Summary
Si descrive un metodo per la generazione di precisione intercettato Lung fette (PCLS) e immunocolorazione loro di visualizzare la localizzazione dei vari tipi di cellule immunitarie nel polmone. Il nostro protocollo può essere esteso per visualizzare la posizione e la funzione dei diversi tipi di cellule in una varietà di condizioni.
Abstract
L'inalazione di allergeni e agenti patogeni suscita più modifiche in una varietà di tipi di cellule del sistema immunitario nel polmone. La citometria a flusso è una tecnica potente per l'analisi quantitativa di proteine di superficie cellulare sulle cellule immunitarie, ma non fornisce informazioni sulla localizzazione e migrazione modelli di queste cellule all'interno del polmone. Analogamente, analisi chemiotattica possono essere eseguite per studiare il potenziale delle cellule di rispondere a fattori chemiotattici in vitro, ma questi test non riproducono l'ambiente complesso del polmone intatto. In contrasto con queste tecniche di cui sopra, la posizione di tipi di cellule individuali all'interno del polmone può essere facilmente visualizzato generando precisione intercettato Lung fette (PCLS), loro colorazione con anticorpi commercialmente disponibili, fluorescente tag, e la visualizzazione delle sezioni al microscopio confocale. PCLS possono essere utilizzati sia per vivere e fissati tessuto polmonare, e le fette possono comprendere aree grandi come una sezione trasversale di un intero lobo. Abbiamo usato questo protocollo per visualizzare correttamente la posizione di una grande varietà di tipi di cellule del polmone, inclusi tipi distinti di cellule dendritiche, macrofagi, neutrofili, cellule T e B, così come le cellule strutturali come linfatica, endoteliale, e cellule epiteliali. La capacità di visualizzare interazioni cellulari, come quelle tra cellule dendritiche e cellule T, in, tessuto polmonare tridimensionale in tempo reale, può rivelare come cellule si muovono all'interno del polmone e interagiscono tra loro allo stato stazionario e durante l'infiammazione. Così, quando usato in combinazione con altre procedure, come la citometria di flusso e PCR quantitativa, PCLS può contribuire ad una comprensione completa di eventi cellulari che sono alla base delle malattie allergiche e infiammatorie del polmone.
Introduction
Dopo l'inalazione di stimoli pro-infiammatori quali lipopolisaccaride (LPS), v'è un movimento coordinato delle cellule immunitarie verso, all'interno, e dal polmone. Ad esempio, i neutrofili vengono rapidamente reclutati al parenchima polmonare e delle vie aeree. Inoltre, alcune cellule presentanti l'antigene professionali conosciute come cellule dendritiche convenzionali (CDC) subiscono un modello migratorio relativamente complesso 1, 2. CDC possono essere identificati usando la citometria a flusso, basati in parte sulla loro visualizzazione del marcatore di superficie, CD11c. Sottoinsiemi distinti di DC si distinguono per l'espressione di superficie differenziale di CD103 e CD11b 3. Acquistando antigene inalatoria, alcuni CDC uscire dal polmone e migrano attraverso i vasi linfatici polmonari drenante linfonodi (LNS) quando queste presentano peptidi alle cellule T antigene-specifiche 4. Questo è un evento precoce critica l'avvio di adattativo r immunitarioesponses. Per ragioni sconosciute, tuttavia, non tutti i CDC che acquisiscono gli antigeni inalati lasciano il polmone, e molte di queste cellule rimangono in quell'organo per diversi mesi 5, 6. Questa osservazione può essere spiegato in parte gli antenati sviluppo di queste cellule derivate da monociti perché CD11c + cellule privi del recettore delle chemochine, CCR7, sono in grado di migrare verso LNs regionali 7, 8. Sembra probabile che il potenziale di migrazione CDCs è anche determinata, almeno in parte, dalla loro posizione anatomica nel polmone. Tuttavia, la localizzazione precisa di queste diverse popolazioni di CDCS nel polmone non è completamente caratterizzato. Una migliore conoscenza della localizzazione delle cellule immunitarie all'interno del polmone, e delle molecole che si dirigono, è necessario per una migliore comprensione del modo in cui il sistema immunitario del polmone si attiva.
PCLS stanno essendo in aumentoly utilizzato come approccio ex vivo per visualizzare posizionamento cellulare e interazioni cellula-cellula, mantenendo l'integrità strutturale dell'architettura polmone 9, 10. PCLS sono stati utilizzati per studiare i polmoni di molte specie, tra cui topi, bovini, scimmie, pecore, cavalli, e gli esseri umani 11. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che circa 20 fette possono essere preparati da un singolo lobo di un polmone mouse, riducendo così il numero di animali necessari per esperimenti singoli. Praticamente tutti i tipi di cellule immunitarie, compresi DC, macrofagi, neutrofili e le cellule T, sono presenti in PCLS e mantenere le loro strutture normali.
PCLS può anche essere usato per studiare calcio di segnalazione e di contrattilità cellule delle vie aeree e muscolari lisce dopo il trattamento con l'acetilcolina 12 o 13 metacolina. In questo approccio, solo una piccola parte del polmone è unalyzed microscopicamente, ma uno studio ha riportato che le misurazioni di contrazione vie aeree in PCLS variano solo circa il 10% da fetta a fetta, e questa variazione è paragonabile a quella osservata utilizzando test di funzionalità polmonare in animali intatti 14. Altri ricercatori hanno utilizzato PCLS come approccio ex vivo per studiare i cambiamenti nei marcatori espressione di citochine e di superficie cellulare dopo incubazione con LPS 15. PCLS sono stati utilizzati anche in un modello ex vivo di vasocostrizione ipossica polmonare nelle piccole arterie intra-acinare. Questi vasi sono situati nella parte del polmone che non può essere raggiunta utilizzando altre procedure, comprese le registrazioni da segmenti arteriosi sezionato o analisi dei vasi subpleuriche 16. Il nostro laboratorio è principalmente utilizzato PCLS di visualizzare la localizzazione delle cellule immunitarie nel tessuto polmonare dal vivo a regime e dopo uno stimolo infiammatorio in vivo. Le procedure che abbiamo sviluppato per questo sono i seguenti.
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Protocol
procedure sperimentali animali descritti in questo documento sono stati approvati dal Comitato di cura e l'uso di animali NIEHS (IACUC).
1. Preparazione Lung
- topi Casa tra 6 e 12 settimane di età in specifiche condizioni esenti da organismi patogeni, in conformità con le linee guida fornite dai comitati Cura e uso istituzionale animali.
NOTA: ripreso topi possono essere sia ingenuo, o trattati, a seconda degli interessi specifici di ogni ricercatore. Qui, descriviamo la localizzazione delle cellule immunitarie nei topi naive e nei topi trattati con 100 mg ovalbumina (OVA) e 0,1 ug lipopolisaccaride (LPS), utilizzando tampone fosfato salino (PBS) come veicolo in un volume totale di 50 microlitri. Instillare oropharyngeally OVA / LPS nelle vie aeree, gli animali sono stati anestetizzati con isoflurano inalazione e verticalmente sospesi dai loro denti con un elastico. La lingua è stata gentilmente afferrato con una pinza e tenuto da un lato per evitare di deglutizione, e 50 & #181; L della soluzione OVA / LPS depositata sul retro della cavità orale come descritto in precedenza 17. - Eutanasia il mouse con iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio (100 mg / kg), e il pin l'animale a base di polistirene.
- Aprire la cavità addominale con forbici per tagliare la pelle e peritoneo dal centro dell'addome fino alla mandibola. Tirare l'intestino parte con una pinza o il bordo sordo delle forbici, e tagliare la vena cava inferiore per drenare il sangue dal polmoni. Perforare la membrana con la punta affilata delle forbici per consentire l'espansione della gabbia toracica, facendo attenzione a non tagliare i polmoni.
- ghiandole salivari chiare e altri tessuti dalla trachea afferrando tessuto e manualmente estraendolo dalla trachea sottostante con una pinza. Fare una piccola incisione nella trachea sul lato anteriore della più grossa banda di cartilagine utilizzando una pinza sottile o forbici, facendo attenzione a non tagliare tutto il percorso anche se il TRAchea. L'incisione sarà abbastanza grande da permettere un ago 20 G di passare attraverso.
- Far scorrere un 1,5 pollici, ago da 20 G in una porzione di tubo di polietilene, lasciando circa 1 cm di tubo oltre l'estremità dell'ago. Tagliare il tubo ad un angolo di circa 45 ° per smussare fine, inserire l'ago di una siringa da 1 ml, e caricare la siringa disegnando 0,8 ml di acqua calda (40 ° C) 2% a basso punto di fusione agarosio attraverso l'ago.
- Posizionare l'estremità del tubo nella incisione della trachea e iniettare lentamente l'agarosio nei polmoni. Senza spostare l'ago o una siringa, la siringa nastro alla base di polistirene per garantire l'ago rimane nella trachea.
NOTA: Dopo l'iniezione, i polmoni sarà più grande e gonfiato all'interno del torace. I lobi giusti espandono prima, poi il lobo sinistro. Se solo lobo espande, l'ago è stato inserito troppo in profondità (oltre il bronchi), e sarà necessario estrarlo leggermente prima di procedere. Questa parte delprocedura deve essere fatto in tempi relativamente brevi, prima che l'agarosio inizia a solidificare. - Posizionare il mouse, con la base e la siringa ancora inserita nella trachea, in una stanza fredda o in frigorifero per almeno 10 minuti. Se necessario, l'animale può essere tenuto lì per diverse ore, anche se di procedere alla migrazione delle cellule immagine in video microscopia.
- Una volta che il mouse è freddo, asportare accuratamente i polmoni agarosio-gonfiato con le forbici, e metterli in un piatto 3 centimetri di ghiaccio PBS freddo. Tenere sul ghiaccio.
- Scegli il lobo desiderata per affettare tessuti (ad esempio, il lobo destro superiore). Assicurarsi che la parte interna del polmone (in cui si collega alla trachea) è a faccia in giù nel piatto.
NOTA: Il lobo utilizzato e il suo orientamento sullo stantuffo determina le dimensioni dei vasi e delle vie aeree che saranno visibili. L'orientamento descritto qui è ideale per la visualizzazione di grandi vie aeree e parenchima. I topi hanno una grande lobo sinistro e quattro lobi più piccoli sulla destra. PerImaging PCLS seguito dell'introduzione di allergeni nei polmoni via orofaringea o intranasale aspirazione, il lobo superiore destro è tipicamente sezionata, in parte perché è una dimensione conveniente, ma anche perché gli agenti inalatori disperdere uniformemente all'interno di esso. Tuttavia, altri lobi, in particolare il lobo sinistro, possono anche essere studiati. Quando si confrontano ceppi di topi o trattamenti, è importante confrontare stesso lobo.
2. Lung affettare
NOTA: Fare fette usando un affettatrice automatizzato, metallo di raffreddamento del blocco, lo stantuffo e la siringa in metallo, secondo le istruzioni del produttore.
- Mettere una piccola goccia di tutti gli usi, senza conduzione gel colla sullo stantuffo e diffondere la colla in un movimento circolare, avendo cura di non lasciare la colla toccare i lati della siringa metallo. Se la colla tocca i lati della siringa, si incollare la siringa e lo stantuffo insieme.
- Subito dopo aver percorso il pistone con colla, afferrare delicatamente illobo asportato con una pinza con il lato trachea giù, tamponare su un tessuto per rimuovere il liquido in eccesso, e con attenzione posizionarlo sulla parte superiore del pistone. Tagliare qualsiasi tessuto supplementare si estende oltre il bordo del pistone.
- Spostare lo stantuffo in modo che i lati della siringa metallo muovono su e sopra il tessuto, creando un pozzo con il polmone incollata al fondo, non più di alcuni centimetri. Nastro intorno alla parte inferiore della siringa di metallo per tenere questa posizione in posizione.
- Versare con cautela 2% agarosio a bassa fusione a 40 ° C nel pozzo in modo che solo copre la parte superiore del lobo.
- Circondano la siringa in metallo con il blocco agghiacciante ghiacciata e raffreddare il lobo e agarosio per 1-2 min.
NOTA: un raffreddamento tempo più breve del agarosio che circonda il tessuto potrebbe portare alla disintegrazione del agarosio durante affettare, che potrebbe risultare in un modo non uniforme PCLS tagliare. - Caricare la siringa campione nel affettatrice automatizzato e riempire il serbatoio tampone con ghiaccio PBS freddo. allineare la passo motorizzazione con la siringa campione e togliere il pezzo di nastro dal fondo. Girare l'interruttore in posizione di avanzamento rapido (FF) finché l'azionamento del motore passo a contatto con il retro del pistone.
- Allineare la lama fresco con la siringa campione. spessore impostato tessuto, continuo / singola fetta, oscillazione e velocità nella affettatrice. Ad esempio, lo spessore del tessuto: 150 pm, taglio continuo (cont.), Oscillazione: 9, e la velocità: 3 - 4. Premere start. Le impostazioni di cui sopra devono essere adeguate alle specifiche caratteristiche affettatrice automatizzati.
- Usando una spatola sottile o pennello, raccogliere il PCLS uno alla volta mentre cadono nel serbatoio tampone e metterli in una piastra a 24 pozzetti contenente ghiaccio PBS freddo.
NOTA: E 'importante tenere le fette al fine di mantenere la coerenza tra esperimenti. Anche se ogni polmone è diversa a seconda dell'età, del sesso e del peso, il 10 ° fetta, per esempio, in genere rendimenti dimensioni simili vie aeree.
- La progettazione di un pannello di anticorpi con tag fluorescenza in base al tipo cellulare di interesse, tenendo conto del potenziale sovrapposizione spettrale fluorescente e le capacità di rilevamento del microscopio.
NOTA: Ad esempio, un pannello per il rilevamento sottoinsieme DC è la seguente: CD11c / alfa X integrina - BrilliantViolet (BV) 605 (eccitazione: 405 nm, picco di emissione: 605 nm), CD324 / E-caderina - Alexa 488 (AF488 ) (eccitazione: 488 nm, emissione di picco: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - ficoeritrina (PE) (eccitazione: 561 nm, emissione di picco: 578 nm), CD103 / alfa E integrina - alloficocianina (APC) (eccitazione: 633 nm , emissione di picco: 660 nm). Fluorescenza strumenti spettatori spettrali (vedi elenco materiali) sono utili per la progettazione di pannelli. - Fare un cocktail di anticorpi che contiene gli anticorpi desiderati.
- Per l'imaging PCLS statico, aggiungere 800 microlitri tampone colorazione, 100 microlitri Fc blocker, 50 microlitri di siero normale di topo, e 50 microlitri di siero normale di ratto in un mL microcentrifu 1.5Tubo gazione per un volume totale di 1 ml. Per cellule vive, utilizzare 800 ml di mezzo Leibovitz (1x) contenente 10% FBS (Leibovitz-10) invece di tampone colorazione.
- Aggiungere anticorpi per regolare una concentrazione finale desiderata di ciascun anticorpo. Trasferire la soluzione di anticorpi ad un piatto 3 cm e mantenere al buio fino al momento dell'uso.
NOTA: Le concentrazioni finali devono essere ottimizzato per ciascun anticorpo (solitamente: 1 - 5 ug / mL).
- Scegliere un PCLS con una superficie anatomica di interesse, come ad esempio grandi vie aeree o periferia del polmone, e posizionare nel piatto 3 cm contenente 1 ml di soluzione di anticorpo.
- PCLS macchia nel buio, su ghiaccio, a dondolo lentamente per 30 o 60 minuti.
- Per l'imaging PCLS statica, procedere alla sezione 4. Per cellule vive, procedere alla sezione 5.
4. statico Imaging di PCLS
- Dopo 60 min di incubazione con anticorpi PCLS, rimuovere la soluzione di anticorpi dal piatto e risciacquare tegli fette due volte con 1 ml di PBS freddo ghiaccio.
- Pipetta 50 microlitri di PBS su un 3 cm rotondo piatto fondo di vetro. Con una spatola o pennello, trasferire i PCLS macchiate al calo, manipolando delicatamente la fetta finché è piatto ed estesa. Rimuovere la PBS con una pipetta. La fetta deve trovarsi più piatta possibile. Le procedure di cui sopra devono essere eseguite rapidamente per evitare photobleaching.
- 1 goccia di temperatura ambiente montante sulla fetta e rilasciare delicatamente un coprioggetto di vetro nel pozzetto della piastra. Mantenere PCLS al buio a 4 ° C per un massimo di un'ora prima di imaging.
- Durante la visualizzazione al microscopio confocale, utilizzare un obiettivo 20X (vedi Materiali List). Utilizzare lo strumento "tegola" per individuare e contrassegnare i bordi del tessuto nell'impostazione "convesso". Ciò contribuirà a ridurre il tempo della scansione piastrelle.
- Mentre impostando l'intervallo z-stack, verificare in più zone della fetta, in particolare lungo i bordi, che gli intervalli impostatisono appropriati.
NOTA: z-gamma sarà probabilmente deve essere maggiore dello spessore del tessuto stesso, perché è molto difficile ottenere il tessuto di fissare completamente piatta. Ad esempio, con un PCLS spessore 150 um, la gamma z-stack probabilmente dovrà essere impostata su 200 - 250 um per ospitare dossi e curve nel slice. A seconda del campo di z-stack e le dimensioni del tessuto, ciascuna scansione completa polmone avrà tra i 7 - 12 ore con un obiettivo 20X. Ciascun polmone è unico e le impostazioni deve essere regolato per ogni esperimento.
5. Cellulare Imaging in diretta di PCLS
- Dopo 30 min di incubazione con anticorpi PCLS, rimuovere la soluzione di anticorpi dal piatto e lavare le fette due volte con 1 mL freddo Leibovitz-10.
- Pipetta 50 microlitri Leibovitz-10 in una fessura di una coprioggetti incamerata (8 slot). Utilizzare una spatola per trasferire i PCLS al mezzo, delicatamente manipolare finché la fetta è piatta ed estesa. Le procedure di cui sopraessere necessario eseguire rapidamente per evitare photobleaching.
- Rimuovere il supporto di 50 microlitri con una pipetta. La fetta è a mentire più piatta possibile.
NOTA: È accettabile se i bordi della fetta siano sollevati verticalmente contro la parete della camera. Inoltre, se disponibile, un peso di metallo platino può essere utilizzata per ancorare la fetta prima di procedere alla fase successiva. Vedere l'Elenco materiali allegato per un esempio di filo di platino che può essere tagliato e piegato in piccoli pesi. - In una cella C 4 °, mescolare 100 ml di fattore di crescita ridotto, fenolo matrice extracellulare aneritro con 100 microlitri Leibovitz-10. Utilizzare punte per pipette pre-raffreddata per questo, o la matrice extracellulare rafforzerà nella punta.
NOTA: Questo rapporto di matrice e media (1: 1) crea un gel denso abbastanza per contenere le PCLS giù in condizioni tessuto-coltura. - pipettare delicatamente la matrice di mescolare, e con attenzione pipetta in cima alle PCLS, facendo in modo che il gel va in cima alla lung fetta, e che la fetta non galleggia sulla superficie del gel. Il gel dovrebbe funzionare come un peso, ancorando i PCLS giù sul fondo della piastra.
- Trasferire accuratamente i coprioggetti camerata in un incubatore a 37 ° e lasciate solidificare la matrice per ~ 5 min.
- Trasferire l'intero coprioggetti camerata sulla fase di pre-riscaldato di un microscopio confocale. Mantenere la camera a 37 ° C durante l'imaging. CO 2 di alimentazione non è necessario durante l'incubazione delle cellule quando si utilizza media di Leibovitz.
- Impostare l'intervallo gamma z-stack e piastrelle base all'intervallo desiderato tra i frame. Durante la visualizzazione al microscopio confocale, utilizzare un obiettivo 20X (vedi Materiali List). Utilizzare la funzione "tile" per indicare l'area di interesse nel tessuto, utilizzando l'impostazione "griglia centrata" (ad esempio, una griglia centrata 2x2).
- Mentre impostando l'intervallo z-stack, verificare in più zone della fetta che gli intervalli impostati sono appropriate.
NOTA: ZRange sarà probabilmente uguale lo spessore del tessuto. Ciascun polmone è unico e le impostazioni deve essere regolato per ogni esperimento. piastrelle 2x2 e 10 z-stack determinerà generalmente ~ 1 telaio / 2 min. Assicurarsi che la funzione di messa a fuoco automatica viene attivata prima di iniziare l'esperimento per ridurre al minimo xy ez-deriva durante il periodo di imaging.
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Representative Results
Per identificare la posizione dei due sottoinsiemi DC, CD11b CDC hi e CD103 + CDC, PCLS da topi C57BL / 6 sono stati tagliati e colorate con anticorpi monoclonali (mAb) specifici per CD11c, CD88, CD103 e CD324 (E-caderina). Anticorpi anti cellule epiteliali CD324 macchia delle vie aeree e CD88 viene visualizzato sui macrofagi e neutrofili, ma non CDC 8. Questo ha permesso di distinguere CDCs da CD11c + macrofagi, e di osservare la relazione spaziale di ciascun tipo cellulare nelle vie aeree (Figura 1). Abbiamo scoperto che CD11b CDC hi localizzano nel parenchima, mentre CD103 + CDCS risiedono principalmente attorno alle vie aeree e la zona subpleurico. Sebbene CD103 + CDCS stati prontamente rilevato attraverso la colorazione diretta di CD103 superficie cellulare in questo esperimento, la rilevazione di CD11b hi CDCs invocata assenza di CD88 e CD103 colorazione. Per identificare direttamente CD11bhi CDC, abbiamo prima cercato di PCLS macchie usando un anti-CD11b mAb (clone M1 / 70), che è ampiamente usato in immunoistochimica e citofluorimetria. Tuttavia, questo mAb aveva un background elevato e bassa specificità in questa applicazione, indipendentemente da quale fluorocromi sono stati coniugati a mAb (Figura 2A, e dati non mostrati). Al contrario, gli anticorpi anti CD172a (SIRP1α) macchiati CD11b hi CDCs 18, ma le cellule non strutturali o CD103 + CDCS (Figura 2B, e dati non mostrati). Di loro, gli anticorpi anti CD172a non riescono a discriminare tra CDC e monociti o macrofagi. Tuttavia, mediante co-colorazione con anticorpi contro CD88 e CD172a, siamo stati in grado di distinguere macrofagi alveolari (CD172a - CD88 +) da macrofagi interstiziali (CD172a + CD88 +), e CD11b CDC hi (CD172a + CD88 -), e mostrano che le ultime cellule preferenzialmente localizzano nelparenchima, non la zona sub-epiteliale (Figura 2C - F), in accordo con i risultati ottenuti con la marcatura indiretta di queste cellule.
Studio della migrazione intra-tessuto di leucociti richiede visualizzazione di cellule strutturali, ivi comprese quelle dei vasi linfatici, attraverso il quale il traffico DC dai tessuti periferici al LNs regionali. Nella pelle e linfonodi, vasi linfatici sono spesso identificati con anticorpi monoclonali per LYVE-1 o Podoplanin. Tuttavia, abbiamo trovato che nel PCLS, mAbs a LYVE-1 e Podoplanin macchia una varietà di altri tipi di cellule, inclusi endotelio vascolare e dell'epitelio alveolare (dati non mostrati). Questi mAbs sono quindi di uso pratico limitato per identificare specificamente vasi linfatici in PCLS. Tuttavia, mAbs a CD90.2 (Thy1.2), un noto marcatore di cellule T, strutture linfatiche etichettati, come mostrato precedentemente in altri tessuti 19, 20 (Figure 3A, B Prox1 21 (figura 3A, C). Prox1 è un fattore di trascrizione maestro che è necessario per linfoangiogenesi 22. Prox1 TdTomato topi transgenici mostrano vasi linfatici fluorescenti brillantemente nei polmoni e altri tessuti, come le cellule del fegato, lente, giro dentato e neuroendocrini del midollo surrenale 21. Infatti, questi due metodi di etichettatura dato pattern di colorazione sovrapposti (Figura 3D). Usando questi approcci etichettatura, siamo stati in grado di determinare che CD103 + CDC erano presenti in diverse aree anatomiche, tra CD324 esprimono epitelio delle vie aeree, i vasi linfatici, e la zona subpleurico (Figura 3A, E).
Oltre all'imaging statico, il movimento delle cellule e cellule di celL interazioni possono essere registrati utilizzando l'imaging cellulare dal vivo di PCLS (Film 1). PCLS erano preparate da topi che avevano ricevuto iniezioni di cellule e instillazione di OVA e LPS OT-II T GFP-esprimere, colorate con anticorpi monoclonali contro CD103 (rosso) e l'epitelio delle vie aeree (CD324, blu), e sono state esposte per monitorare il movimento delle cellule CD103 + CDCs e T 16 h dopo OVA / LPS instillazione. Nel corso del video (4 h), il movimento dinamico CD103 + DC (rosso) e le cellule T specifiche per OVA adoptively trasferiti (verde) e la loro interazione sono chiaramente visibili (Film 1).
Figura 1. distinte sedi anatomiche del CDC Sottoinsiemi come rivelato da PCLS colorazione e microscopia confocale. A) totale PCLS da un greggia C57BL / 6 polmonare topo colorate con vari anticorpi. Il colore della ogni molecola è indicato dal colore del carattere (in alto a destra). Individuali e combinatoria colorazione dà i seguenti colori per i tipi di cellule di interesse: CD103 + CDC (CD103 + CD11c + CD88 -, bianchi), CD11b hi CDC (CD11c + CD103 - CD88 -; rosso), i macrofagi (CD11c + CD88 +; giallo ), neutrofili (CD11c - CD88 +; verde) e cellule epiteliali delle vie aeree (CD324 +, blu). B - D) maggiore ingrandimento degli inserti in A. B) CD11b CDC hi localizzano nel parenchima. C) CD103 + CDCS attorno alle vie aeree. D) CD103 + CDCS sotto la pleura viscerale. barre bianche indicano 50 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La colorazione di cellule dendritiche e macrofagi. A) La colorazione di PCLS con anticorpi anti CD11b (blu) fornisce un elevato background in PCLS. B) Gli anticorpi anti CD172a (verde) hanno uno sfondo relativamente basso in PCLS e una maggiore specificità per le cellule CD11b +. C) totale PCLS di C57BL / 6 topi colorati con mAb cui colore è indicato dal colore del carattere (in alto a destra). CD11c (rosso), CD88 (ciano), CD172a (verde) e CD324 (blu). CD11b CDC hi (CD11c + CD88 - CD172a +, colore giallo), macrofagi alveolari (CD11c + CD88 + CD172a -; rosa), i macrofagi interstiziali (CD11c + CD88 + CD172a +, bianco), neutrofili (CD11c - CD88 +, ciano) e le vie aeree (CD324 +, blu). D - F) maggiore ingrandimento degli insertiraffigurato in C. D) zona sub-pleurica. E) Sub-epiteliale zona. F) interstizio. macrofagi interstiziali localizzano nel parenchima e macrofagi alveolari sono in alveoli. Senza etichetta barre bianche indicano 50 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. L'etichettatura di cellule strutturali in PCLS. A) PCLS interi preparati Prox1 tdTomato topo, e colorate con anticorpi monoclonali per CD90.2 (verde), CD103 (bianco) e CD324 (blu). cellule Prox1 esprimono (rosso) sono geneticamente etichettati con TdTomato sotto la regolazione del promotore Prox1 (Prox1-TdTomato). B - E) maggiore ingrandimento della inserto in
Film 1. T cellule interagiscono con CD103 + CDC nel polmone. Cellule vive di CD103 + CDC (rosso) interagente con cellule T (verde). Cellule T CD4 + isolate da topi OVA-specifici GFP OT-II Nur77 state stimolate con DC spleniche e OVA in vitro, e adoptively trasferite in Rag - / - topo. arguzia 2 ore più tardi, il mouse destinatario è stato trattatoh OVA / LPS instillazione alle vie aeree. 16 ore dopo il trattamento OVA / LPS, PCLS state fatte, macchiati e ripreso per 4 ore a 37 ° C. viene mostrata la registrazione di immagini (min) Tempo. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Il protocollo qui descritto è stato originariamente sviluppato per visualizzare le posizioni dei due sottoinsiemi di CDC all'interno del polmone. Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per studiare diversi tipi di cellule, mantenendo la vitalità delle cellule e l'architettura tridimensionale del polmone. Quest'ultima caratteristica è un importante vantaggio rispetto ai sistemi di coltura cellulare e permette l'identificazione di tipi di cellule rare. Il metodo si basa sulla generazione di PCLS dal polmone, e una combinazione appropriata di anticorpi per identificare i tipi cellulari specifici minimizzando la colorazione di fondo. In larga misura, questo è un esercizio empirica perché gli anticorpi che funzionano bene in altre applicazioni, tra cui la citometria a flusso, non necessariamente funzionano bene per la colorazione PCLS. Abbiamo già compiuto notevoli progressi in questo senso, ma gli investigatori che desiderano studiare tipi di cellule non trattate qui possiamo avere per testare diversi anticorpi e ottimizzare fluorocromi e concentrazioni. Utilizzando il protocollo descritto qui, abbiamo scoperto che CD103 + CDC e CD11b CDC hi risiedono in localizzazioni distinte nel polmone. Allo stato stazionario, CD103 + CDC sono stati rilevati attorno alle vie aeree e nella regione subpleurico, considerando CD11b CDC hi stati trovati principalmente nel parenchima. Anche se il protocollo che descriviamo qui non è adatto per la colorazione molecole intracellulari, è utile per i marcatori di superficie cellulare di imaging, come pure molecole secretorie. Così, siamo stati in grado di rilevare il chemochine, CCL21 e CCL19, in PCLS (dati non mostrati). Se segnali fluorescenti solo deboli sono visti utilizzando anticorpi primari, è possibile utilizzare anticorpi secondari per amplificare tali segnali.
Una sfida importante per lo svolgimento di cellulare dal vivo di video-imaging di PCLS è stato quello di ancorare a sufficienza il tessuto nel terreno di coltura per evitare xy significativo e Z-deriva durante il periodo di microscopia a 4 ore. Per far fronte a questo, abbiamo sperimentatocon differenti rapporti di media Leibovitz alla matrice extracellulare, che è solido a temperatura ambiente, e determinato un rapporto 1: 1 mantenuta una struttura stabile 3D con la vitalità cellulare. Durante l'elaborazione post-immagine, abbiamo anche utilizzato una serie di ImageJ plug-in, chiamato TurboReg e StackReg che eliminano ulteriori xy incidentale o z-shift (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx? id = 18226). Utilizzando lo strumento autofocus del microscopio confocale, la regione di interesse è stato tenuto a fuoco, specialmente nella z-gamma, durante l'intero periodo di scansione. Un'altra sfida durante l'imaging cellulare dal vivo di PCLS utilizzava la scansione di piastrelle, z-stack, serie temporali, e le funzioni di autofocus del microscopio. Per ridurre al minimo il tempo tra ogni frame, un equilibrio deve essere colpito tra il tempo trascorso scansione ogni piastrella. Per ottimizzare il tempo di scansione di ogni progetto di ricerca, il numero di z-stack, piastrelle, e velocità di scansione devono essere adeguate.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Ringraziamo Jeff Tucker, Erica Scappini, e Agnes Janoshazi per il loro aiuto con la microscopia, Ligon Perrow per la sua gestione della colonia del mouse, e Jun Chen e Michael Sanderson per un aiuto con l'affettatrice del tessuto, e Michael Fessler e Derek Cain per la lettura critica di il manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dal ramo intramurale del NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), che è a sua volta sponsorizzato dal Dipartimento di Salute e Servizi Umani.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
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