Summary
Aquí, introducimos una técnica novedosa diseñada para registrar la electroencefalografía (EEG) en cachorros epilépticos neonatales de movimiento libre y describir sus procedimientos, características y aplicaciones. Este método permite registrar el EEG durante más de una semana.
Abstract
El EEG es un método útil para detectar la actividad eléctrica en el cerebro. Además, es una herramienta de diagnóstico ampliamente utilizada para diversas afecciones neurológicas, tales como epilepsia y trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, técnicamente es difícil obtener registros de EEG en neonatos, ya que requiere un manejo especializado y un gran cuidado. Aquí, presentamos un nuevo método para registrar EEG en ratas neonatales (P8-P15). Diseñamos un electrodo simple y confiable usando localizadores de pin de computadora; Se puede implantar fácilmente en el cráneo de un cachorro de rata para grabar señales de EEG de alta calidad en el cerebro normal y epiléptico. Los cachorros recibieron una inyección intraperitoneal (ip) de la neurotoxina ácido cainico (KA) para inducir ataques epilépticos. La implantación quirúrgica realizada en este procedimiento es menos costosa que otros procedimientos EEG para neonatos. Este método permite registrar señales de EEG de alta calidad y estables durante más de una semana. Además, este procedimiento también se puede aplicar a adultos raSt y ratones para estudiar la epilepsia u otros trastornos neurológicos.
Introduction
Está bien establecido que la comunicación continua entre las neuronas es necesaria para obtener la función cerebral normal. La comunicación interneuronal tiene lugar principalmente en las sinapsis, donde la información de una neurona se transmite a una segunda neurona. Esta transmisión sináptica está mediada por dos tipos de estructuras estructurales dedicadas: sinapsis eléctricas o químicas 1 . La electrofisiología es el campo que capta el potencial eléctrico producido durante la comunicación interneuronal que controla las funciones corporales y el comportamiento global 2 . EEG es el método más comúnmente utilizado entre muchas técnicas electrofisiológicas.
EEG es una técnica utilizada para detectar cambios en las señales eléctricas producidas por estímulos internos o externos. Por otra parte, es una prueba esencial para el diagnóstico clínico y la predicción de los resultados de diversas afecciones neurológicas como epilepsia, Parkinson y enfermedad de AlzheimerE, así como los efectos de los agentes farmacológicos y toxicológicos 3 . Generalmente, un paciente epiléptico muestra hiperexcitabilidad y deterioro de la conectividad funcional dentro del cerebro; Estos se resumen como descargas epileptiformes interictal (IED) y pueden ser registrados por EEG en forma de picos agudos y transitorios; Olas agudas; Complejos de onda pico; O polyspikes 4 . La principal característica del cerebro epiléptico es la aparición espontánea de convulsiones epilépticas, que pueden registrarse tanto en el cuero cabelludo como en el parénquima cerebral para localizar el área cerebral responsable de las convulsiones 5 . Además, el EEG también tiene implicaciones muy importantes en trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer (EA). La investigación sugiere que los registros alterados de EEG y redes oscilatorias deterioradas en pacientes con EA son comunes. Sin embargo, nuestro conocimiento sobre la patofisiología de las oscilaciones de la red en las enfermedades neurodegenerativas iEs sorprendentemente incompleta y necesita ser explorada más a fondo 6 .
En este protocolo, hemos diseñado un electrodo simple con el que se puede grabar EEG para comprender la comunicación eléctrica en el cerebro normal y el patológico. La implantación quirúrgica en este método es más barato que otros procedimientos disponibles [ 7] . Además, este método puede utilizarse para registrar señales de EEG de alta calidad y estables para períodos de tiempo más largos ( es decir, 2-4 h todos los días durante 1 semana). Además, se utilizaron electrodos más ligeros (con un peso aproximado de 26 mg) que permiten a los animales comportarse de forma más natural 8 . Este método es ampliamente aplicable al estudio de EEG en cachorros de rata neonatal que requiere el amplificador y digitalizador, comúnmente utilizado en laboratorio de electrofisiología y no requiere ningún dispositivo adicional.
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Protocol
El cuidado de los animales, el procedimiento quirúrgico y los procedimientos de registro estaban de acuerdo con las directrices para el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Normal de China del Sur.
1. Preparación del electrodo (Figura 1A-C)
NOTA: Los loci de la clavija de la computadora son simplemente un contacto de la punta como parte de la interfaz de la señal en los dispositivos de la comunicación. Se compone de un conector macho que se conecta al conector hembra.
- Con cuidado, separe las clavijas macho y hembra de los loci de los clavijas de la computadora ( Figura 1A ) con la ayuda de una pinza. Conecte las clavijas macho y hembra entre sí para formar un electrodo y aplique cianoacrilato para crear una unión adhesiva fuerte ( Figura 1C ).
- Coloque los electrodos en un vaso lleno de agua destilada y colóquelo en un limpiador ultrasónico durante 10 min. Muévalos a un horno de secado a 45 ° C durante 30 min. Esterilizar los electrodos con luz UV durante 30 min.
2. Procedimiento quirúrgico (Figura 1D-F)
- Preparar los instrumentos quirúrgicos esterilizados y los aparatos estereotáxicos. Anestesiar el cachorro de rata neonatal utilizando anestesia con isoflurano (2,5%) con aire. Cuando el cachorro está profundamente anestesiado, ajustar la dosis de isoflurano al 1,0%. Realizar una pinza de la cola o dedo del pie antes de la cirugía para asegurar la profundidad adecuada de la anestesia.
- Fijar la cabeza del cachorro en el aparato estereotáxico colocando las barras de oído en los conductos auditivos y ligeramente apriete.
NOTA: No apriete excesivamente las barras del oído, ya que el cráneo neonatal es muy suave. - Mantenga el campo quirúrgico estéril rociando todo el equipo con etanol al 70%. Haga una incisión de 15 mm en la cabeza usando un bisturí. Usando una pinza, tire suavemente del cuero cabelludo lejos de la línea media en las cuatro esquinas. Ponga un poco de algodón empapado en solución salina debajo de la piel para mantener la incisión abierta ( Figura 1D ).
- Encuentra los puntos bregma y lambda en el cráneoY márquelos con un lápiz. Utilice una aguja de jeringa (26 G) para hacer dos agujeros de rebabas en la corteza prefrontal (PFC) y el hipocampo.
NOTA: El PFC se localiza a +1.8 mm posterior a bregma y -0.5 mm lateral a la línea media, mientras que el hipocampo se encuentra a -2.0 mm anterior a bregma y ± 0.5 mm lateral a la línea media ( Figura 1D y E ). La profundidad del electrodo no debe estar a más de 2 mm por debajo de la superficie cortical para minimizar el daño cerebral. - Utilice una pinza para sujetar los electrodos e inserte los electrodos de referencia y de grabación en el PFC y el hipocampo, respectivamente. Aplique pomada de eritromicina alrededor del electrodo para evitar cualquier posible infección. Fijar el electrodo utilizando cianoacrilato.
- Prepare el cemento dental acrílico para que tenga una consistencia pegajosa y viscosa. Aplique el cemento dental para cubrir los electrodos y el resto del cráneo.
NOTA: Seque completamente el cráneo antes de aplicar el cemento dental. Aplique ácido picrico al 5% sobre los electrodos para protegerlos.
NOTA: Todo el procedimiento debe realizarse en una campana de bioseguridad para mantener condiciones estériles. - Retire el animal del marco estereotáxico e inyecte 300 μl de glucosa al 10% por vía subcutánea. Colóquelo sobre una manta caliente para su recuperación. Asegúrese de que el animal está caliente (37 ° C) y ambulatorio ( es decir, completamente recuperado). Administrar buprenorfina intraperitonealmente (0.05 mg / kg) para el dolor posquirúrgico.
NOTA: No deje a un animal desatendido hasta que haya recuperado suficiente conciencia (es decir, comportamiento normal y movimiento). - Devuelve el cachorro a su jaula de casa con su madre después de que recupere la conciencia. Espere dos días hasta que el animal esté completamente recuperado.
3. Grabación EEG
- Después de la recuperación completa, conecte los electrodos implantados en el cráneo del cachorro al amplificador en su propia jaula. Conecte el amplificador a una toma analógica-digitalOnverter y conectar el convertidor a una computadora; Las líneas de conexión deben ser tratadas cuidadosamente para que no se enreden.
- Seleccione una frecuencia de muestreo de al menos 10.000 Hz en la unidad de adquisición de datos para la grabación (el ancho de banda del transmisor es 1-100 Hz). Asegúrese de que los datos se muestreen correctamente.
- Después de obtener la línea base de registro, inyectar el cabello intraperitonealmente con ácido cainico (KA) (2 mg / kg) para inducir ataques epilépticos. 15 min después de la inyección de KA observar y registrar las descargas epilépticas. Los productos de la incautación a través de KA suelen ser físicos.
NOTA: La duración ictal-tónica es de aproximadamente 15,2 ± 0,9 s, la duración de la crisis es de aproximadamente 62 ± 5 s. Las convulsiones se pueden prevenir en la rata neonatal dando inyección de IP de hidrato de cloral (400 mg / kg). - Guarde los datos digitalizados y analícelos utilizando paquetes de software de procesamiento de señales, como spike2. Revelar el nivel de potencia de los diferentes componentes de frecuencia en la señal EEG neonatal por perfOrming un análisis de espectro de potencia. Calcule la potencia en un intervalo de tiempo de 1 minuto encontrando la amplitud de la raíz media cuadrada de 1 a 100 Hz (banda de EEG) 9 .
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Representative Results
Si los procedimientos quirúrgicos anteriores se llevan a cabo adecuadamente, se llevará a cabo con éxito un registro de EEG de un recién nacido de rata de rata de canal. 10 min después de la inyección de KA, un patrón regular de signos de comportamiento surgió en forma de movimientos irregulares y arañazos, temblores y pérdida de equilibrio. La Figura 2 muestra las trazas representativas del EEG bruto y las trazas expandidas ictal-tónicas e ictal-clónicas interictal. Recurrente interictal y ictal EEG descarga patrones comenzó 15-60 min (30 ± 5,2 min, media ± SEM) después de la inyección de KA ( Figura 2A y 2B ). La figura 2D y 2E representa las convulsiones tónico-clónicas que son el tipo más común. La duración ictal-tónica duró 15,2 ± 0,9 s ( Figura 2D ). Los resultados representativos mostraron que las descargas tónicas fueron seguidas de ráfagas clónicas ( Figura 2B, 2D y 2 E ).
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Figura 1: Ilustración del Protocolo de Implantación Quirúrgica. ( A ) Pines diminutos de la computadora. ( B ) Clavija hembra (izquierda) y clavija macho (derecha). La barra de escala se utiliza para medir la longitud del pasador hembra. ( C ) Perno hembra y macho conectado. ( D ) Cráneo expuesto. N ◦ 1 presenta el sitio de referencia, el N ◦ 2 presenta Bregma, N ◦ 3 y 4 presentan los sitios de registro, y N ◦ 5 presenta Lambda. ( E ) Implantación del electrodo. El número 1 presenta el electrodo de referencia, los números 3 y 4 presentan el electrodo de registro. ( F ) Perrito de rata recuperado (P9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2: Convulsión Neonatal inducida por KA. ( A ) Un rastreo EEG representativo de una rata P10 que se inyectó con KA (2 mg / kg, ip) mostró descargas de ráfagas epilépticas recurrentes. ( B ) Vista ampliada de las descargas epilépticas de un solo racimo de la caja en A. ( C , D y E ) Las huellas interictal, ictal-tónica e ictal-clónica típicas se expandieron del cuadro de B. ( F ) La potencia promedio de EEG (1 min de ventana de tiempo) antes y después de la inyección de KA (media ± SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración de la grabación EEG. La grabación representativa del rastro es shoWn en el cachorro de rata neonatal que se mueve libremente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, informamos de los procedimientos quirúrgicos y de registro para la adquisición de EEG en libre movimiento neonatal cachorros de rata por cable método ( Figura 3 ]. Se ha sugerido que el cachorro de rata P7-P12 está en la edad de desarrollo que corresponde a un recién nacido humano a término 10 , 11 . Es técnicamente difícil obtener datos de registro de EEG de alta calidad cuando se trabaja con cachorros de rata en este grupo de edad. Además, requiere un manejo especializado y un gran cuidado 8 .
Estudios previos que examinan grabaciones de EEG in vivo en ratas neonatales se han llevado a cabo utilizando soluciones de grabación por cable en P12 o animales más antiguos [ 12] , pero estos enfoques son muy costosos. Al confiar en electrodos simples, hemos sido capaces de hacer un electrodo ( Figura 1 ) que reduce el costo del experimento a tan poco como $ 1, mientras que sigue dando alta densidad EEGGrabaciones. La implantación quirúrgica en este método puede tomar tan poco como 10 min, dependiendo de la complejidad de la cirugía.
Los pasos críticos en este protocolo son la implantación de electrodos. Debe hacerse con cuidado. Para mantener un contacto constante del electrodo con el cráneo, es importante considerar los siguientes pasos. En primer lugar, eliminar los residuos de tejido en el cráneo con la ayuda de hisopo de algodón esterilizado, ya que puede separar el electrodo del cráneo. En segundo lugar, utilizar cianoacrilato adecuadamente para conectar el electrodo con el cráneo. En tercer lugar, mantener la viscosidad adecuada del cemento dental. Es mejor aplicar cemento dental en dos capas; La primera capa debe ser un poco densa para cubrir el cráneo, mientras que la segunda capa debe ser un poco líquido para cubrir las esquinas de la primera capa. Golpee suavemente el cemento dental con una punta de pipeta para estabilizarla para hacer la unión adhesiva fuerte. Si es demasiado acuoso puede construir una capa aislante debajo del electrOde, y si es demasiado denso, el cemento dental se caerá fácilmente del cráneo debido a su propio peso. También es importante mantener la temperatura corporal del cachorro a 37 ° C durante la cirugía para la supervivencia.
La aplicación de este procedimiento se limita a la grabación de EEG en crías de rata neonatal entre las edades de P8 y P15 porque los cachorros en crecimiento pueden quitar el cemento dental y el electrodo de su cráneo. En términos de aplicaciones adicionales, este método también puede usarse para registrar la actividad eléctrica de ratas y ratones adultos después de una modificación menor. Además, este método se presta bien para su uso en diversos experimentos conductuales, tales como el laberinto elevado más.
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Disclosures
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de China (31171355) y la Fundación de Ciencias Naturales de Guangdong (S2011010003403, 2014A030313440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
- Pereda, A. E. Electrical synapses and their functional interactions with chemical synapses. Nat Rev Neurosci. 15 (4), 250-263 (2014).
- Chorev, E., Epsztein, J., Houweling, A. R., Lee, A. K., Brecht, M. Electrophysiological recordings from behaving animals--going beyond spikes. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 513-519 (2009).
- Freeborn, D. L., McDaniel, K. L., Moser, V. C., Herr, D. W. Use of electroencephalography (EEG) to assess CNS changes produced by pesticides with different modes of action: effects of permethrin, deltamethrin, fipronil, imidacloprid, carbaryl, and triadimefon. Toxicol Appl Pharmacol. 282 (2), 184-194 (2015).
- Werhahn, K. J., Hartl, E., Hamann, K., Breimhorst, M., Noachtar, S. Latency of interictal epileptiform discharges in long-term EEG recordings in epilepsy patients. Seizure. 29, 20-25 (2015).
- Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A.
- Nimmrich, V., Draguhn, A., Axmacher, N. Neuronal Network Oscillations in Neurodegenerative Diseases. Neuromolecular Med. 17 (3), 270-284 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. J Vis Exp. (101), e52554 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Dzhala, V. I., et al. NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. Nat Med. 11 (11), 1205-1213 (2005).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Savard, A., et al. Involvement of neuronal IL-1beta in acquired brain lesions in a rat model of neonatal encephalopathy. J Neuroinflammation. 10, 110 (2013).
- Cuaycong, M., et al. A novel approach to the study of hypoxia-ischemia-induced clinical and subclinical seizures in the neonatal rat. Dev Neurosci. 33 (3-4), 241-250 (2011).
