Summary
我々は、精密カット肺スライス（PCLS）を生成し、肺における種々の免疫細胞型の局在を可視化するために、それらを免疫染色するための方法を記載しています。我々のプロトコルは、種々の条件下で多くの異なる細胞型の位置と機能を可視化するために拡張することができます。
Abstract
アレルゲンおよび病原体を吸入すると、肺の免疫細胞型の様々な複数の変更を誘発します。フローサイトメトリー、免疫細胞上の細胞表面タンパク質の定量分析のための強力な技術であるが、それは、肺内のこれらの細胞の局在および移動パターンに関する情報を提供しません。同様に、走化性アッセイは、in vitroで走化性因子に応答する細胞の可能性を研究するために行うことができますが、これらのアッセイは、完全な肺の複雑な環境を再現していません。これらの前述の技術とは対照的に、肺内の個々の細胞型の位置は、容易に商業的に入手可能な、蛍光タグ付けされた抗体を用いてそれらを染色し、精密カット肺スライス（PCLS）を生成し、共焦点顕微鏡により断面を可視化することにより可視化することができます。 PCLSは生きと固定の両方の肺組織に使用することができ、スライス全体ローブの断面と同じ大きさの領域を包含することができます。我々正常樹状細胞、マクロファージ、好中球、T細胞及びB細胞の異なるタイプ、ならびにリンパ管などの構造細胞、内皮を含む肺における細胞型の多様な位置を視覚化するためにこのプロトコルを使用している、および上皮細胞。細胞が肺内に移動し、定常状態での炎症の間に相互作用どのようなライブ、三次元の肺組織における樹状細胞とT細胞との間のもののような細胞相互作用を視覚化する能力は、明らかにすることができます。そのようなフローサイトメトリーおよび定量的PCRのような他の処置と組み合わせて使用される場合したがって、PCLSは、肺のアレルギー性および炎症性疾患の基礎となる細胞事象の包括的な理解に寄与することができます。
Introduction
このようリポポリサッカライド（LPS）などの炎症誘発性刺激の吸入後、への免疫細胞の協調運動は内、および肺から、そこにあります。例えば、好中球が急速に肺実質や気道に動員されます。また、従来の樹状細胞（cDCを）として知られているいくつかのプロフェッショナル抗原提示細胞は、比較的複雑な移行パターン1,2を受けます。 cDCを、表面マーカーのCD11cのそれらの表示に部分的に基づいて、フローサイトメトリーを用いて同定することができます。 DCの異なるサブセットは、CD103とのCD11b 3の差動表面発現によって区別することができます。吸入抗原を取得すると、いくつかのcDCを、肺を出て、それらが抗原特異的T細胞4にペプチドを提示する場合、肺流入領域リンパ節（LNS）にリンパ管を通って移動します。これは、適応免疫Rの開始における重要な初期のイベントでありますesponses。理由は不明であるが、しかし、吸入抗原を獲得していないすべてのcDCを、肺を残し、そしてこれらの細胞の多くは、数ヶ月5、6のためにその器官にとどまります。単球由来のCD11c +ケモカイン受容体CCR7を欠く細胞は、地域のLN 7,8に移行することができないので、この観察は、部分的に、これらの細胞の発達祖先によって説明することができます。 cDCをの移行の可能性はまた、肺内でのそれらの解剖学的位置によって、少なくとも部分的に決定される可能性が高いようです。しかし、肺におけるcDCを、これらの異なる集団の正確な位置は、完全に特徴付けされていません。肺内、およびそれを指示する分子の免疫細胞局在の改善知識は、肺の免疫系が活性化する方法をよりよく理解するために必要とされています。
PCLSが増加していますLY肺アーキテクチャ9、10の構造的完全性を維持しながら、細胞の位置決めおよび細胞-細胞相互作用を可視化するためのex vivoアプローチとして使用。 PCLSは、マウスを含む多くの種の肺、ウシ、サル、羊、馬、そして人間11を研究するために使用されています。この技術の主な利点は、約20スライスは、それによって個々の実験に必要な動物の数を減少させる、マウス肺の単一葉から調製することができることです。事実上すべてのDC、マクロファージ、好中球、およびT細胞を含む免疫細胞の種類は、PCLS中に存在し、彼らの正常な構造を維持します。
PCLSはまた、アセチルコリン12またはメタコリン13で処理した後カルシウムシグナル伝達および気道平滑筋細胞の収縮性を研究するために使用することができます。このアプローチでは、肺の小部分のみです微視的alyzed、しかし、1つの研究では、PCLSにおける気道収縮の測定はスライスするスライスから約10％しか変動し、この変動がそのまま動物における肺機能検査14を使用して見られるものに匹敵することを報告しました。他の研究者らは、LPS 15とのインキュベーション後にサイトカイン発現および細胞表面マーカーの変化を研究するためのex vivoアプローチとしてPCLSを使用しています。 PCLSも小さいイントラ腺房動脈における低酸素性肺血管収縮のex vivoモデルにおいて使用されてきました。これらの血管は、動脈切開セグメントまたは胸膜下容器16の分析からの記録を含む他の手順を使用して到達できない肺の一部に配置されています。私たちの研究室では、主に、定常状態でのライブ肺組織中の免疫細胞の局在を可視化するためにPCLSを使用し、in vivoでの炎症性刺激を以下ました。次のように我々はこのために開発した手順があります。
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Protocol
このホワイトペーパーで説明する動物実験手順はNIEHS動物実験委員会（IACUC）によって承認されました。
1.肺の調製
- 施設内動物管理使用委員会によって提供されたガイドラインに従い、特定病原体フリーの条件で生後6と12週の間にハウスマウス。
注：画像形成されたマウスは、各研究者の特定の興味に応じて、ナイーブ、または治療のいずれかになります。ここでは、50μLの総容量でビヒクルとしてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて、ナイーブマウスおよび100μgの卵白アルブミン（OVA）及び0.1μgのリポ多糖（LPS）で処置したマウスにおける免疫細胞局在化を記載しています。 oropharyngeally気道にOVA / LPSを植え付けるために、動物をイソフルラン吸入によって麻酔し、垂直にゴムバンドと、その歯によって懸濁させました。舌を穏やかに鉗子で把持し、嚥下を防ぐために、一方の側に保持され、そして50＆＃ました181;以前に17を説明したように、口腔の奥で堆積OVA / LPS溶液のL。 - ペントバルビタールナトリウム（100mg / kg）の腹腔内注射でマウスを安楽死させる、およびポリスチレンベースに動物を固定します。
- ジョーに腹部までの途中から皮膚および腹膜を切断することによりハサミで腹腔を開きます。鉗子やハサミの鈍いエッジに脇腸を引き、離れて肺から血液を排出するために下大静脈を切り取ります。肺を切断しないように注意しながら、胸郭の膨張を可能にするために、はさみの鋭い先端を有する隔膜を穿刺します。
- クリア唾液腺や組織をつかみ、手動ピンセットで根本的な気管からそれを離れて引いて離れて気管から他の組織。 TRAかかわらず、すべての方法をカットしないように注意しながら、細かいピンセットやハサミを使用して、軟骨の最も厚いバンドの前方側の気管に小さな切開を行いますCHEA。切開は20 G針を通過させるのに十分なだけ大きくなります。
- 針の端を越えてチューブの約1cmを残し、ポリエチレンチューブのセクションに1.5インチ、20 G針をスライド。 、端部を面取り1mLのシリンジに針を取り付け、針を介して暖かい（40℃）、2％低融点アガロースアップ0.8mLのを描くことによって、シリンジをロードするために、約45°の角度でチューブを切断します。
- 気管の切開部にチューブの端に置き、ゆっくりと肺にアガロースを注入。針や注射器を移動させることなく、針が気管に残るを保証するために、ポリスチレンベースにシリンジをテープ。
注：注射後、肺は胸の中大きく膨らんだことになります。右のローブは、まず左葉を展開します。唯一のローブは拡大した場合、針は（気管支を過ぎて）あまりにも深く挿入されている、少し先に進む前に、それを引き出すことが必要であろう。のこの部分アガロースが固化を開始する前の手順では、比較的速やかに行う必要があります。 - ベースとは少なくとも10分間、低温室又は冷蔵庫内、気管に挿入シリンジを用いて、マウスを置きます。必要であれば、動物は、ビデオ顕微鏡によって画像の細胞遊走に進む場合でも、数時間までそこに保つことができます。
- マウスは寒いしたら、慎重にハサミを用いてアガロース-膨張肺を切除し、氷冷PBSで3センチの皿に置きます。氷の上に保管してください。
- 組織スライスのために所望の葉（ 例えば 、右上葉）を選択します。肺の内側部分は、（それが気管に接続されている箇所）皿に下向きであることを確認してください。
注：プランジャに使用ローブとその向きが見えるようになり血管及び気道の大きさを決定します。ここで説明するの向きは、大きな気道の可視化、および実質のために理想的です。マウスは、一つの大きな左葉と右の4つの小さなローブを持っています。ためにそれは便利なサイズであるためだけでなく、吸入剤がその中に均一に分散するので、口腔咽頭または鼻腔吸引を介して肺へのアレルゲンの導入後PCLSイメージングは、右上葉は、典型的には部分的に切断されます。しかし、他のローブ、特に左葉には、また、研究することができます。マウス系統または治療を比較するとき、同じ葉を比較することが重要です。
2.肺スライス
注：製造元の指示に従って、自動化されたスライサー、金属冷却ブロック、プランジャと金属注射器を使用してスライスを作成します。
- プランジャー上に万能の小滴、無ランゲル瞬間接着剤を入れて、接着剤は、金属注射器の側面に触れないように注意しながら、円を描くように接着剤を広げます。接着剤が注射器の側面に触れた場合、それは一緒にシリンジプランジャーを接着します。
- すぐに接着剤でプランジャーをカバーした後、そっと握りますダウン気管側をピンセットで摘出したローブは、過剰な液体を除去し、慎重にプランジャーの上に配置する組織でそれを軽くたたきます。プランジャの端を越えて延びる余分な組織を切り落とします。
- 金属シリンジの側面が上に移動し、組織の上になるように作成、ダウンプランジャを移動させるだけでなく深い数センチメートルを超えない、底部に接着肺。場所にこの位置を保持する金属製の注射器の下部の周りにテープ。
- それだけ葉の上部を覆うように注意深くウェルに40℃で2％低融点アガロースを注ぎます。
- 氷冷冷却ブロックと金属シリンジを包囲し、1葉およびアガロース冷却 - 2分。
注：周囲組織アガロース短い時間冷却が不均一に切断PCLSをもたらす可能性がある、スライス間のアガロースの崩壊につながる可能性があります。 - 自動化されたスライサに検体シリンジをロードし、氷冷PBSでバッファータンクを埋めます。揃え検体シリンジでモータ駆動ステップと底部からテープ片を除去します。ステップモータ駆動だけで、プランジャーの背面に接触するまで早送り（FF）の位置にスイッチを入れます。
- 検体シリンジで新鮮な刃を揃えます。スライサーで組織の厚さ、連続/シングルスライス、振動や速度を設定します。例えば、組織の厚さ：150ミクロン、連続切削（続き）、発振：9、及び速度：3 - 4.開始。上記の設定は、特定の自動化されたスライサーの仕様に調整する必要があります。
- 彼らは、バッファタンク内に落下し、氷冷PBSを含む24ウェルプレートに置くように薄いへら又は絵筆を使用して、一度にPCLSものを集めます。
注：これは、実験の間の一貫性を維持するために、スライスを維持することが重要です。すべての肺は、年齢、性別および体重に応じて異なるが、10 番目のスライスは、例えば、一般的に同様のサイズの気道をもたらします。
- 考慮電位蛍光スペクトルの重なりと顕微鏡の検出能力を取って、目的の細胞型に基づいて、蛍光タグ付き抗体のパネルを設計します。
注：以下のような例として、DCサブセットを検出するためのパネルである：のCD11c /アルファXインテグリン - BrilliantViolet（BV）605（励起：405nmでピーク発光：605 nm）を、CD324 / E-カドヘリン - アレクサ488（AF488 ）（励起：488nmのピーク発光：519 nm）を、CD88 / C5Ra1 - フィコエリトリン（PE）（励起：561 nmで、ピーク発光：578 nm）を、CD103 /アルファEインテグリン - アロフィコシアニン（APC）（励起：633nmの、ピーク発光：660nmで）。蛍光スペクトルビューアーツールは、（物質一覧を参照）のパネルを設計するのに有用です。 - 所望の抗体を含む抗体カクテルを作ります。
- 静的PCLSイメージングのために、1.5 mLのmicrocentrifu 800μL染色バッファー、100μLフク・ブロッカー、50μLの正常マウス血清、および50μL正常ラット血清を追加1 mLの総容量のためgation管。生細胞イメージングのため、代わりに染色緩衝液の10％FBS（リーボビッツ-10）を含有する800μLリーボビッツ培地（1X）を使用します。
- 各抗体の所望の最終濃度を調整するために抗体を加えます。 3センチメートル皿に抗体溶液を移し、使用する準備ができるまで暗所に保管してください。
注：（ - 5μg/ mlの通常1）の最終濃度は、個々の抗体のために最適化される必要があります。
- このような大規模な気道または肺の周辺のような関心の解剖学的領域とPCLSを選択し、1 mLの抗体溶液を含有する3 cmのディッシュに入れます。
- 30または60分間ゆっくりとロッキング氷上で暗闇の中でステインPCLS、、。
- 静的PCLSイメージングのため、セクション5に進んで、生細胞イメージングのため部4に進んでください。
PCLS 4.静的イメージング
- 抗体とPCLSの60分間のインキュベーション後、T皿から抗体溶液を除去し、リンス彼は、1 mLの氷冷PBSで二回スライス。
- 3センチメートル丸ガラス底の皿にピペットで50μLのPBS。スパチュラ又は絵筆を使用して、ドロップに染色PCLSを転送する、それが平坦になるまで穏やかにスライスを操作すると広がります。ピペットでPBSを削除します。スライスは、できるだけ平らにする必要があります。上記の手順は、光退色を避けるために、迅速に実行する必要があります。
- スライス上に室温封入剤1滴を置き、静かにプレートのウェルにカバーガラスをドロップ。イメージングの前に時間まで4℃で暗所にPCLSを保管してください。
- 共焦点顕微鏡下で見たときに、（ 材料のリストを参照）20X対物レンズを使用します。 「凸包」設定で組織のエッジを見つけてマークする「タイル」ツールを使用してください。これは、タイルスキャンの時間を減らすのに役立ちます。
- zスタック範囲を設定して、特にエッジに沿って、スライスの複数の領域で確認し、設定された範囲であることが適切です。
注：完全に平らにするための組織を得ることは非常に困難であるため、Z-範囲は、おそらく組織自体の厚さよりも大きくする必要があります。スライスにおけるバンプと曲線を収容するために250ミクロン - 例えば、厚さ150μmPCLSと、zスタックの範囲は、おそらく200に設定する必要があります。 20X対物レンズを用いて12時間 - Zスタックの範囲と組織の大きさに応じて、各フル肺スキャンは7との間がかかります。それぞれの肺は一意であり、設定はすべての実験のために調整しなければなりません。
PCLS 5.ライブセルイメージング
- 抗体とPCLSの30分間のインキュベーション後、皿から抗体溶液を除去し、1mLの冷リーボビッツ-10で二回スライスをすすぎます。
- チャンバーカバーガラス（8つのスロット）のいずれかのスロットに新鮮な50μLリーボビッツ-10ピペット。 、メディアにPCLSを転送するためにヘラを使ってスライスが平らになるまでゆっくりと操作して広がります。上記の手順光退色を避けるために迅速に実行する必要があります。
- ピペットを用いて50μL媒体を削除します。スライスは、できるだけ平らにすることです。
注：スライスのエッジは、チャンバの壁に対して垂直に跳ね上げている場合、それが許容されます。また、可能な場合、金属白金の量は、次のステップに進む前に、スライスを固定するために使用することができます。小さな重みに切断し、曲げることができる白金線の一例として添付資料の一覧を参照。 - 4℃の低温室では、因子低減成長、100μLリーボビッツ-10フェノールレッドを含まない細胞外マトリックスの100μLを混合します。このため、予冷ピペットチップを使用し、または細胞外マトリックスは、先端に固化します。
注：マトリックス及び培地のこの比率（1：1）組織培養条件下でPCLSを押したままにするのに十分稠密なゲルを生成します。 - 穏やかに混合するために行列をピペット、そして慎重にゲルがLUの上に行くことを確認し、PCLSの上にピペットスライスをngの、そしてスライスは、ゲルの上に浮き上がらないこと。ゲルは、プレートの底にダウンPCLSを固定、重みとして働くべきです。
- 慎重に37℃のインキュベーターにチャンバーカバーガラスを転送し、マトリックスは、約5分間固化しましょう。
- 共焦点顕微鏡の予め温めたステージ上に全体的チャンバカバーガラスを転送します。イメージングを通して37℃でチャンバを維持します。ライボビッツメディアを使用するときにCO 2供給は、細胞のインキュベーション中に必要とされていません。
- フレーム間の所望の間隔に基づいてZスタック範囲およびタイル範囲を設定します。共焦点顕微鏡下で見たときに、（材料のリストを参照）20X対物レンズを使用します。 （ 例えば 、2x2の中心グリッド）「を中心とグリッド」の設定を使用して、組織内の関心領域を示すために、「タイル」ツールを使用してください。
- zスタック範囲を設定して、設定された範囲が適切であるスライスの複数の領域で確認。
注：ZRANGEは、組織の厚さを等しくする可能性があります。それぞれの肺は一意であり、設定はすべての実験のために調整しなければなりません。 2×2のタイル10のzスタックは、一般的に/ 2分〜1つのフレームをもたらすであろう。オートフォーカス機能は、撮像期間中に、XYおよびZドリフトを最小限に抑えるために、実験を開始する前に活性化されていることを確認します。
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Representative Results
C57BL / 6マウス由来の2つのDCサブセットの位置、のCD11b HI cDCを及びCD103 + cDCを、PCLSを識別するために切断およびCD11cに特異的なモノクローナル抗体（mAb）で染色し、CD88、CD103、およびCD324（Eカドヘリン）。 CD324染色気道上皮細胞に対する抗体、およびCD88は、マクロファージおよび好中球ではなく、cDCを8に表示されます。これは、私たちはのCD11c +マクロファージからcDCをを区別するために、気道（ 図1）の各細胞型の空間的関係を観察することができました。私たちは、CD103 + cDCを、主に気道と胸膜下領域の周りに存在するのに対し、CD11bのハイテク cDCをが、実質に局在することを発見しました。 CD103 + cDCを、容易に本実験における細胞表面CD103の直接染色により検出されたが、のCD11bの検出がhi cDCをは、CD88及びCD103染色の欠如に依存していました。直接のCD11bを識別するために、HI cDCを、我々は最初に広く、免疫組織化学に使用し、フローサイトメトリーれる抗CD11bモノクローナル抗体（クローンM1 / 70）を用いてPCLSを染色することを試みました。しかし、このモノクローナル抗体は、蛍光色素は、モノクローナル抗体にコンジュゲートされた（ 図2A、およびデータは示さず）にかかわらず、そのうち、本出願で高いバックグラウンドおよび低特異性を有していました。対照的に、CD172a（SIRP1α）に対する抗体はcDCを18 HIのCD11b染色ではなく、構造的、細胞又はCD103 + cDCを（ 図2B、データは示していません）。自分で、CD172aに対する抗体は、cDCをし、単球またはマクロファージを区別することができませんでした。間質マクロファージから（CD172a + CD88 +）、およびCD11bのハイ cDCを（CD172a + CD88 - ） -しかし、CD88及びCD172aに対する抗体との共染色により、我々は肺胞マクロファージ（CD88 + CD172a）を区別することができましたし、ショーをその後者の細胞は、優先的に局在しますこれらの細胞の間接的染色により得られた我々の結果と一致して、 -実質ではなく、サブ上皮面積（F図2C）。
白血球の組織内移行の研究は、地域LNSにリンパ管のものを含む構造の細胞の視覚化、末梢組織から貫通のDCトラフィックを必要とします。皮膚とLNSでは、リンパ管は、多くの場合、LYVE-1またはポドプラニンへのmAbを使用して識別されます。しかし、我々はPCLS、モノクローナル抗体IN-1をLYVE及びポドプラニンは、血管内皮および肺胞上皮を含む他の細胞タイプ（データは示していない）の種々の染色することを見出しました。これらのmAbは、それゆえ、具体的PCLSでリンパ管を識別するための限られた実用的です。 19、20（ 図3A、Bは、他の組織において以前に示されているようしかし、CD90.2（Thy1.2）、周知のT細胞マーカーに対するmAbは、リンパ管構造を標識>）、PROX1プロモーター 21（ 図3A、C）の転写制御下に導入遺伝子によってコードされるTdTomato蛍光タンパク質を行ったように。 PROX1はリンパ管22に必要なマスター転写因子です。 PROX1 TdTomatoトランスジェニックマウスは、副腎髄質21の肝臓、レンズ、歯状回および神経内分泌細胞などの肺および他の組織における明るい蛍光リンパ管を示します。実際、これらの二つの標識方法は、重複染色パターン（ 図3D）を得ました。これらの標識アプローチを使用して、我々は、CD103 + cDCをがCD324を発現気道上皮、リンパ管、及び胸膜下面積（ 図3A、E）を含むいくつかの解剖学的領域に存在したことを決定することができました。
CELに静的イメージング、細胞運動および細胞に加えL相互作用はPCLS（ 動画1）の生細胞イメージングを用いて記録することができます。 PCLSは、新たにGFPを発現するOT-II T細胞およびOVA及びLPSの点滴、CD103に対するmAbで染色した（赤色）および気道上皮（CD324、青）の注射を受けたマウスから調製し、そして追跡するために画像化しましたCD103 + cDCを、およびT細胞の移動OVA / LPS点滴注入後の16時間。ビデオ（4時間）かけて、CD103 +樹状細胞（赤）及び養子移入OVA特異的T細胞（緑色）との相互作用の動的移動がはっきりと見える（ 動画1）です。
PCLS染色および共焦点顕微鏡によって明らかにされたのcDCサブセットの1明確な解剖学的位置を図。 A）種々の抗体で染色した未処置C57BL / 6マウスの肺からの全PCLS。の色各分子は、そのフォント色（右上）で示されています。 CD103 + cDCを（CD103 +のCD11c + CD88 - ;白）のCD11b HI cDCを（のCD11c + CD103 - CD88 - ;赤）、マクロファージ（のCD11c + CD88 +;黄色：個人と組み合わせ染色は、目的の細胞型のための次の色を与えます）、好中球（のCD11c - CD88 +;緑色）および気道上皮細胞（CD324 +;青）。 B - D）Aでのインセットの高倍率。 B）のCD11b HI cDCをは実質に局在します。気道の周りC）CD103 + cDCを。内臓胸膜下D）CD103 + cDCを。白いバーは50μmで表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
樹状細胞やマクロファージの図2.染色。 A）のCD11b（青）に対する抗体とPCLSの染色はPCLSで高いバックグラウンドを与えます。 B）CD172a（緑）に対する抗体はPCLSが比較的低いバックグラウンドとのCD11b +細胞に対してより高い特異性を有します。 C）その色、フォント色（右上）で示されるmAbで染色したC57BL / 6マウスの全PCLS。 CD11c（赤）、CD88（シアン）、CD172a（緑）、CD324（青）。 CD11b HI cDCを（のCD11c + CD88 - CD172a +;イエロー）、肺胞マクロファージ（のCD11c + CD88 + CD172a - ;ピンク）、間質マクロファージ（のCD11c + CD88 + CD172a +;白）、好中球（のCD11c - CD88 +;シアン）と気道（CD324 +;青）。 D - F）インセットの高倍率Cに示されています。 D）サブ胸膜領域。 E）サブ上皮エリア。 F）間質。間質マクロファージは実質に局在し、肺胞マクロファージは肺胞です。ラベルのない白いバーは50μmで表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
PCLSにおける構造セルの図3標識。 A）全PCLSはPROX1 tdTomatoマウスから調製し、CD90.2（緑）、CD103（白）及びCD324（青）に対するmAbで染色しました。 PROX1発現細胞（赤色）は、遺伝的にPROX1プロモーター（PROX1-TdTomato）の調節下TdTomatoで標識されます。 B - E）の挿入図の高倍率
映画1. T細胞は、肺の中のCD103 + cDCをとの対話します。 T細胞（緑色）と相互作用するCD103 + cDCを（赤）の生細胞イメージング。 OVA特異的OT-II Nur77のGFPマウスから単離したCD4 + T細胞は、in vitroでの脾臓DCおよびOVAで刺激し、そして養子ラグに移した- / -マウス。 2時間後、レシピエントマウスを処理したウィット気道にH OVA / LPS点滴注入。 16時間OVA / LPS処理後、PCLSは、製染色し、37°Cで4時間画像化しました。時間記録画像（分）が示されています。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 （ダウンロードするには右クリックします。）
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、もともと肺内cDCをの2つのサブセットの位置を視覚化するために開発されました。しかしながら、このプロトコルは、容易に細胞の生存率および肺の三次元構造を維持しながら、多くの異なる細胞型を研究するために適合させることができます。後者の特徴は、細胞培養システムを超える重要な利点であり、希少細胞タイプの識別を容易にします。この方法は、バックグラウンド染色を最小限に抑えながら、特定の細胞型を同定するために肺からPCLSの生成、および抗体の適切な組み合わせに依存しています。大方の場合、これは、フローサイトメトリーなど、他のアプリケーションではうまく機能した抗体は、必ずしもPCLSを染色するためにうまく機能しないので、経験的な運動です。我々はすでに、この点でかなりの進歩を遂げているが、ここでは取り上げていない細胞型を勉強したいの研究者らは、異なる抗体をテストし、蛍光色素および濃度を最適化する必要があります。 ここに記載されているプロトコルを使用して、我々は、CD103 + cDCをとのCD11b HI cDCを、肺における個別のローカライズに存在することがわかりました。 CD11b HI cDCを、主として柔組織で発見されたのに対し、定常状態で、CD103 + cDCをは、気道の周囲及び胸膜下領域で検出されました。私たちはここで説明するプロトコルは、細胞内分子を染色するのに適していないですが、それはイメージング細胞表面マーカーと同様に、分泌分子のために有用です。したがって、我々はPCLSに、ケモカインCCL21およびCCL19を検出することができた（データは示さず）。弱い蛍光シグナルを一次抗体を使用して見ている場合、これらの信号を増幅するために二次抗体を使用することが可能です。
PCLSの生細胞ビデオイメージングを行う主な課題は、十分に4時間顕微鏡期間中有意なXY-およびzドリフトを防止するために、培地中の組織を固定することでした。これに対処するために、我々は実験しました別室温で固体である細胞外マトリックスへリーボビッツ培地の比率、及び決定と1：1の比は、細胞生存率と安定した、3次元構造を維持しました。画像処理後の間に、我々はまた、任意の追加の付帯XYまたはZシフト（http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspxを排除TurboRegとStackReg呼ばImageJのプラグインのシリーズを利用しますか？ ID = 18226）。共焦点顕微鏡のオートフォーカスツールを使用して、関心領域全体の走査期間の間、特にZ-範囲で、焦点に維持しました。 PCLSのライブセルイメージングの間にもう一つの課題は、顕微鏡のタイルスキャン、zスタック、時系列、およびオートフォーカス機能を利用しました。各フレーム間の時間を最小限に抑えるために、バランスは各タイルのスキャンに費やした時間の間で打たなければなりません。各研究プロジェクトでスキャン時間を最適化するために、zスタックの数、タイル、及び走査速度を調整する必要があります。
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Disclosures
著者は、宣言するために利害関係のありません。
Acknowledgments
私たちは顕微鏡で彼らの助けのためにジェフ・タッカー、エリカ・スカッピーニ、およびアグネス・ジャノシャジ感謝の重要な読書のためのマウスコロニーの彼女の管理のためのリゴン・ペロー、およびジャン・チェン、マイケル・サンダーソン組織スライサーとの助けのため、そしてマイケル・フェスラーとデレク・カイン原稿。この作品は、今度は保健社会福祉省が主催してNIEHS、NIH（ZIA ES102025-09）、学内の枝によって賄われていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
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