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Neuroscience

फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग के संवर्धित न्यूरॉन्स में एंडोसोम और लियोसोम की क्षमताओं का मात्रा

doi: 10.3791/55488 Published: May 22, 2017

Summary

तंत्रिका संबंधी कार्यों को समझने के लिए झिल्ली तस्करी की जांच महत्वपूर्ण है। यहां, हम न्यूरॉन्स में फंक्शनल गतिशीलता को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह एक सुविधाजनक तरीका है जो तंत्रिका तंत्र में झिल्ली तस्करी की मात्रा का ठहराव करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

मस्तिष्क में, झिल्ली तस्करी प्रणाली न्यूरॉनल फ़ॉर्म्स, जैसे न्यूरोनल आकृति विज्ञान, सिनाप्टिक प्लास्टिसिटी, अस्तित्व, और ग्लिअल कम्युनिकेशंस को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। आज तक, कई अध्ययनों से पता चला है कि इन प्रणालियों में दोष विभिन्न न्यूरोनल रोगों के कारण होते हैं। इस प्रकार, पुटिका गतिशीलता के नीचे स्थित तंत्र को समझना प्रभावशाली सुराग प्रदान कर सकते हैं जो कई न्यूरोनल विकारों के उपचार में सहायता कर सकते हैं। इमेजज प्लेटफॉर्म के लिए एक सॉफ्टवेयर प्लग-इन का उपयोग करते हुए, हम फुफ्फुसा की गतियों को गति देने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, जैसे गतिशीलता दूरी और आंदोलन की दर। मात्रा का ठहराव के लिए छवियों को प्राप्त करने के लिए, हमने ईजीएफपी-टैग फॉस्सेल मार्कर प्रोटीन के साथ न्यूरॉनल एन्डोसोम-लियोसोम संरचनाओं को लेबल किया और एक समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए vesicles के आंदोलन को देखा। यह विधि बेहद उपयोगी है और न्यूरिटियों में फंक्शनी गतिशीलता को मापने में आसान है, जैसे कि एक्सॉन्स और डेन्ड्राइट्स, साथ ही दोनों न्यूरॉन्स और ग्लिअल कोशिकाओं के सोम में। Furthermoफिर, यह विधि अन्य सेल लाइनों, जैसे फाइब्रोब्लैस्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए लागू की जा सकती है। यह दृष्टिकोण झिल्ली तस्करी की हमारी समझ का एक महत्वपूर्ण उन्नति प्रदान कर सकता है।

Introduction

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न्यूरोनल फ़ंक्शन के विनियमन के लिए एंडोसोम- लाइसोसोम तस्करी का सटीक नियंत्रण अनिवार्य है। विशेष रूप से, इन vesicles के गतिशील आंदोलन न्यूरॉनल आकारिकी, विकास, और अस्तित्व के नियमन के अधीन एक महत्वपूर्ण कारक हैं। इस प्रणाली में दोष गंभीर न्यूरॉनल विकार 1 , 2 आणविक तंत्र जो कि न्यूरॉन संबंधी रोगों के लिए पित्ती से जुड़े तस्करी का लिंक जटिल माना जाता है, और कई समूहों ने इस प्रासंगिकता की जांच करने की मांग की है। उदाहरण के लिए, यह बताया गया है कि घबराहट के अंतराल की गतिशीलता काफी नीमैन-पिक सी रोग 3 के साथ जुड़ी हुई है, जो लयसोसोम दोषों के कारण विरासत में मिली न्यूरोड अभिकर्मक विकार है। एक अन्य उदाहरण एक लियोसोमल कै 2 + चैनल, ट्रिपील 1 में एक उत्परिवर्तन है, जो लियोसोमोल गतिशीलता को प्रभावित करता है, जिसके परिणामस्वरूप लियोसोमल स्टोरेज रोग 4 , 5 , 6 हमारे समूह ने सूचित किया है कि PtdIns (3,5) पी 2 कारोबार की कमी के कारण न्यूरॉन्स में एंडोसोम और लाइसोसम गतिशीलता को दबा दिया गया है, जिससे तनाव की प्रतिक्रिया 7 , 8 के लिए भेद्यता में वृद्धि हुई है। पीटीआईएन (3,5) पी -2 के मेटाबोलिक विनियमन, जो ज्यादातर देर एंडोसोम और लाइसोसोम पर केंद्रित होते हैं, विभिन्न प्रकार के सेलुलर फ़ंक्शंस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें पुटिया तस्करी और संलयन-विखंडन प्रक्रियाएं 9 , 10 भी शामिल हैं । बिगड़ा PtdIns (3,5) पी 2 टर्नओवर गंभीर neurodegeneration कारण 11 , 12 , endosome-lysosome गतिशीलता के निर्बाध विनियमन neurodegeneration के रोगजनन को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है। पुटिका गतिशीलता के चलने वाले आणविक तंत्र की एक जांच, इस तरह के सुराग प्रदान कर सकती है जो हमारे अंडे को गहरा कर सकती हैकई न्यूरोनल विकारों की बुद्धिमत्ता

इस पत्र में, हम मैनुअल ट्रैकिंग नामक एक फ्री सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके न्यूरॉन्स में फंक्शनल गतिशीलता को मापने के लिए एक महत्वपूर्ण विधि प्रस्तुत करते हैं। इसका उद्देश्य पिंड की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक तेज मात्रा का तरीका विकसित करना था। यह मात्रा का ठहराव समयबद्धता फिल्म के प्रत्येक फ्रेम में एक संदर्भ बिंदु पर क्लिक करने के एक मानक दृष्टिकोण के माध्यम से निर्देशित है। मैनुअल ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर के उपयोग से यह अनुप्रयोग काफी सरल और व्यापक उपयोगिता बना देता है, अन्य अनुप्रयोगों के विपरीत इसके अलावा, यह दृष्टिकोण अन्य कोशिकाओं पर भी लागू होता है, जैसे कि ग्लील कोशिकाएं हालांकि यह विधि आदिम है, यह सेलुलर गतिशीलता और रूपात्मक परिवर्तन सहित विभिन्न विश्लेषणों पर लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, छवियों के अनुक्रम में एक संदर्भ बिंदु को परिभाषित करने के बाद, संदर्भ बिंदुओं की स्थिति और प्रत्येक स्थिति के समय की जानकारी अनुक्रमिक छवियों से प्राप्त की जा सकती है, जो डेटा विश्लेषण और छवि प्रसंस्करण नरमबर्तन। एक साथ ले लिया, यह विधि सरल लेकिन शक्तिशाली है और झिल्ली तस्करी के आधार पर अध्ययन में बेहतर दक्षता के विकास में योगदान देता है, जैसे कि एंडोसोम- लाइसोसोम फ़ंक्शन का परीक्षण करना।

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Protocol

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सभी पशु प्रक्रियाओं को Tsukuba पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) विश्वविद्यालय के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया।

1. विच्छेदन

  1. भ्रूण दिवस 13-14 आईसीआर या सी 57 बीएल / 6 भ्रूणों को तैयार करने के लिए, ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा गर्भवती चूहों को सुथरा बनाना। गर्भाशय निकालें और इसे हांक के बैलेंस्ड नमक समाधान (एचबीएसएस) के साथ पेट्री डिश में डाल दिया। खून को हटाने के लिए अच्छी तरह कुल्ला।
  2. संदंश का प्रयोग, गर्भाशय को एक नए पेट्री डिश में 70% इथेनॉल के साथ बाँझ डालें।
  3. एचबीएसएस के साथ एक नए पेट्री डिश में गर्भाशय को स्थानांतरित करें निष्फल विदारक संदंश और शल्य कैंची का उपयोग कर गर्भाशय से भ्रूण निकालें।
  4. सर्जिकल कैंची का इस्तेमाल करके भ्रूण को ठोकर दें उन्हें एचबीएसएस के साथ एक नई पेट्री डिश में रखें
  5. त्वचा और खोपड़ी निकालें और निष्फल विदारक संदंश का उपयोग कर दिमाग ले। एचबीएसएस के साथ उन्हें एक पेट्री डिश में रखें
    नोट: इस कदम से, एक स्वच्छ पर प्रक्रिया का संचालन करना सबसे अच्छा हैबेंच।
  6. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत निष्फल विदारक संदंश का उपयोग कर मैनिंज निकालें। संदंश का उपयोग कर बेसल गैन्ग्लिया, हिप्पोकैम्पस और सेरेबेलम काट कर। घुमावदार-टिप संदंश का उपयोग करते हुए, कोर्टेस को एचबीएसएस के साथ एक नया पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  7. डिस्पोजेबल ड्रॉपर या 25 एमएल विंदुक का उपयोग करके सभी कॉर्टिस ले लीजिए। उन्हें 15 एमएल ट्यूब में रखें और फिर एचबीएसएस को पिपेट करने से हटा दें।
  8. कॉर्टिस युक्त ट्यूब को 3 एमएल ऑफ़ सेरेब्रल कॉर्टिकल एंजाइम सॉल्यूशन जोड़ें। इस ट्यूब को पानी के स्नान में रखें और 5 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: 0.25% ट्रिप्सिन और 1 एमएम ईडीटीए के साथ फॉस्फेट-बुफर्ड सलाईन (पीबीएस) से मिलकर एक सेरेब्रल कॉर्टिकल कल्चर एंजाइम तैयार करें। एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ जीवाणु।
  9. एक अतिरिक्त 3 मिनट के लिए पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोर्टेस युक्त ट्यूब में मस्तिष्क संबंधी कॉर्टिकल एंजाइम समाधान का एक और 3 एमएल जोड़ें।
  10. 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके सेरेब्रल कॉर्टिकल एंजाइम समाधान निकालें और 5 एमएल ऑफ डुलबे जोड़ेंसीसीओ के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) में 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस) है।
  11. एक बाँझ P1000 टिप के साथ 5 एमएल विंदुक का उपयोग करके धीरे-धीरे pipetting और cortices को अलग करना। पिपेट फिर से पीएमएस टिप के साथ 5 एमएल विंदुक का उपयोग कर।
  12. 50 एमएल ट्यूब पर एक 40 सुक्ष्ममापी नायलॉन सेल झरनी रखो और मलबे को हटाने के लिए निलंबन फ़िल्टर करें।
  13. आरटी पर 5 मिनट के लिए 420 xg पर अपकेंद्रित्र और फिर डीएमईएम माध्यम हटा दें।
  14. मस्तिष्क cortical संस्कृति माध्यम के 5 एमएल जोड़ें और धीरे सेल गोली resuspend।
    नोट: 1x बी -27 पूरक, 2 मिमी एल-ग्लूटामाइन, और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के पूरक के साथ एक मस्तिष्क संबंधी कॉर्टिकल संस्कृति माध्यम में न्यूरॉन बेसल माध्यम तैयार किया गया है।
  15. एक हेमोसिटामीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और मस्तिष्क संबंधी संस्कृति माध्यम के उपयोग से सेल एकाग्रता (वांछित) को समायोजित करें।
  16. प्लेट 3.0 × 10 6 कॉर्टिकल न्यूरॉन्स 2.0 एमएल प्रति लेपित 35 मिमी कांच के तले हुए बर्तन में।
    नोट: चढ़ाना से पहले कोट को0.1 एमजी / एमएल पॉली-डी-लाइसिन हाइड्रोबॉमाइड (पीडीएल) या 0.01% पॉली-एल-ओर्निथिन (पीएलओ) के साथ 35 एमएमएम कांच के नीचे व्यंजन। 3 घंटे के लिए सेते - 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन और कम से कम 3x पीबीएस के साथ धो लो।

2. इमेजिंग व्हज़िकल गतिशीलता

  1. प्लास्मिड तैयार करें जो प्रत्येक प्रकार की पुटिका को लेबल करेंगे। उदाहरण के लिए, शुरुआती एंडोसोम के लिए ईजीएफपी-आरएबी 5 का प्रयोग करें, ईजीएफपी-राब 7 के अंत में एंडोसोम के लिए, लाइमोसोम के लिए एलएएमपी-ईजीएफपी, और ईजीएफपी-एलसी 3 के लिए autophagosomes 8 , 13
    नोट: ये प्लास्मिड tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp से अनुरोध पर उपलब्ध हैं आमतौर पर, 3-5 दिनों में इन विट्रो (डीआईवी) न्यूरॉन्स में इन प्लास्मिड के साथ अभिकर्मक अभिकर्मकों का उपयोग किया जा सकता है।
  2. Pipetting द्वारा 200 μL सीरम मुक्त माध्यम के साथ plasmids 4.0 माइक्रोग्राम मिलाएं। एक अलग ट्यूब में, सीरम मुक्त माध्यम के 200 μL में 8 μL अभिकर्मक अभिकर्मक (सामग्री की तालिका देखें) को कम करें। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं
  3. पिपेटिंग द्वारा चरण 2.2 में प्लाज्मिड समाधान और अभिकर्मक रीजेंजर समाधान मिलाएं। आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं
  4. प्रत्येक लेपित ग्लास-नीचे डिश के लिए चरण 2.3 से सीरम-मुक्त माध्यम और प्लाज्मिड समाधान का 400 μL जोड़ें। 30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर न्यूरॉन्स सेते हैं। मस्तिष्क cortical संस्कृति माध्यम के 2 एमएल के साथ मध्यम बदलें। 1-2 दिनों के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर न्यूरॉन्स सेते हैं।
  5. 1 से 2 डी अभिकर्मक के बाद, छवि अधिग्रहण के लिए ट्रांसफ़ेक्ट सेल का चयन करें।
    नोट: 7 डीआईवी से कम समय पूर्वकाल न्यूरॉन्स गतिशील पुटिका गतिशीलता को प्रदर्शित करने की प्रवृत्ति है। न्यूरॉन्स चुनें, जो प्रतिदीप्ति जांच को सामान्य रूप से व्यक्त करते हैं क्योंकि जब अत्यधिक व्यक्त न्यूरॉन चुना जाता है, तो स्पष्ट छवियां प्राप्त नहीं की जा सकतीं। इसके अलावा, एक विशिष्ट न्यूरोनल आकार का चयन करें, जैसे पिरामिड न्यूरॉन्स, जो अक्षतंतु और डेंड्राइट्स की पहचान में आसानी के लिए लंबे अक्षांश और जटिल dendrites हैं ( चित्रा 1 ए देखें ))।
  6. एक समय चूक इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करते हुए छवि अधिग्रहण:
    इमेजिंग के लिए, 40 एक्स प्लान एपो 0.95 एनए या 100 एक्स प्लान एपीओ वीसी एनए 1.4 उद्देश्य लेंस के साथ चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा से लैस फ्लोरोसेंटेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। ऊष्मायन प्रणाली का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान नियंत्रित करें। छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित एक 100 की अवधि में एक फ्रेम / 5 एस पर न्यूरॉन छवियां प्राप्त करें। वैकल्पिक रूप से, चित्रों को कम अंतराल पर और अधिक समय की अवधि के लिए, जैसे कि 300-एस अवधि के दौरान प्रति 2 सेकंड में एक फ्रेम पर प्राप्त करें
    नोट: अनुक्रमिक छवियों को लेने के लिए कई तरह के अनुप्रयोग उपलब्ध हैं, जिनमें से कई इस पद्धति के लिए उपयुक्त होंगे। इसलिए, कोई विशेष आवेदन अनुशंसित नहीं है; बल्कि, प्रत्येक शोधकर्ता को जो कुछ भी उपलब्ध है, उसका उपयोग करना चाहिए।

3. छवि विश्लेषण

  1. मैनुअल ट्रैकिंग 14 के साथ ImageJ सॉफ्टवेयर में सभी अनुक्रमिक छवियां खोलें
    नोट: आज तक, मैनुअल ट्रैकिंग वाई की गई है15 , 16 , 17 , 18 , 1 9 के ट्रैकिंग प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया मैनुअल ट्रैकिंग डॉ। फैब्रिस कॉर्डिलेरेस द्वारा विकसित किया गया था। विस्तृत लिखित निर्देश ऑनलाइन उपलब्ध हैं 20 विश्लेषण के लिए, पर्याप्त संख्या में छवियों के साथ इमेजिंग डेटा की गुणवत्ता में सुधार होता है 20 से अधिक चित्रों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है
  2. अनुक्रमिक छवियों को गठबंधन करने के लिए, <छवि> → <स्टैक> → <छवियां स्टैक> चुनें <ओके> क्लिक करें
  3. <Plugins> → मैनुअल ट्रैकिंग> चुनें; एक ट्रैकिंग विंडो पॉप अप होगी
  4. <पैरामीटर देखें <> के चेकबॉक्स पर क्लिक करें और पैरामीटर अनुभाग में ट्रैकिंग मापदंडों को परिभाषित करें।
    नोट: कई पैरामीटर सेट किया जा सकता है, समय अंतराल, एक्स / वाई कैलिब्रेशन, जेड कैलिब्रेशन, केंद्र के लिए खोज वर्ग के आकार सहितआईएनजी, डॉट साइज़, लाइन चौड़ाई, और फ़ॉन्ट आकार। इस सरलीकृत परख में, दोनों समय अंतराल और एक्स / वाई कैलिब्रेशन परिभाषित किए गए थे। अन्य प्रायोगिक परिस्थितियों में, अन्य पैरामीटरों को भी परिभाषित करना आवश्यक हो सकता है। यहां उपयोग किए गए पैरामीटर इस प्रकार हैं: <समय अंतराल> 5 एस है, और <x / y कैलिब्रेशन> या तो 100x प्लान अपो वीसी एनए 1.4 के लिए 40x प्लान अपो 0.95 एनए उद्देश्य लेंस या 0.10657 सुक्ष्ममापी के लिए 0.26642 माइक्रोन है अभिदृश्य लेंस।
  5. पैरामीटर परिभाषित किए जाने के बाद, एक नया ट्रैक शुरू करने के लिए <add track> पर क्लिक करें
  6. ब्याज के vesicles का निर्धारण करने के बाद ( उदाहरण के लिए, चित्रा 1 ए (दाएं पैनल) में नीले और लाल तीर द्वारा इंगित किए गए vesicles), एक्सआई निर्देशांक रिकॉर्ड करने के लिए अनुक्रमिक छवियों में संकेतों के केंद्र पर क्लिक करें। दर्ज xy निर्देशांक, दूरी, और वेग के नतीजे एक नई विंडो में दिखाई देते हैं।
    नोट: lysosomes के मामले में, बड़े उज्ज्वल फ्लोरोसेंट संकेत ( उदाहरण के लिए, अंजीरUre 1 ए (दाएं पैनल), नारंगी तीरहेड) अक्सर न्यूरॉन्स में मनाया जाता है। चूंकि इन संकेतों को कभी-कभी संचित vesicles या रोग संबंधी विविधताएं प्रदर्शित होती हैं, गतिशीलता को मापने के लिए इन संकेतों से बचा जाना चाहिए।
  7. सभी अनुक्रमिक छवियों से vesicles के xy निर्देशांक को इकट्ठा करने के लिए कदम 3.6 को दोहराएं; संदर्भ छवि चयनित होने के बाद प्रत्येक छवि स्वचालित रूप से लगातार छवि के लिए प्रगति करती है।
  8. इन आंकड़ों को एक नई तालिका में निर्यात करें ( जैसे, एक स्प्रेडशीट) उपयुक्त ग्राफ (सामग्री की तालिका देखें) बनाने के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: डेटा का विश्लेषण करने के लिए, <दूरी> कॉलम का चयन करें, इस कॉलम के सभी मानों को जोड़ दें, और बार ग्राफ के रूप में गतिशीलता दूरी दिखाएं, जैसे चित्रा 1B में । इसके अतिरिक्त, इस चरण को दोहराएं, कुल गति की दूरी के औसत की गणना करें, और चित्रा -1 सी के रूप में एक बार ग्राफ के रूप में दिखाएं एक बार ग्राफ और तरंग डेटा बनाने के लिए सॉफ्टवेयर में दिखाया गया हैसामग्री की तालिका

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Representative Results

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इस परख इन विट्रो संस्कृति में पुटिका गतिशीलता को मापने के लिए डिजाइन किया गया था। इस परख का उपयोग न्यूरोनल आकृति विज्ञान और जीवित रहने के साथ जुड़े पुटिका गतिशीलता को निर्धारित करने के लिए किया गया था। चित्रा 1 ए और बी प्रदर्शन प्रतिनिधि डेटा न्यूरॉन्स में lysosome गतिशीलता दिखा। कॉर्टिकल न्यूरॉन्स लियोसोम मार्कर, एलएएमपी-ईजीएफपी के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे, और एक मानक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करते हुए मनाया गया था। यह पहले बताया गया है कि विशिष्ट एंडोसोम-लियोसोम vesicles अत्यधिक मोबाइल हैं, यहां तक ​​कि न्यूरॉन्स के आराम में 8 । दरअसल, ये परिणाम एक ही डेन्ड्राइट ( चित्रा 1 ए और बी ) में आराम और चलने वाले दोनों वसूली दिखाते हैं। आम तौर पर, न्यूरोनल डेन्ड्रैक्ट्स में फॉस्सिकल स्पेशिबल आन्दोलन, ब्राउनियन गति जैसे, आराम करना। इसके विपरीत, चलती हुई फोंसियां ​​अनियमित गतिशीलता प्रदर्शित करती हैं। हम अनुमान लगाते हैं कि प्रत्येक पुटिका एक अलग हैरचनात्मक सुविधा जो कि कार्य के निर्धारण के अधीन होती है, यहां तक ​​कि लियोसोम vesicles 8 में भी । इस प्रकार, इस दृष्टिकोण का उपयोग कर vesicles का वर्गीकरण उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकता है। इस प्रणाली का उपयोग करना, इन पिंडों ( चित्रा 1 सी ) की औसत गतिशीलता को मापना आसान है और समय-प्रभावी तरीके से इस प्रणाली का उपयोग करके फर्श गुणों का विश्लेषण करना आसान है।

आकृति 1
चित्रा 1: न्यूरोनल डेंड्राइट्स में लियोसोम गतिशीलता। ( ) माउस कॉर्टिकल न्यूरॉन्स (4 डीआईवी) 2 दिनों के लिए एलएएमपी-ईजीएफपी प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। यह छवि डेमेट्रेट्स में एलएएमपी-ईजीएफपी युक्त फेशियल की गतिशीलता को दर्शाती है। इनसेट LAMP-EGFP पॉजिटिव vesicles की समय चूक छवि को दर्शाता है लाल तीर एक चलती पुटिका को इंगित करता है, और नीली तीर की ओर एक आराम की पुटिका इंगित करता है। नारंगी arrowheads बड़े फ्लोरोसेंट संकेतों का संकेत देते हैं, जैसा कि निर्दिष्ट हैऊपर के। स्केल बार = 20 माइक्रोन ( बी ) चित्रा ए से एलएएमपी-ईजीएफपी-पॉजिटिव vesicles के समय पर निर्भर एक्स-अक्ष की स्थिति। लेबल वाला लाल वृत्त (बी) में पुटिका बढ़ रहा है, और नीले सर्कल लेबल में पुष्पक्रम (ए) आराम कर रहा है स्केल बार: 5 माइक्रोन (बाएं) बार ग्राफ़ एलएएमपी-ईजीएफपी आंदोलन (दाएं) की कुल दूरी दर्शाता है ( सी ) बार ग्राफ एलएएमपी-ईजीएफपी युक्त विसर्जन की औसत गतिशीलता दूरी दर्शाता है। (N = 5, माध्य [एसईएम] के मानक त्रुटि, ** पी <0.01 विद्यार्थी के टी -टेस्ट द्वारा)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल में फंक्शनल गतिशीलता को मापने के लिए प्रक्रिया का परिचय दिया गया है। प्राथमिक न्यूरॉन्स, एंडोसोम और लाइसोसोम में छोटे न्यूरॉन्स (4-6 डीआईवी) में उच्च गतिशीलता दिखती है। यह देखते हुए कि न्यूरॉन्स ने तंत्रिका प्रक्रियाओं को बढ़ाने के लिए प्रमुख किनारों को कुछ घटकों को अवश्य देना होगा, इस स्टेज के दौरान झिल्ली तस्करी गतिशील रूप से घटित होनी चाहिए। इस प्रकार, न्यूरोनल डेंड्राइट्स में गतिशील गतिशीलता का पालन करने के लिए युवा न्यूरॉन्स का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, बड़े vesicles उच्च गतिशीलता का प्रदर्शन नहीं करते हैं, यहां तक ​​कि छोटी न्यूरॉन्स में भी। पुटिका के आकार का नियमन संलयन-विखंडन चरण की आवृत्ति में होने की संभावना है। यह संभव हो सकता है कि विशिष्ट vesicles जो गतिशील रूप से आसानी से अन्य vesicles आसानी से स्वीकार करते हैं और उनके आंदोलनों को समाप्त नहीं ले जाते हैं। इस प्रकार, vesicles का चयन इस विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है।

कई फ्री प्लग-इन सॉफ़्टवेयर पैकेज ट्रैकिंग ऑब्जेक्ट 21 के लिए उपलब्ध हैं । उदाहरण के लिए, ट्रैकमेट पैकेज ऑब्जेक्ट्स को ट्रैक कर सकते हैं 22 और संख्यात्मक सॉफ़्टवेयर द्वारा संशोधित किया जा सकता है, जिसमें कई गणितीय सूचनाएं उपलब्ध हैं। दूसरी ओर, यह प्रोटोकॉल में अपेक्षाकृत सरल छवि विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए थोड़ा जटिल है। Mtrack2 एक और प्लग-इन है और मल्टीट्रैक प्लग-इन 23 पर आधारित है Mtrack2 भी उपयोगी है क्योंकि यह लक्ष्य की पहचान कर सकता है और फिर निर्धारित करता है कि निम्न फ़्रेम में कौन से लक्ष्य निकटतम हैं यह दृष्टिकोण डेटा के भारी मात्रा को मापने के लिए उपयोगी है; हालांकि, छवि डेटा के छोटे संस्करणों के लिए मैन्युअल ट्रैकिंग अधिक विश्वसनीय हो सकती है। इसलिए, हम डेटा के छोटे सेट का अनुमान लगाने के लिए मैनुअल ट्रैकिंग की अनुशंसा करते हैं और स्वीकार करते हैं कि बड़े वॉल्यूम की निगरानी के लिए अन्य सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना बेहतर हो सकता है

इस दृष्टिकोण में कई सावधानी बरती जाएंगी सबसे पहले, सख्त डेटा प्राप्त करने के लिए नमूना दर उच्च होने चाहिए। इसका कारण यह है कि कुछ फंक्शंस तेजी से आंदोलन और प्रदर्शन करते हैंअचानक बदलाव, जैसे कि संलयन-विखंडन, और उपस्थिति-गायब होने की घटनाओं को कभी-कभी मनाया जाता है, यह दर्शाता है कि किसी भी बदलाव के संकेत को याद नहीं करना चाहिए। एक अन्य मुद्दा यह है कि स्कैनिंग-डिस्क इंफोकल सूक्ष्मदर्शी और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी जैसे उच्च अंत सूक्ष्मदर्शी का उपयोग उच्च-रिज़ॉल्यूशन, दिलचस्प डेटा प्राप्त करने की कुंजी हो सकता है। यहां उच्च अंत माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए कम अंतराल पर छवियों को लेने की सलाह दी जाती है, यद्यपि यहां, उपकरण सीमाओं के कारण प्रत्येक 5 एस छवियों को लिया गया था।

पर्याप्त अध्ययन ने झिल्ली तस्करी और न्यूरोनल विकारों के बीच एक जैविक लिंक का सुझाव दिया है। उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि लियोसोममल दोष गंभीर न्यूरॉनल विकारों में शामिल हैं, जैसे नीमन-पिक रोग और गौचर रोग 24 । दिलचस्प, कई अध्ययनों से पता चला है कि लियोसोमल आंदोलन और स्थानीयकरण इसमें शामिल हैंलियोसोमल संग्रहण विकार की शुरुआत 6 यह संभव है कि विकृति गतिशीलता इन विकारों के लिए बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल की जा सकती है। एक दिलचस्प दृष्टिकोण मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं (आईपीएसएससी) की उपलब्धता से उत्पन्न हो सकता है। IPSCs- व्युत्पन्न न्यूरॉन्स का उपयोग कर फंक्शनी गतिशीलता की जांच से lysosomal भंडारण विकारों के लिए एक बायोमार्कर प्रकट हो सकता है। यह दृष्टिकोण रोगों के जोखिम से उत्पन्न होने वाली प्रक्रियाओं के लिए कुछ सुराग प्रदान करता है।

चूंकि यह परख सरल है, इसलिए गतिशीलता डेटा प्राप्त करना आसान है। इसके अलावा, यह अन्य सेलुलर घटनाओं के विश्लेषण पर लागू होता है, जिसमें माइग्रेशन और रूपात्मक परिवर्तन शामिल हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इसकी सादगी के कारण इस दृष्टिकोण की कई सीमाएं हैं जैसे, न्यूरॉनल तस्करी के सटीक शारीरिक प्रासंगिकता को समझने के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, जैव रसायन और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप विश्लेषण सहित अन्य तरीकों को नियोजित करना आवश्यक है। फिर भी, यह दृष्टिकोण एक मूल्यवान मेथो हैघ जो शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त हैं जो एक सरल और समय-प्रभावी ढंग से तस्करी का विश्लेषण करना चाहते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस विश्लेषण और डॉ मैथ्यू वुड, टकुमा एहारा, और दोंगसूक किम को पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए विकसित करने में मदद करने के लिए, हम डॉ। रिकार्डो डोल्मेत्स्च (स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ़ मेडीसिन के लिए वर्तमान सहयोग: बायोमेडिकल रिसर्च के नोवार्टिस इंस्टीट्यूट्स) का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103-049
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Wako 044-29765
Opti-MEM Thermo Fisher 31985070 Serum free medium
Hank's balanced salt solution (HBSS) Thermo Fisher 14170112
Penicilin Streptmycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
B-27 Supplements Thermo Fisher 17504044
2.5% Trypsine Thermo Fisher 15090046
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) Sigma P7280
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma P4957
Nylon cell strainer Corning 431750
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher 11668027 Transfection reagent
Polyethyleneimine "Max" (PEI) polysciences 24765 Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.
BIOREVO BZ-9000 Keyence NA
Incubation system INUG2-K13 Tokay Hit NA
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फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग के संवर्धित न्यूरॉन्स में एंडोसोम और लियोसोम की क्षमताओं का मात्रा
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Tsuruta, F., Okajima, T., Yano, S., Chiba, T. Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes. J. Vis. Exp. (123), e55488, doi:10.3791/55488 (2017).More

Tsuruta, F., Okajima, T., Yano, S., Chiba, T. Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes. J. Vis. Exp. (123), e55488, doi:10.3791/55488 (2017).

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