Summary
Мы опишем способ генерации ограненных легких ломтиков (PCLS) и иммунным их визуализировать локализацию различных типов иммунных клеток в легких. Наш протокол может быть расширен, чтобы визуализировать расположение и функции различных типов клеток при различных условиях.
Abstract
Вдыхание аллергенов и патогенов вызывает множественные изменения в различных типах клеток иммунной системы в легких. Проточная цитометрия представляет собой мощный метод количественного анализа белков клеточной поверхности на иммунных клетках, но это не дает никакой информации о локализации и миграции моделей этих клеток в легких. Точно так же, хемотаксис анализы могут быть выполнены , чтобы изучить потенциал клеток реагировать на хемотаксис факторов в лабораторных условиях , но эти анализы не воспроизводят сложную среду интактного легкого. В отличии от этих вышеупомянутых методов, расположение отдельных типов клеток в легких может быть легко визуализирует путем генерирования ограненных легкие ломтиков (PCLS), окрашивая их с коммерчески доступными, флуоресцентно мечеными антителами, и визуализации разделов с помощью конфокальной микроскопии. PCLS может быть использован как для жизни и фиксированной легочной ткани, а срезы могут включать в себя области, как большой, как поперечное сечение всей доли, Мы использовали этот протокол, чтобы успешно визуализировать расположение самых разнообразных типов клеток в легких, в том числе различных типов дендритных клеток, макрофагов, нейтрофилов, Т-клеток и В-клеток, а также в качестве структурных элементов, таких как лимфатической, эндотелиальной и эпителиальные клетки. Способность визуализировать клеточные взаимодействия, такие как те, между дендритных клеток и Т-клеток, в живом, трехмерном легочной ткани, может показать, как клетки перемещаются в легких и взаимодействуют друг с другом в равновесном состоянии и во время воспаления. Таким образом, при использовании в сочетании с другими процедурами, такими как проточной цитометрии и количественной ПЦР, PCLS может способствовать всестороннему пониманию клеточных событий, которые лежат в основе аллергических и воспалительных заболеваний легких.
Introduction
После ингаляции провоспалительных стимулов, таких как липополисахарид (LPS), существует согласованное движение иммунных клеток в пределах, и из легких. Например, нейтрофилы быстро набраны в паренхиме легких и дыхательных путей. Кроме того, некоторые профессиональные антиген - представляющие клетки , известные как обычные дендритные клетки (CDCs) подвергаются относительно сложная модель миграции 1, 2. CDCs может быть идентифицирован с использованием проточной цитометрии, частично на основе их отображениях поверхностного маркера, CD11c. Четкие подмножества РС можно выделить с помощью дифференциальной поверхностной экспрессии CD103 и CD11b 3. После приобретения вдыхаемого антигена, некоторые CDCs выхода из легкого и мигрируют через лимфатические сосуды в легкое осушении лимфатических узлов (LNS) , где они представляют пептиды антиген-специфических Т - клеток 4. Это критическое раннее событие в инициации адаптивного иммунного гesponses. По неизвестным причинам, однако, не все ЦХБ, приобретающие ингаляционные антигены оставить легких, и многие из этих клеток остаются в этом органе в течение нескольких месяцев 5, 6. Это наблюдение может быть частично объяснено родословной развития этих клеток , поскольку моноцитов CD11c + клетки , лишенные рецептора хемокинов, CCR7, не могут мигрировать в региональных лимфоузлов 7, 8. Вполне вероятно, что миграция потенциал ЦХБ также определяется, по крайней мере, частично, по их анатомическому положению в легких. Однако точная локализация этих различных популяций ЦХБА в легком, характеризуется не полностью. Расширение знаний о локализации иммунных клеток в легких, а также молекул, которые направляют его, необходимо для лучшего понимания того, как иммунная система легкого становится активированной.
PCLS в настоящее время растетLY используется в качестве подхода экс виво для визуализации клеточного позиционирования и межклеточных взаимодействий, при сохранении структурной целостности архитектуры легких 9, 10. PCLS был использован для изучения легких многих видов, включая мышей, крупный рогатый скот, обезьяна, овца, лошадь и человек 11. Главным преимуществом этого метода является то, что приблизительно 20 ломтики могут быть получены из одной доли легкого мыши, тем самым уменьшая количество животных, необходимых для отдельных экспериментов. Практически все типы клеток иммунной системы, в том числе РСК, макрофагов, нейтрофилов и Т-клеток, присутствуют в PCLS и поддерживать свои нормальные структуры.
PCLS также может быть использована для изучения сигналов кальция и сократимости дыхательных путей и клеток гладких мышц после лечения с помощью ацетилхолина 12 или 13 метахолина. При таком подходе, лишь небольшая часть легких являетсяalyzed микроскопически, но одно исследование показало , что измерения сокращения дыхательных путей в PCLS изменяются только около 10% от среза , чтобы срез, и эта разница сравнима с таковым с использованием тестов функции легких у интактных животных 14. Другие исследователи использовали PCLS как экс виво подхода для изучения изменений в экспрессии цитокинов и поверхностных маркеров клеток после инкубации с LPS 15. PCLS также были использованы в качестве экс виво модели гипоксической легочной вазоконстрикции в небольших внутрикорпоративных ацинарной артерий. Эти сосуды расположены в той части легких , которые не могут быть достигнуты с использованием других процедур, в том числе записей из вскрытых артериальных сегментов или анализа субплеврально сосудов 16. Наша лаборатория в основном используется для визуализации PCLS локализации иммунных клеток в живой ткани легкого в устойчивом состоянии и следующую воспалительный стимулом в естественных условиях. Процедуры, которые мы разработали для этого следующие.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животные экспериментальные процедуры, описанные в этой статье, были одобрены Animal Care и использования комитетом NIEHS (IACUC) путем.
1. Приготовление легких
- домовые мышей в возрасте от 6 до 12-недельного возраста в конкретных патогене условий в соответствии с указаниями по уходу и использованию комитетов Институциональных животных.
Примечание: изображаемой мыши могут быть либо наивны, либо лечение, в зависимости от конкретных интересов каждого исследователя. Здесь мы описываем локализацию иммунных клеток в нативных мышей и у мышей, получавших 100 мкг овальбумина (ОВА) и 0,1 мкг липополисахарида (LPS), с использованием забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в качестве транспортного средства в общем объеме 50 мкл. Для того, чтобы привить oropharyngeally OVA / LPS в дыхательные пути, животных анестезировали изофлуран вдыхании и вертикально подвешивали их зубов с помощью резиновой ленты. Язык осторожно захватили пинцетами и держали в одну сторону, чтобы предотвратить глотание, и 50 & #181; л раствора ОВА / LPS , депонированной в задней части ротовой полости , как описано выше 17. - Эвтаназии мыши с внутрибрюшинным введением пентобарбитала натрия (100 мг / кг), и прикрепить животное к основанию полистирола.
- Открыть брюшную полость с помощью ножниц, разрезав кожу и брюшину от середины живота до челюсти. Потяните кишок в сторону пинцетом или тупой край ножниц и отсечь нижнюю Вена Кава стечь кровь от легких. Прокол диафрагму с острым кончиком ножниц, чтобы обеспечить расширение грудной клетки, стараясь не порезать легкие.
- Четкие слюнные железы и другие ткани от трахеи, захватывая ткань и вручную, потянув ее от подстилающей трахеи пинцета. Сделайте небольшой надрез в трахее на передней стороне толстой полосы хряща с использованием тонких щипцов или ножницы, стараясь не порезать весь путь хотя трдеше. Разрез будет достаточно большим, чтобы позволить 20 G иглы, чтобы пройти.
- Авто 1,5 дюйма, 20 г иглы на участок полиэтиленовой трубы, в результате чего около 1 см трубки за пределами конца иглы. Вырезать трубки под углом приблизительно 45 ° к скос конец, присоединить иглу к 1 мл шприца, и загружают в шприц, опираясь на 0,8 мл теплой (40 ° С) 2% низкой температурой плавления агарозы через иглу.
- Поместите конец трубки в разрез трахеи и медленно вводят агарозы в легких. Без перемещения иглы или шприца, шприц ленты к основанию полистирола, чтобы гарантировать, что игла остается в трахее.
ПРИМЕЧАНИЕ: После инъекции, легкое будет больше и накачивал в груди. Правильные мочки расширение первой, а затем левую мочку. Если только один лепесток расширяется, игла вставлена слишком глубоко (в прошлом бронха), и это будет необходимо, чтобы вытащить его немного, прежде чем продолжить. Эта частьПроцедура должна быть сделано относительно быстро, до агарозном начинает затвердевать. - Поместите мышь, с основанием и шприц все еще вставленной в трахею, в холодной комнате или холодильнике в течение по крайней мере 10 мин. При необходимости, животное может быть там в течение нескольких часов, даже если перейти к миграции изображений клеток с помощью видео микроскопии.
- После того, как мышь холодно, тщательно иссечь агарозный-надутый легкие с помощью ножниц, и поместить их в 3-см чашки с охлажденным льдом PBS. Держите на льду.
- Выберите нужную лопасть для нарезания ткани (например, правая верхняя лепестки). Убедитесь, что внутренняя часть легких (где она соединяется с трахеей) лицевой стороной вниз в блюдо.
Примечание: лопасть используется и его ориентация на поршень будет определять размер сосудов и дыхательных путей, которые будут видны. Ориентация описано здесь идеально подходит для визуализации больших дыхательных путей и паренхимы. Мыши имеют один большой левый лепесток и четыре меньших долей на праве. ДляPCLS визуализация после введения аллергенов в легкие через ротоглотку или интраназальную аспирацию, правая верхняя лопасть, как правило, в разрез, частично потому, что это удобный размер, но также и потому, что ингаляционные агенты расходятся равномерно внутри него. Однако другие доли, особенно в левой доле, также могут быть изучены. При сравнении штаммов мыши или лечения, важно сравнить же мочку.
2. Lung нарезка
ПРИМЕЧАНИЕ: ломтиков с использованием автоматизированной резки, металлический блок охлаждения, поршень и металлический шприц, в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Положите небольшую каплю универсального, не работайте гель суперклей на поршень и распространить клей в круговом движении, следя за тем, чтобы не позволить клею касаться сторон металлического шприца. Если клей касается сторон шприца, он будет клеить шприц и плунжер вместе.
- Сразу же после того, как покрытие на поршень с клеем, аккуратно объятьвырезают лопасть с щипцами со стороной вниз трахеи, мазок его на ткани, чтобы удалить лишнюю жидкость, и осторожно поместить его на верхней части плунжера. Обрежьте любую дополнительную ткань, проходящую за пределы края плунжера.
- Переместите поршень вниз так, чтобы стороны металлического шприца двигаться вверх и через ткань, создавая хорошо с легким приклеено на дне, не более чем на несколько сантиметров в глубине. Лента вокруг нижней части металлического шприца, чтобы удержать эту позицию на месте.
- Осторожно влить 2% агароз с низкой температурой плавления при 40 ° C в скважину так, он просто покрывает верхнюю часть лепестка.
- Объемный металлический шприц с охлажденным льдом охлаждения блока и охладить мочку и агарозы в течение 1 - 2 мин.
Примечание: Более короткое время охлаждение агарозов, окружающих ткань может привести к распаду агарозов во время нарезки, что может привести к неравномерно вырезать PCLS. - Нагрузка образца шприца в автоматизированных ломтерезки и заполнить буферную емкость со льдом холодной PBS. Совместите Шаговый двигатель привода с образцом шприца и удалить кусок ленты от дна. Поверните переключатель в положение быстрой перемотки вперед (FF), пока приводной двигатель шаг не коснется задней части плунжера.
- Выравнивание свежего лезвия с образцом шприцем. Толщина Набор ткани, непрерывный / одиночный срез, колебание и скорость в ломтерезки. Например, толщина ткани: 150 мкм, непрерывная резка (продолжение.), Колебание: 9, и скорость: 3 - 4. Нажмите старт. Приведенные выше параметры должны быть скорректированы с учетом конкретных автоматизированных спецификаций среза.
- С помощью тонкой шпатель или кисть, собирать PCLS один в то время, как они попадают в буферную емкость и поместите их в 24-луночный планшет, содержащий ледяной PBS.
Примечание: Важно, чтобы держать ломтики для того, чтобы обеспечить согласованность между экспериментами. Хотя каждый легких отличается в зависимости от возраста, пола и веса, 10 - й срез, например, обычно дает аналогичные размеры дыхательные пути.
- Дизайн панели флуоресцентно меченых антител на основе типа клеток, представляющих интерес, принимая во внимание потенциальную флуоресцентного спектра перекрытия и возможности обнаружения микроскопа.
Примечание: В качестве примера, панель для обнаружения подмножества DC выглядит следующим образом: CD11c / альфа-Х-интегрин - BrilliantViolet (BV), 605 (возбуждение: 405 нм, пик излучения: 605 нм), CD324 / Е-кадгерин - Alexa 488 (AF488 ) (возбуждение: 488 нм, пик излучения: 519 нм), CD88 / C5Ra1 - фикоэритрин (РЕ) (возбуждение: 561 нм, пик излучения: 578 нм), CD103 / альфа-Е-интегрин - аллофикоцианин (АРС) (возбуждение: 633 нм , пик излучения: 660 нм). Флуоресцентные спектральные инструменты просмотра (см список материалов) полезны для разработки панелей. - Сделать коктейль антитела, содержащего желаемые антитела.
- Для статического PCLS визуализации, добавьте 800 мкл окрашивающего буфера, 100 мкл Fc-блокатор, 50 мкл нормальной мышиной сыворотки и 50 мкл сыворотки крыс нормальная к 1,5 мл microcentrifugation трубка для общего объема 1 мл. Для получения изображений живых клеток, используют 800 мкл среды Лейбовиц (1x), содержащей 10% FBS (Лейбовиц-10) вместо окрашивания буфера.
- Добавьте антитело отрегулировать желаемую конечную концентрацию каждого антитела. Переносят раствор антител к 3 см чашку, и держать в темноте, пока готов к использованию.
Примечание: Конечные концентрации должны быть оптимизированы для каждого отдельного антитела (как правило, 1 - 5 мкг / мл).
- Выберите PCLS с анатомической области, представляющей интерес, таких как крупных дыхательных путей или периферии легких, и поместите в 3-см чашку, содержащую 1 мл раствора антител.
- Пятно PCLS в темноте, на льду, качалки медленно, в течение 30 или 60 мин.
- Для статического PCLS изображений, перейдите к разделу 4. Для получения изображений живых клеток, перейдите к разделу 5.
4. Статическое Визуализация PCLS
- Через 60 мин инкубации с антителами PCLS, удалить раствор антител из чашки и полоскание тон разрезает дважды 1 мл охлажденного льдом PBS.
- Пипетка 50 мкл PBS, на 3 см круглого стеклянного дна блюда. С помощью шпателя или кисти, передать окрашивали PCLS в капли, осторожно манипулируя кусочек, пока он не является плоской и распространяться. Удалить PBS с пипеткой. Срез должен лежать как можно более плоским. Вышеуказанные процедуры должны быть выполнены быстро, чтобы избежать фотообесцвечивания.
- Поместите 1 каплю комнатной температуры монтажной среды на срез и аккуратно опустить покровное стекло в лунку планшета. Хранить PCLS в темноте при 4 ° С в течение до одного часа до обработки изображений.
- При просмотре под конфокальной микроскопии, использовать объектив 20X (см список материалов). Используйте «плитки» инструмент, чтобы найти и пометить края ткани в условиях «выпуклая оболочка». Это поможет сократить время плитки сканирования.
- В то время как установки диапазона Z-стека, проверить на нескольких участках среза, особенно по краям, что множество диапазоновподходят.
Примечание: Z-диапазон, вероятно, должен быть больше, чем толщина самой ткани, потому что это очень трудно получить ткань лежать совершенно плоской. Например, с толстым PCLS 150 мкм, диапазон Z-стека, вероятно, должен быть установлен до 200 - 250 мкм для размещения ударов и кривые в срезе. В зависимости от диапазона г-стека и размера ткани, каждый полное сканирование легких будет принимать от 7 - 12 ч с целью 20Х. Каждое легкое является уникальным и настройки должны быть скорректированы для каждого эксперимента.
5. Живая Cell Визуализация PCLS
- Через 30 мин инкубации с антителами PCLS, удалить раствор антител из тарелки и промыть ломтики дважды 1 мл холодного Лейбовиц-10.
- Пипетка свежий 50 мкл Лейбовиц-10 в один слот из патроннике покровного стекла (8 слотов). Используйте лопаточку, чтобы передать PCLS в среду, осторожно манипулируя его, пока срез не является плоской и распространяться. Описанные выше процедурыдолжны быть выполнены быстро, чтобы избежать фотообесцвечивания.
- Удалите 50 мкл среды с помощью пипетки. Срез лежать как можно ровнее.
Примечание: Это приемлемо, если края среза перевернуты вертикально вверх по отношению к стенке камеры. Кроме того, если имеется, металл вес платины может быть использован, чтобы закрепить срез, прежде чем перейти к следующему шагу. См.прикрепленные Материалы Список для одного примера платиновой проволоки, которые можно вырезать и согнуть в грузики. - В 4 ° C холодной комнате, смешать 100 мкл фактора роста с пониженным содержанием фенола, бескрасным внеклеточного матрикса с 100 мкл Лейбовиц-10. Используйте предварительно охлажденные наконечники для этого, или внеклеточного матрикс затвердевает в наконечнике.
Примечание: Это отношение матрицы и среды (1: 1) создает гель достаточно плотным, чтобы держать PCLS вниз в условиях тканевой культуры. - Аккуратно пипетка матрицы для смешивания и тщательно пипетка на вершине PCLS, убедившись, что гель идет поверх лунг ломтика, и что срез не всплывает на верхней части геля. Гель должен работать как вес, анкеровка PCLS вниз на нижнюю части пластины.
- Аккуратно перенести камерных покровного стекла до 37 ° С инкубатор и пусть матрица затвердеть в течение ~ 5 мин.
- Перенесите весь камерных покровного стекла на подогретые стадии конфокальной микроскопии. Поддерживать камеру при 37 ° С в течение визуализации. Подачи СО 2 не требуется во время инкубации клеток при использовании среды Лейбовиц.
- Установите диапазон диапазона Z-стека и плитки на основании требуемого интервала между кадрами. При просмотре под конфокальной микроскопии, использовать объектив 20X (см список материалов). Используйте «мозаичный» инструмент , чтобы обозначить область интереса в ткани, используя настройку « по центру сетки» (например, 2х2 по центру сетки).
- В то время как установки диапазона Z-стека, проверить на нескольких участках среза, что множество диапазонов могут быть применены.
Примечание: зрАнж, скорее всего, равна толщине ткани. Каждое легкое является уникальным и настройки должны быть скорректированы для каждого эксперимента. 2x2 плитка и 10 Z-стеки обычно приводят к ~ 1 кадр / 2 мин. Убедитесь, что функция автофокуса включена перед началом эксперимента, чтобы свести к минимуму х и г-дрейфу в период формирования изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того, чтобы определить местоположение двух подмножеств DC, CD11b привет CDCs и CD103 + CDCs, PCLS от мышой C57BL / 6 были сокращены и окрашивали с моноклональными антителами (моноклональные антитела) , специфичными к CD11c, CD88, CD103, CD324 и (Е-кадгерин). Антитела к CD324 Пятно эпителиальными клетками дыхательных путей, а также CD88 отображается на макрофагов и нейтрофилов, но не CDCs 8. Это позволило нам отличить CDCs от CD11c + макрофагов, и наблюдать пространственное соотношение каждого типа клеток в дыхательные пути (рисунок 1). Мы обнаружили , что CD11b привет CDCs локализации в паренхиме, в то время как CD103 + CDCs располагаются в основном вокруг дыхательных путей и субплевральной области. Несмотря на то, CD103 + CDCs были легко обнаружить путем прямого окрашивания клеточной поверхности CD103 в этом эксперименте, обнаружение CD11b привет CDCs полагались на отсутствие CD88 и CD103 окрашивания. Для того, чтобы непосредственно идентифицировать CD11bпривет CDCs, мы сначала попытались пятно PCLS с использованием анти-CD11b мАт (клон M1 / 70), который широко используется в иммуногистохимии и проточной цитометрии. Однако, это моноклональное антитело имело высокий фон и низкую специфичность в данной заявке, независимо от того , флуорохромов были конъюгированы с монАТ (фиг.2О, и данные не показаны). В отличие от этого , антитела к CD172a (SIRP1α) окрашивали CD11b привет CDCs 18, но не структурные элементы или CD103 + CDCs (фигура 2В, и данные не показаны). Сами по себе антитела к CD172a не могли различить ЦХБ и моноциты или макрофаги. Тем не менее, путем совместного окрашивания с антителами против CD88 и CD172a, мы смогли различить альвеолярные макрофаги (CD172a - CD88 +) , из интерстициальных макрофагов (CD172a + CD88 +), и CD11b привета CDCs (CD172a + CD88 -) и показать , что последние клетки преимущественно локализуются впаренхимы, а не суб-эпителиальной области (фиг.2С - F), в соответствии с нашими результаты , полученные путем косвенного окрашивания этих клеток.
Исследование миграции внутри тканей лейкоцитов требует визуализации структурных элементов, в том число лимфатических, через который РС трафик от периферических тканей к региональным LNs. В коже и LNs, лимфатические сосуды часто идентифицируют с использованием мАта к LYVE-1 или Podoplanin. Тем не менее, мы обнаружили, что в PCLS, мАт к LYVE-1 и Podoplanin окрашивать различные другие типы клеток, в том числе эндотелий сосудов и альвеолярного эпителия (данные не показаны). Эти MAT поэтому имеет ограниченное практическое применение специально для выявления лимфатических сосудов в PCLS. Тем не менее, моноклональные антитела к CD90.2 (Thy1.2), хорошо известной Т - клеточного маркера, меченных лимфатических структур, как было показано ранее в других тканях 19, 20 (фиг 3A, B Prox1 21 (фиг 3А, С). Prox1 является мастер - фактор транскрипции , который необходим для лимфангиогенеза 22. Prox1 TdTomato трансгенные мыши обнаруживают яркие флуоресцентные лимфатические сосуды в легких и других тканей , таких как печень, линзы, зубчатую извилину и нейроэндокринных клеток мозгового вещества надпочечников 21. Действительно, эти два способа маркировки дали перекрывающиеся паттерны окрашивания (рис 3D). Используя эти подходы к маркировке, мы смогли определить , что CD103 + CDCs присутствовали в нескольких анатомических областях, включая CD324-экспрессирующую эпителии дыхательных путей, лимфатические, и субплевральную область (рис 3А, Е).
В дополнение к статической визуализации, движения клеток и клетки CELл взаимодействие может быть записано с использованием живых клеток визуализации PCLS (Movie 1). PCLS были свежеприготовленный из мышей, которые получали инъекции GFP-экспрессирующих ОТ-II Т-клеток и закапывания OVA и LPS, окрашивали мАт против CD103 (красного цвета) и эпителий дыхательных путей (CD324, синий), и были обследованы, чтобы отслеживать движение CD103 + CDCs и Т - клеток после 16 ч ОВА / LPS инстилляции. В течение видео (4 ч), динамическое движение CD103 + РС (красного цвета) и восприимчиво переданных OVA-специфических Т - клеток (зеленый) и их взаимодействия четко видны (Фильм 1).
Рисунок 1. Distinct Анатомические Местоположения Cdc подмножествах как показали PCLS Окрашивание и конфокальной микроскопии. А) Весь PCLS из необработанной C57BL / 6 легких мышей окрашивали различные антитела. Цвет каждая молекула обозначена своим цветом шрифта (вверху справа). Индивидуальное и комбинаторное окрашивание дает следующие цвета для типов клеток , представляющего интереса: CD103 + CDCs (CD103 + CD11c + CD88 -; белых), CD11b привет CDCs (CD11c + CD103 - CD88 -; красный), макрофаги (CD11c + CD88 +, желтыми ), нейтрофилы (CD11c - CD88 +; зеленый) и эпителиальные клетки дыхательных путей (CD324 +, синий). Б - Д) Высшее увеличение вставок в A. Б) CD11b Привет CDCs локализуются в паренхиме. С) CD103 + CDCs вокруг дыхательных путей. D) CD103 + CDCs под висцеральной плевры. Белые полосы обозначают 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Окрашивание ДК и макрофаги. А) Окрашивание PCLS с антителами к CD11b (синий) дает высокий фон в PCLS. Б) Антитела к CD172a (зеленый) имеют относительно низкий фон в PCLS и большую специфичность в отношении CD11b + клеток. С) Всего PCLS от мышей C57BL / 6 , окрашенных мАт, цвет которых указывается цвет шрифта (справа вверху). CD11c (красный), CD88 (голубой), CD172a (зеленый) и CD324 (синий). CD11b Привет CDCs (CD11c + CD88 - CD172a +; желтый), альвеолярные макрофаги (CD11c + CD88 + CD172a -; розовый), интерстициальные макрофаги (CD11c + CD88 + CD172a +; белый), нейтрофилы (CD11c - CD88 +; голубой) и дыхательные пути (CD324 +, синий). D - F) Высшее увеличение вставокизображенный на C. D) Sub-плевральную область. Е) к югу от эпителиальной области. F) интерстиция. Интерстициальные макрофаги локализация в паренхиме и альвеолярные макрофаги в альвеолах. Немеченые белые полосы обозначают 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Маркировка структурных клеток в PCLS. А) Целые PCLS , приготовленные из Prox1 tdTomato мыши, и окрашивали МКА CD90.2 (зеленый), CD103 (белый) и CD324 (синий). Prox1-экспрессирующие клетки (красные), генетически метили TdTomato под регулированием Prox1 промотора (Prox1-TdTomato). B - E) более высокое увеличение на врезке
Фильм 1. Т - клетки Взаимодействие с CD103 + CDCs в легких. Живая клетка изображений CD103 + CDCs (красный) , взаимодействующих с Т - клеток (зеленый). CD4 + Т - клетка , выделенная из OVA-специфического мышея GFP ОТ-II Nur77 стимулировала селезеночный ДК и OVA в пробирке, и адаптивно переносила в Rag - / - мышей. 2 ч позже, мышь получатель обрабатывали острякч OVA / LPS закапывание в дыхательных путях. 16 ч после обработки ОВА / LPS, были сделаны PCLS, окрашивали и отображаются в течение 4 ч при 37 ° С. Время записи изображения (мин) показано. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, был первоначально разработан для визуализации местоположения двух подмножеств ЦХБ в легких. Тем не менее, этот протокол может быть легко адаптирована для изучения различных типов клеток, сохраняя при этом жизнеспособность клеток и трехмерную архитектуру легких. Последняя особенность является важным преимуществом по сравнению с системами культуры клеток и облегчает идентификацию редких типов клеток. Метод основан на генерации PCLS из легких, и соответствующее сочетания антител для идентификации конкретных типов клеток при сведении к минимуму фонового окрашивания. В значительной степени это эмпирическое упражнение, потому что антитела, которые хорошо работают в других приложениях, в том числе проточной цитометрии, не обязательно хорошо подходят для окрашивания PCLS. Мы уже добились значительного прогресса в этом направлении, но исследователи, которые хотят изучить типы клеток, не затронутые здесь, возможно, придется испытать различные антитела и оптимизировать флуорохромии и концентрации. Используя протокол , описанный здесь, мы обнаружили , что CD103 + ЦХБ и CD11b привет ЦХБ проживают в различных локализаций в легких. В устойчивом состоянии, CD103 + CDCs были обнаружены вокруг дыхательных путей и в субплевральной области, тогда как CD11b привет CDCs были найдены главным образом в паренхиме. Хотя протокол мы описываем здесь не подходит для окрашивания внутриклеточных молекул, это полезно для клеток визуализации поверхностных маркеров, а также секреторных молекул. Таким образом, нам удалось обнаружить хемокинов CCL21 и CCL19, в PCLS (данные не показаны). Если только слабые флуоресцентные сигналы воспринимаются с использованием первичных антител, можно использовать вторичные антитела для усиления этих сигналов.
Одна из основных проблем при проведении живых клеток видео-визуализации PCLS было достаточно закрепить ткани в питательной среде с целью предотвращения значительного XY- и Z-дрейф в течение 4-часового периода микроскопии. Для решения этой проблемы, мы экспериментировалипри различных соотношениях среды Лейбовиц к внеклеточного матрикса, который является твердым при комнатной температуре, и определяется в соотношении 1: 1 сохраняет стабильную, 3D структуру с жизнеспособности клеток. Во время обработки после изображения, мы также использовали серию ImageJ плагин, называемый TurboReg и StackReg, которые устраняют любой дополнительный случайный х или Z-сдвиг (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx? ID = 18226). С помощью инструмента автофокуса в конфокальной микроскопии, интересующей область находилась в центре внимания, особенно в г-диапазоне, в течение всего периода сканирования. Еще одной проблемой в ходе клеточного живого изображения из PCLS был использованием сканирования плитки, Z-стек, временные ряды и функции автоматической фокусировки микроскопа. Чтобы свести к минимуму времени между каждым кадром, баланс должен быть поражен между временем, проведенным сканированием каждой плитки. Для того, чтобы оптимизировать время сканирования в каждом исследовательском проекте, число г-стек, плитка и скорость сканирования должно быть скорректировано.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов декларировать.
Acknowledgments
Мы благодарим Джефф Такер, Эрика Скапини и Агнес Джаношази за помощь микроскопии, Лигон Перроу для ее управления колонии мыши и Джун Чэнь и Майкл Сандерсон за помощью ломтерезки ткани, и Майкл Фесслер и Дерек Каин для критического чтения рукопись. Эта работа финансировалась очного отделения NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), который в свою очередь, при поддержке Департамента здравоохранения и социальных служб.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
