigeen-specifieke T-cellen 4. Dit is een kritieke vroege gebeurtenis bij de initiatie van adaptieve immuunsysteem responses. Om onbekende redenen, echter niet alle CDCs dat geïnhaleerde antigenen verwerven verlaat de longen, en veel van deze cellen blijven in dat orgaan voor enkele maanden 5, 6. Deze waarneming kan gedeeltelijk worden verklaard door de ontwikkelings afstamming van deze cellen omdat monocyten afgeleide CD11c + cellen die de chemokine receptor CCR7, niet kunnen migreren naar regionale LN's 7, 8. Het lijkt waarschijnlijk dat de migratiepotentieel van CDC Ook wordt bepaald, ten minste gedeeltelijk, door de anatomische positie binnen de long. Echter, de precieze lokalisatie van deze verschillende populaties van CDC in de long niet volledig gekarakteriseerd. Een verbeterde kennis van immuuncel lokalisatie binnen de longen en van de moleculen die direct het, is nodig voor een beter begrip van hoe het immuunsysteem van de longen wordt geactiveerd.
PCLS worden dat verhogingly gebruikt als een ex vivo benadering voor cellulaire positionering en cel-cel interacties visualiseren, met behoud van de structurele integriteit van de long architectuur 9, 10. PCLS zijn gebruikt om de longen van de vele soorten, waaronder muizen, runderen, apen, schapen, paarden en mensen 11 te bestuderen. Een belangrijk voordeel van deze techniek is dat ongeveer 20 plakken kunnen worden bereid uit een kwab van een muislong, waardoor het aantal dieren om eigen proeven verminderen. Vrijwel alle immuun celtypen, met inbegrip van DCs, macrofagen, neutrofielen, en T-cellen, zijn aanwezig in PCLS en hun normale structuur te behouden.
PCLS kan ook worden gebruikt om calcium signalering en contractiliteit van de luchtwegen en gladde spiercellen studie na behandeling met acetylcholine 12 of 13 methacholine. In deze benadering slechts een klein deel van de long is eenmicroscopisch alyzed, maar een studie rapporteerde dat metingen van de luchtwegen inkrimping PCLS varieert slechts ongeveer 10% van plak tot plak, en dit verschil is vergelijkbaar met dat gebruikt longfunctietesten bij intacte dieren 14. Andere onderzoekers hebben PCLS een ex vivo benadering gebruikt om veranderingen in cytokine-expressie en celoppervlak markers na incubatie studie met 15 LPS. PCLS zijn ook gebruikt in een ex vivo model van hypoxische pulmonale vasoconstrictie in kleine intra-acinaire slagaders. Deze vaten liggen in het deel van de long die niet kunnen worden bereikt met andere procedures, waaronder opnamen van ontleed arteriële segmenten of analyse van subpleural vaten 16. Ons laboratorium heeft voornamelijk gebruikt PCLS om immuuncel lokalisatie in levende longweefsel bij steady state en naar aanleiding van een in vivo inflammatoire stimulus te visualiseren. De procedures die we hebben ontwikkeld voor dit zijn als volgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal beschreven in dit document experimentele procedures werden goedgekeurd door de NIEHS Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
1. Bereiding Lung
- Huis muizen tussen de 6 en 12 weken oud in specifieke pathogeen-vrije omstandigheden in overeenstemming met de door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies richtlijnen.
LET OP: Bedrukte muizen kunnen ofwel naïef, of behandeld worden, afhankelijk van de specifieke belangen van elke onderzoeker. We beschrijven immuuncel lokalisatie in naïeve muizen en muizen behandeld met 100 ug ovalbumine (OVA) en 0,1 pg lipopolysaccharide (LPS), gebruikt met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) als een drager in een totaal volume van 50 ul. Om oropharyngeally druppelen OVA / LPS in de luchtwegen, werden de dieren verdoofd met isofluraan inademing en vertikaal opgehangen aan hun tanden met een elastiekje. De tong werd voorzichtig met een tang gegrepen en vastgehouden opzij te voorkomen slikken en 50 en #181, L van de OVA / LPS-oplossing aangebracht aan de achterkant van de mondholte zoals eerder beschreven 17. - Euthanaseren de muis met intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (100 mg / kg) en pin het dier een polystyreen base.
- Open de buikholte met een schaar door het snijden van de huid en het buikvlies van het midden van de buik naar de kaak. Trek de darmen opzij met een tang of doffe kant van de schaar en knip de inferieure vena cava bloed wegvloeien van longen. Doorboren het membraan met de scherpe punt van de schaar om uitbreiding van de ribbenkast mogelijk, let de longen niet snijdt.
- Duidelijke speekselklieren en ander weefsel weg van de trachea door grijpen het weefsel en handmatig weg te trekken van de onderliggende trachea met een tang. Maak een kleine incisie in de luchtpijp op de voorste zijde van de dikste band van het kraakbeen met behulp van fijne tang of schaar, zorg dat u de hele weg te snijden hoewel de traChea. De incisie zal net groot genoeg om een 20 G naald te passeren zijn.
- Schuif een 1,5 inch, 20 G naald op een stuk polyethyleen buis, laat ongeveer 1 cm van de slang voorbij het einde van de naald. Snij de buis onder een hoek van ongeveer 45 ° tot het einde schuinen, bevestig de naald op een 1 ml spuit en plaats de spuit door het trekken 0,8 ml warm (40 ° C) 2% laag smeltpunt agarose omhoog door de naald.
- Plaats het uiteinde van de slang in de insnijding van de luchtpijp en injecteer langzaam de agarose in de longen. Zonder de naald of spuit, tape de injectiespuit naar de basis van piepschuim te zorgen dat de naald blijft in de trachea.
NB: Na de injectie, de longen zal groter en opgeblazen binnen de borst. Rechts lobben breiden, daarna de linker kwab. Als slechts één uitsteeksel expandeert, is de naald te diep is ingebracht (langs de bronchus), en het zal nodig zijn om het een beetje trekken alvorens zijn. Dit deel van deprocedure moet relatief snel worden gedaan, voordat de agarose begint te stollen. - Plaats de muis, de basis en de spuit in de luchtpijp nog ingebracht in een koude kamer of ijskast minstens 10 minuten. Indien nodig, kan het dier worden er tot enkele uren, zelfs als over te gaan tot het celmigratie door video microscopie gehouden.
- Zodra de muis is koud, zorgvuldig accijnzen de-agarose opgeblazen longen met een schaar, en leg ze in een 3 cm schaal met ijskoud PBS. Houd op het ijs.
- Kies de gewenste kwab voor weefsel snijden (bijvoorbeeld de rechter superieure kwab). Zorg ervoor dat het binnenste deel van de long (waar het verbindt met luchtpijp) is naar beneden in de schaal.
OPMERKING: De kwab gebruikt en de oriëntatie van de plunjer zal de omvang van schepen en luchtwegen die zichtbaar is bepaald. De hier beschreven oriëntatie is ideaal voor visualisatie van grote luchtwegen en parenchym. Muizen hebben een grote linker kwab en vier kleinere lobben aan de rechterkant. VoorPCLS beeldvorming na inbrengen van allergenen in de longen via de orofaryngeale of intranasale aspiratie, wordt het rechter superieure kwab typisch gesegmenteerd, deels omdat het een geschikte grootte, maar ook omdat geïnhaleerde middelen dispergeren gelijkmatig daarin. Echter, andere lobben, met name de linker kwab, kan ook worden bestudeerd. Bij het vergelijken van de muis stammen of behandelingen, is het belangrijk om dezelfde kwab te vergelijken.
2. Lung Snijden
OPMERKING: De plakken gebruikmakend van een geautomatiseerd slicer, metalen koelblok, plunjer en metalen injectiespuit volgens de instructies van de fabrikant.
- Doe een druppeltje universele, niet-run gel superlijm op de plunjer en verspreid de lijm in een cirkelvormige beweging, zorg ervoor laat de lijm tegen de zijkant van de metalen spuit. Wanneer de lijm raakt de zijkanten van de injectiespuit, zal de spuit en plunjer lijm samen.
- Onmiddellijk wanneer het voertuig plunjer lijm voorzichtig grijpen deuitgesneden lobben met een pincet de trachea naar beneden, deppen op een tissue om overtollige vloeistof te verwijderen en voorzichtig zet deze boven de plunjer. Snij extra weefsel uitstrekt voorbij de rand van de plunjer.
- Beweegt de plunjer naar beneden, zodat de zijden van de metalen spuit omhoog en over het weefsel, waardoor een goed met de long gelijmd aan de onderkant, niet meer dan enkele centimeters diep. Band rond de bodem van de metalen spuit deze positie zijn plaats te houden.
- Giet 2% laag smeltpunt agarose bij 40 ° C in het boorgat zodat het net boven de lob bedekt.
- Omringen de metalen spuit met ijskoude koelen blok en koel de lob en agarose gedurende 1-2 min.
Opmerking: Een kortere afkoeling van de agarose rondom het weefsel kan tijdens het snijden, wat kan leiden tot een ongelijkmatig gesneden PCLS tot desintegratie van de agarose. - Laad het monster spuit in de automatische snijmachine en vul het buffervat met ijskoude PBS. Lijn de stap motoraandrijving het model spuit en verwijder het stukje tape van de onderzijde. Zet de schakelaar in de stand snel vooruit (FF) tot de stap motoraandrijving net raakt de achterkant van de zuiger.
- Lijn de verse blad met het monster spuit. Set weefseldikte continu / enkelplaks, trilling en snelheid in de snijmachine. Bijvoorbeeld weefsel dikte: 150 um, permanent snoeien (cont.) Oscillatie: 9, en snelheid: 3 - 4. Druk op de startknop. De bovenstaande instellingen moeten worden aangepast aan de specifieke geautomatiseerde snijmachine specificaties.
- Waarbij een dunne spatel of kwast, verzamel de PCLS één tegelijk als die in de buffertank vallen en plaats ze in een 24-well plaat met ijskoude PBS.
NB: Het is belangrijk om de plakken om de coherentie tussen de experimenten te houden te houden. Hoewel elke long is verschillend afhankelijk van leeftijd, geslacht en gewicht, de 10 e slice, bijvoorbeeld, levert in het algemeen vergelijkbare grootte luchtwegen.
- Ontwerp een panel van fluorescent gelabelde antilichamen gebaseerd op het celtype, rekening houdend met mogelijke fluorescentie spectrale overlap en de detectiemogelijkheden van de microscoop.
Opmerking: Als voorbeeld, een paneel voor DC subgroep detectie als volgt: CD11c / a X integrine - BrilliantViolet (BV) 605 (excitatie: 405 nm, piek emissie: 605 nm), CD324 / E-cadherine - Alexa 488 (AF488 ) (excitatie: 488 nm, piek emissie: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - fycoerythrine (PE) (excitatie: 561 nm, piek emissie: 578 nm), CD103 / a E integrine - allofycocyanine (APC) (excitatie: 633 nm , Peak emissie: 660 nm). Fluorescentie spectrale viewer gereedschappen (zie Materials List) zijn nuttig om panelen te ontwerpen. - Maak een antilichaam cocktail die de gewenste antilichamen.
- Voor statische PCLS beeldvorming, voeg 800 ul kleuringsbuffer, 100 pl Fc blokker, 50 ui normaal muizenserum en 50 ui normaal ratserum een 1,5 ml microcentrifuking buis voor een totaal volume van 1 ml. Voor live cell imaging Gebruik 800 ul Leibovitz's medium (1x) dat 10% FBS (Leibovitz-10) in plaats van vlekken buffer.
- antilichamen aan een gewenste uiteindelijke concentratie van elk antilichaam te passen. Breng de antilichaamoplossing een 3 cm schaal, en houden in het donker tot gebruik.
OPMERKING: De eindconcentraties moeten worden geoptimaliseerd voor elk individueel antilichaam (gewoonlijk 1-5 gg / ml).
- Kies een PCLS met een anatomisch gebied van belang, zoals grote luchtwegen of periferie van de long en plaats in de 3-cm schaaltje met 1 ml antilichaamoplossing.
- PCLS vlek in het donker op ijs schommelen langzaam gedurende 30 of 60 minuten.
- Voor statische PCLS imaging, ga dan naar de sectie 4. Voor live cell imaging, gaat u naar sectie 5.
4. Statische beeldvorming van PCLS
- Na 60 min incubatie van PCLS met antilichamen, verwijder de antilichaamoplossing uit de schaal en spoel thij moten tweemaal met 1 ml ijskoude PBS.
- Pipetteer 50 ul PBS op een 3 cm ronde glazen bodem schaal. Met een spatel of kwast, dragen de gekleurde PCLS de druppel voorzichtig manipuleren van de schijf totdat deze vlak en verspreid. Verwijder de PBS met een pipet. De plak moet liggen zo vlak mogelijk. De bovenstaande procedures moeten snel worden uitgevoerd om fotobleken te voorkomen.
- Plaats 1 druppel kamertemperatuur fixeermiddel op het segment en zacht laat een glazen dekglaasje in de put van de plaat. Houd PCLS in het donker bij 4 ° C gedurende maximaal een uur voor beeldvorming.
- Bij het bekijken onder een confocale microscoop, gebruik dan een 20X objectief (zie Materials List). Gebruik de "tegel" tool om de randen van het weefsel te lokaliseren en markeer in de instelling "convex omhulsel". Dit zal bijdragen tot het verminderen van de tijd van de tegel scan.
- Tijdens het instellen van de z-stack range, onderzoekt meerdere gebieden van het segment, met name langs de randen, dat de verzameling trajectengeschikt zijn.
OPMERKING: De z-bereik zal waarschijnlijk moeten groter zijn dan de dikte van het weefsel zelf, want het is erg moeilijk om het weefsel volledig plat te leggen. Bijvoorbeeld, met een 150 urn dikke PCLS, de z-stack bereik zal waarschijnlijk moeten worden ingesteld op 200-250 urn om schokken en bochten in het segment tegemoet. 12 h met een 20X objectief - afhankelijk van de z-stack en de omvang van het weefsel, zal elke volledige long scan tussen 7 nemen. Elke long is uniek en de instellingen moeten worden aangepast voor elk experiment.
5. Live-cell imaging van PCLS
- Na 30 min incubatie van PCLS met antilichamen, verwijder de antilichaamoplossing uit de schaal en spoel de plakken tweemaal met 1 ml koud Leibovitz-10.
- Pipetteer 50 ul vers Leibovitz-10 in een sleuf van een chambered dekglaasje (8 slots). Met een spatel om de PCLS dragen aan het medium voorzichtig manipuleren totdat het segment vlak en verspreid. De bovenstaande proceduresmoeten snel worden uitgevoerd om fotobleken te voorkomen.
- Verwijder de 50 pi medium met een pipet. De plak te liggen zo vlak mogelijk.
Opmerking: Het is aanvaardbaar wanneer de randen van de plak verticaal gedraaid tegen de wand van de kamer. Bovendien, indien beschikbaar, een metaal platina gewicht kan worden gebruikt om het segment te verankeren alvorens naar de volgende stap. Zie de bijgevoegde lijst Materialen één voorbeeld van platinadraad die kan worden gesneden en gebogen in kleine gewichten. - In een 4 ° C koude kamer, meng 100 pi groeifactor verminderd, fenolrood-vrij extracellulaire matrix met 100 pl Leibovitz-10. Gebruik voorgekoelde pipetpunten hiervoor, of de extracellulaire matrix stolt in de punt.
Opmerking: Deze verhouding tussen matrix en medium (1: 1) leidt tot een gel dicht genoeg bij de PCLS ingedrukt in weefsel- kweekomstandigheden. - Voorzichtig pipet de matrix te mengen en voorzichtig pipet bovenop de PCLS en zorg ervoor dat de gel komt bovenop de lung segment, en dat het segment niet drijven bovenop de gel. De gel moet werken in gewichtsprocent, verankeren de PCLS beneden op de bodem van de plaat.
- Breng voorzichtig de chambered dekglaasje een 37 ° C incubator en laat de matrix stollen ~ 5 min.
- Breng de volledige chambered dekglaasje op de voorverwarmde fase van een confocale microscoop. Handhaaf de kamer bij 37 ° C gedurende beeldvorming. CO2 levering niet vereist tijdens de cel incubatie bij gebruik Leibovitz's medium.
- Stel de z-stack range en tegelserie basis van het gewenste interval tussen de frames. Bij het bekijken onder een confocale microscoop, gebruik dan een 20X objectief (zie Materials List). Gebruik de "tegel" tool om het gebied van belang in het weefsel aan te duiden, met behulp van de instelling "gecentreerde grid" (bijvoorbeeld een 2x2 gecentreerd rooster).
- Tijdens het instellen van de z-stack range, onderzoekt meerdere gebieden van het segment dat de verzameling trajecten geschikt.
OPMERKING: De zrange zal waarschijnlijk gelijk zijn aan de dikte van het weefsel. Elke long is uniek en de instellingen moeten worden aangepast voor elk experiment. 2x2 tegels en 10 z-stacks resulteert over het algemeen in ~ 1 beeld / 2 min. Zorg ervoor dat de auto-focus functie wordt geactiveerd voordat het experiment xy en z-drift te minimaliseren tijdens de beeldvorming periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de locatie van beide DC subsets, CD11b hi CDCs en CD103 + CDCs, PCLS van C57BL / 6-muizen te identificeren werden gesneden en gekleurd met monoklonale antilichamen (mAbs) die specifiek zijn voor CD11c, CD88, CD103 en CD324 (E-cadherine). Antilichamen tegen CD324 vlek epitheelcellen van de luchtwegen, en CD88 wordt op macrofagen en neutrofielen, maar niet CDCS 8. Daardoor konden we CDCs onderscheiden van CD 11 c + macrofagen, en de ruimtelijke relatie van elk celtype aan de luchtwegen (Figuur 1) te observeren. We vonden dat CD 11 hi CDCs lokaliseren in het parenchym, terwijl CD103 + CDCS wonen voornamelijk rond de luchtwegen en het subpleural gebied. Hoewel CD103 + CDCs gemakkelijk werden gedetecteerd door directe kleuring van het celoppervlak CD103 in dit experiment werd de detectie van CD11b hi CDC aangevoerde afwezigheid van CD88 en CD103 kleuring. Om direct te identificeren CD11bhallo CDCS we eerst getracht vlek PCLS gebruik van een anti-CD11b mAb (kloon M1 / 70), die op grote schaal wordt gebruikt in immunohistochemische en flow cytometrie. Echter, dit mAb had een hoge achtergrond en lage specificiteit in deze toepassing, ongeacht welke fluorochromen werden geconjugeerd aan het mAb (figuur 2A en data niet getoond). Daarentegen, antilichamen tegen CD172a (SIRP1α) gekleurd CD 11 hi CDC 18, maar niet structureel cellen of CD103 + CDC (figuur 2B en data niet getoond). Op hun eigen, kunnen antilichamen tegen CD172a geen onderscheid maken tussen CDC en monocyten of macrofagen. Echter, door co-kleuring met antilichamen tegen CD88 en CD172a, konden we alveolaire macrofagen (CD172a - CD88 +) onderscheiden van interstitiële macrofagen (CD172a + CD88 +) en CD 11 hi CDC (CD172a + CD88 -), en blijkt dat deze cellen voorkeur lokaliseren deparenchym, niet de sub-epitheliale gebied (Figuur 2C - F), in overeenstemming met de resultaten verkregen door indirecte kleuring van deze cellen.
Studie van intra-weefsel migratie van leukocyten vereist visualiseren van structurele cellen, waaronder die van de lymfvaten, waardoor DCs verkeer van perifere weefsels naar regionale LNS. In de huid en LN, worden lymfevaten vaak geïdentificeerd met behulp van monoklonale antilichamen tegen LYVE-1 of podoplanin. Echter, we vonden dat PCLS, mAbs tegen LYVE-1 en podoplanin vlekken diverse andere celtypen, waaronder vasculair endotheel en alveolaire epitheel (gegevens niet getoond). Deze mAbs zijn daarom van beperkt praktisch nut voor het specifiek identificeren van lymfevaten in PCLS. Echter mAbs tegen CD90.2 (Thy1.2), een bekende T-cel marker gelabeld lymfatische structuren, zoals eerder aangetoond in andere weefsels 19, 20 (figuren 3A, B Prox-1 promotor 21 (figuur 3A, C). Prox-1 is een meester transcriptiefactor die nodig is voor lymfangiogenese 22 is. Prox1 TdTomato transgene muizen vertonen helder fluorescerende lymfevaten in de longen en andere weefsels zoals de lever, lens, dentate gyrus en endocriene cellen van de adrenale medulla 21. Inderdaad, deze twee markeringswerkwijzen gaf overlappende kleurpatronen (Figuur 3D). Met behulp van deze labeling benaderingen konden we vaststellen dat CD103 + CDCs aanwezig waren op verschillende anatomische gebieden, zoals CD324-expressie luchtwegepitheel, de lymfevaten, en subpleural gebied (Figuur 3A, E).
In aanvulling op de statische beeldvorming, celbeweging en cel CELl interacties kunnen worden opgenomen met live cell imaging van PCLS (Film 1). PCLS werden vers bereid uit muizen die injecties van GFP tot expressie OT-II T-cellen en indruppelen van OVA en LPS heeft ontvangen, gekleurd met mAbs tegen CD103 (rood) en luchtwegepitheel (CD324, blauw), en werden afgebeeld op het spoor beweging van CD103 + CDCs en T-cellen 16 uur na OVA / LPS instillatie. In de loop van de video (4 h), de dynamische beweging van CD103 + DC (rood) en adoptief overgedragen OVA-specifieke T-cellen (groen) en hun interactie zijn duidelijk zichtbaar (Film 1).
Figuur 1. Verschillende anatomische locaties CDC Subsets zoals blijkt uit PCLS kleuring en confocale microscopie. A) Het hele PCLS van een onbehandelde C57BL / 6 muizen long gekleurd met verschillende antilichamen. De kleur van elk molecuul dat overigens zijn tekstkleur (rechtsboven). Individueel en combinatorische vlekken geeft de volgende kleuren voor celtypen van belang: CD103 + CDCS (CD103 + CD11c + CD88 -, wit), CD 11 hi CDCs (CD 11 c + CD103 - CD88 -, rood), macrofagen (CD 11 c + CD88 +; geel ), neutrofielen (CD 11 c - CD88 +, groen) en epitheelcellen (CD324 +, blauw). B - D) Hogere vergroting van het inlegwerk in A. B) CD 11 hi CDCs lokaliseren in het parenchym. C) CD103 + CDC's rond de luchtwegen. D) CD103 + CDCs onder de viscerale pleura. Witte balken geven 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Kleuring van DCs en macrofagen. A) Kleuring van PCLS met antilichamen tegen CD11b (blauw) geeft een hoge achtergrond in PCLS. B) Antilichamen tegen CD172a (groen) hebben een relatief lage achtergrond in PCLS en een grotere specificiteit voor CD11b + cellen. C) Gehele PCLS van C57BL / 6-muizen gekleurd met mAbs waarvan de kleur wordt aangeduid met tekstkleur (rechtsboven). CD11c (rood), CD88 (cyaan), CD172a (groen) en CD324 (blauw). CD 11 hi CDCS (CD 11 c + CD88 - CD172a +, geel), alveolaire macrofagen (CD 11 c + CD88 + CD172a -, roze), interstitiële macrofagen (CD 11 c + CD88 + CD172a +; wit), neutrofielen (CD 11 c - CD88 +; cyaan) en luchtwegen (CD324 +, blauw). D - F) Hogere vergroting van het inlegwerkafgebeeld in C. D) Sub-pleurale gebied. E) Sub-epitheliale omgeving. F) interstitium. Interstitiële macrofagen lokaliseren in het parenchym, en alveolaire macrofagen in de longblaasjes. Unlabeled witte balken geven 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Merken van structurele cellen in PCLS. A) Hele PCLS bereid uit Prox1 tdTomato muis en gekleurd met mAbs tegen CD90.2 (groen), CD103 (wit) en CD324 (blauw). -Prox1 expressie brengende cellen (rood) zijn genetisch gelabeld met TdTomato onder de regulatie van Prox1 promotor (Prox1-TdTomato). B - E) Hogere vergroting van de inzet in
Film 1. T-cellen interactie met CD103 + CDC in de long. Live-cell imaging van CD103 + CDCS (rood) interactie met T-cellen (groen). CD4 + -T-cellen geïsoleerd uit OVA-specifieke OT-II Nur77 GFP muizen werden gestimuleerd met milt DC en OVA in vitro en adoptief overgebracht in Rag - / - muis. 2 uur later, werd de ontvanger muis behandeld with OVA / LPS instillatie met de luchtweg. 16 uur na OVA / LPS-behandeling werden PCLS gemaakt, gekleurd en afgebeeld gedurende 4 uur bij 37 ° C. Tijdregistratie beeld (min) getoond. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven protocol werd oorspronkelijk ontwikkeld om de locaties van twee subsets van CDC in de long zichtbaar. Echter, kan het protocol gemakkelijk worden aangepast aan vele verschillende celtypen te onderzoeken, met behoud van cellevensvatbaarheid en de driedimensionale architectuur van de long. De laatste is een belangrijk voordeel ten opzichte celkweeksystemen en vergemakkelijkt de identificatie van zeldzame celtypen. De werkwijze berust op het genereren van PCLS van de long, en een geschikte combinatie van antilichamen tegen specifieke celsoorten met minimale achtergrondkleuring. Grotendeels, dit een empirische oefening omdat antilichamen die goed werken in andere toepassingen, met inbegrip van flowcytometrie, niet noodzakelijkerwijze goed voor het kleuren PCLS. We hebben al aanzienlijke vooruitgang geboekt op dit gebied, maar de onderzoekers die willen celtypes hier niet aan de orde te bestuderen kan zijn dat verschillende antilichamen te testen en optimaliseren van fluorochromen en concentraties. Met de hier beschreven protocol, vonden we dat CD103 + CD11b CDCs en hi CDCs bevinden op verschillende lokalisaties in de long. In steady state werden CD103 + CDCs waargenomen rond de luchtwegen en in het subpleural regio, terwijl CD 11 hi CDCs voornamelijk gevonden in het parenchym. Hoewel de hier beschreven protocol is niet geschikt voor het kleuren van intracellulaire moleculen, is het nuttig voor de beeldvorming celoppervlak markers, en secretorische moleculen. Zo waren we in staat om de chemokines, CCL21 en CCL19 ontdekken, in het PCLS (gegevens niet getoond). Als slechts zwakke fluorescentiesignalen worden waargenomen gebruikmakend van primaire antilichamen kan men secundaire antilichamen gebruiken om die signalen te versterken.
Een belangrijke uitdaging bij het uitvoeren van live cell video-beeldvorming van PCLS was voldoende te verankeren het weefsel in kweekmedium tot aanzienlijke xy en z-drift tijdens de 4-h microscopie periode te voorkomen. Om dit aan te pakken, we geëxperimenteerdmet verschillende verhoudingen van Leibovitz's medium extracellulaire matrix, die vast is bij kamertemperatuur, en bepaald een 1: 1 verhouding stabiel zijn gebleven, 3D-structuur met cellevensvatbaarheid. Tijdens post-beeldverwerking, gebruikten we een reeks ImageJ plug-ins, genaamd TurboReg en StackReg dat extra incidentele xy of z-verschuiving (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx elimineren? id = 18226). Met behulp van de auto-focus instrument van de confocale microscoop, de regio van belang werd gehouden in focus, met name in de z-range, gedurende de gehele aftastperiode. Een andere uitdaging tijdens de live-cell imaging van PCLS werd met behulp van de tegel scan, z-stack, tijdreeksen en autofocus functies van de microscoop. Om de tijd tussen elk frame te minimaliseren, moet een evenwicht worden gevonden tussen de tijd die het scannen van elke tegel. De aftasttijd optimaliseren elk onderzoeksproject, z-stapelnummer, tegels en scansnelheden moeten worden aangepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.
Acknowledgments
Wij danken Jeff Tucker, Erica Scappini en Agnes Janoshazi voor hun hulp bij microscopie, Ligon Perrow voor haar beheer van de muis kolonie, en Jun Chen en Michael Sanderson voor hulp bij het weefsel snijmachine, en Michael Fessler en Derek Cain voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de intramurale tak van de NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), die op zijn beurt wordt gesponsord door het Department of Health and Human Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
