Summary
Her introducerer vi en ny teknik designet til at optage elektroencefalografi (EEG) i frie bevægelige neonatale epileptiske hvalpe og beskrive dets procedurer, funktioner og anvendelser. Denne metode gør det muligt at optage EEG i mere end 1 uge.
Abstract
EEG er en nyttig metode til at registrere elektrisk aktivitet i hjernen. Desuden er det et udbredt diagnostisk værktøj til forskellige neurologiske tilstande, såsom epilepsi og neurodegenerative lidelser. Det er imidlertid teknisk svært at opnå EEG-optagelser hos nyfødte, da det kræver specialbehandling og stor omhu. Her præsenterer vi en ny metode til registrering af EEG hos nyfødte rottepupper (P8-P15). Vi konstruerede en simpel og pålidelig elektrode ved hjælp af computerstiften loci; Det kan let implanteres i kraniet af en rottepuppe for at optage EEG-signaler af høj kvalitet i den normale og epileptiske hjerne. Hvalpe fik en intraperitoneal (ip) injektion af neurotoxin kaininsyre (KA) for at inducere epileptiske anfald. Den kirurgiske implantation udført i denne procedure er billigere end andre EEG-procedurer for nyfødte. Denne metode gør det muligt at optage højkvalitets og stabile EEG signaler i mere end 1 uge. Desuden kan denne procedure også anvendes på voksne raTs og mus for at studere epilepsi eller andre neurologiske lidelser.
Introduction
Det er veletableret, at kontinuerlig kommunikation mellem neuroner er nødvendig for at opnå normal hjernefunktion. Den interneuronale kommunikation finder primært sted ved synapser, hvor information fra en neuron overføres til en anden neuron. Denne synaptiske transmission formidles af to typer dedikerede strukturelle arrangementer: elektriske eller kemiske synapser 1 . Elektrofysiologi er det felt, der fanger det elektriske potentiale, der produceres under interneuronal kommunikation, der styrer overordnede kropsfunktioner og adfærd 2 . EEG er den mest almindeligt anvendte metode blandt mange elektrofysiologiske teknikker.
EEG er en teknik, der bruges til at detektere ændringer i elektriske signaler frembragt af interne eller eksterne stimuli. Desuden er det en væsentlig test for klinisk diagnose og resultatforudsigelse af forskellige neurologiske tilstande som epilepsi, Parkinsons og Alzheimers sygdommeE, samt virkninger af farmakologiske og toksikologiske midler 3 . Generelt viser en epileptisk patient hyperexcitabilitet og nedsat funktionel forbindelse i hjernen; Disse er opsummeret som interictal epileptiformudladninger (IEDs) og kan optages af EEG i form af skarpe, forbigående pigge; Skarpe bølger; Spike-bølge komplekser; Eller polyspikes 4 . Hovedegenskaben i den epileptiske hjerne er den spontane forekomst af epileptiske anfald, som kan optages enten fra hovedbunden eller fra hjernens parenchyma for at lokalisere hjerneområdet, der er ansvarligt for anfaldene 5 . Endvidere har EEG også meget vigtige implikationer i neurodegenerative lidelser som Alzheimers sygdom (AD). Forskning tyder på, at ændrede EEG-optagelser og svækkede oscillatoriske netværk hos AD-patienter er almindelige. Men vores viden om patofysiologien af netværksoscillationer i neurodegenerative sygdomme iEr overraskende ufuldstændig og skal undersøges nærmere 6 .
I denne protokol har vi designet en simpel elektrode med hvilken man kan registrere EEG for at forstå den elektriske kommunikation i både den normale og den patologiske hjerne. Den kirurgiske implantation i denne metode er billigere end andre tilgængelige procedurer 7 . Desuden kan denne metode bruges til at registrere højkvalitets og stabile EEG signaler for længere tidsrammer ( dvs. 2-4 timer hver dag i 1 uge). Derudover brugte vi lysere elektroder (vejer ca. 26 mg), der gør det muligt for dyrene at opføre sig mere naturligt 8 . Denne metode er meget anvendelig til undersøgelsen af EEG hos neonatale rottepupper, der kræver forstærkeren og digitaliseringsapparatet, der almindeligvis anvendes i elektrofysiologi lab og kræver ingen yderligere enheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrpleje, kirurgisk indgreb og optagelsesprocedurer var i overensstemmelse med retningslinjerne for Dyrepleje og Brugskomitéen for Sydkinesiske Normal Universitet.
1. Elektrodeforberedelse (figur 1A-C)
BEMÆRK: Computer pin loci er simpelthen en ledet kontakt som en del af signalgrænsefladen i kommunikationsenheder. Den består af en hanstik, der stikker ind i hunkontakten.
- Adskilt forsigtigt han- og hunstifterne fra computerstiften loci ( figur 1A ) ved hjælp af en pincer. Tilslut han- og hunpindene sammen for at danne en elektrode og anvende cyanoacrylat for at skabe en stærk klæbebinding ( figur 1C ).
- Sæt elektroderne i et bæger fyldt med destilleret vand til og læg det til ultralydsrenseren i 10 minutter. Flyt dem til en tørreovn ved 45 ° C i 30 minutter. Steriliser elektroderne ved hjælp af UV-lys i 30 minutter.
2. Kirurgisk procedure (Figur 1D-F)
- Forbered de steriliserede kirurgiske instrumenter og stereotaksiske apparater. Bedøve de neonatale rottepupper ved brug af isoflurananæstesi (2,5%) med luft. Når pupen er dybt bedøvet, juster dosis isofluran til 1,0%. Udfør en hale eller tå kniv før operationen for at sikre den rette dybde af anæstesi.
- Fastgør puppens hoved i det stereotaxiske apparat ved at placere ørestængerne ind i ørekanalerne og stram dem lidt.
BEMÆRK: Stram ikke øremærkerne for meget, da nyfødselsskallen er meget blød. - Oprethold det sterile kirurgiske felt ved at sprøjte alt udstyr med 70% ethanol. Lav et 15 mm snit på hovedet ved hjælp af en skalpel. Træk forsigtigt hovedbunden ud af midterlinjen ved de fire hjørner ved hjælp af tang. Sæt lidt saltvandssuget bomuld under huden for at holde snittet bredt åbent ( figur 1D ).
- Find bregma og lambda point på kranietOg marker dem med en blyant. Brug en sprøjte nål (26 G) til at lave to burr huller i den præfrontale cortex (PFC) og hippocampus.
BEMÆRK: PFC'en er placeret +1,8 mm bagved bregma og -0,5 mm lateralt til midterlinien, mens hippocampus er placeret på -2,0 mm anterior til bregma og ± 0,5 mm lateralt til midterlinjen ( figur 1D og E ). Dybden af elektroden bør ikke være mere end 2 mm under den kortikale overflade for at minimere hjerneskade. - Brug tænger til at holde elektroderne og indsæt reference- og optagelektroderne i henholdsvis PFC og hippocampus. Påfør erythromycin salve rundt om elektroden for at undgå enhver mulig infektion. Fastgør elektroden ved hjælp af cyanoacrylat.
- Forbered dental akrylcement, så den har en klæbrig og viskøs konsistens. Påfør dentalcementen for at dække elektroderne og resten af kraniet.
BEMÆRK: Tør kraniet grundigt, inden du applicerer tandcementen. Påfør 5% picric syre på elektroderne for at beskytte dem.
BEMÆRK: Hele proceduren skal udføres i en bioafskærmningshætte for at opretholde sterile forhold. - Fjern dyret fra den stereotaxiske ramme og injicer 300 μL 10% glucose subkutant. Placer det på et opvarmet tæppe til genopretning. Sørg for, at dyret er varmt (37 ° C) og ambulatorisk ( dvs. helt genindvundet). Administrer buprenorphin intraperitonealt (0,05 mg / kg) til postkirurgisk smerte.
BEMÆRK: Forlad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har fået tilstrækkelig bevidsthed (dvs. normal adfærd og bevægelse). - Return pupen til sit hjem bur med deres dæmning, efter at det genvinder bevidstheden. Vent i to dage, indtil dyret er fuldt ud genoprettet.
3. EEG optagelse
- Efter fuld genopretning skal elektroderne implanteres på skalens hvalp til forstærkeren i eget bur. Forbind forstærkeren til en analog til digital cOmformer og fastgør konverteren til en computer; Forbindelsesledningerne bør behandles omhyggeligt, så de ikke bliver sammenbrudt.
- Vælg mindst 10.000 Hz samplingshastighed på dataindsamlingsenheden til optagelse (senderens båndbredde er 1-100 Hz). Sørg for, at dataene samples korrekt.
- Efter at have fået baseline registrering, injicer pupen intraperitonealt med kaininsyre (KA) (2 mg / kg) for at fremkalde epileptiske anfald. 15 min efter KA-injektionen observere og registrere de epileptiske udledninger. Beslagproduktion gennem KA er normalt fysisk.
BEMÆRK: Den ictal-toniske varighed er ca. 15,2 ± 0,9 s, beslaglængden er ca. 62 ± 5 s. Beslag kan forhindres i neonatal rotte ved at give IP-injektion af chloralhydrat (400 mg / kg). - Gem de digitaliserede data og analyser det ved hjælp af signalbehandling softwarepakker, såsom spike2. Reveal effektniveauet af forskellige frekvenskomponenter i neonatal EEG-signalet ved perfFormatering af en effektspektrumanalyse. Beregn strømmen i en 1-min tidsramme ved at finde den rot-middel-firkantede amplitude fra 1 til 100 Hz (EEG-bånd) 9 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis ovennævnte kirurgiske indgreb udføres korrekt, vil en neonatal pup-EEG-optagelse med en kanal fra rotte blive gennemført med succes. 10 min efter KA-indsprøjtningen opstod et regelmæssigt mønster af adfærdsmæssige tegn i form af uregelmæssige bevægelser og ridser, rystelser og tab af balance. Figur 2 viser de repræsentative rå EEG-spor og interiktale, ictal-toniske og ictal-kloniske ekspanderede spor. Tilbagevendende interiktale og ictal EEG-udladningsmønstre startede 15-60 minutter (30 ± 5,2 min, middel ± SEM) efter KA-injektion ( Figur 2A og 2B ). Figur 2D og 2E repræsenterer tonisk-kloniske anfald, som er den mest almindelige type. Den ictal-toniske varighed varede 15,2 ± 0,9 s ( figur 2D ). De repræsentative resultater viste, at toniske udledninger blev efterfulgt af kloniske udbrud ( figur 2B, 2D og 2E ).
E_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1: Illustration af kirurgisk implantationsprotokol. ( A ) Lille computerstifter. ( B ) Kvindepen (venstre) og hankøn (højre). Skalestangen bruges til at måle længden af kvindestiften. ( C ) Tilknyttet kvindelig og hankøn. ( D ) Exposed skull. Nr. 1 præsenterer referencestedet, nr. 2 præsenterer Bregma, nr. 3 og 4 nuværende optagelsessteder, og nr. 5 præsenterer lambda. ( E ) Elektrodeimplantation. Nr. 1 præsenterer referenceelektroden, nr. 3 og 4 præsenterer optageelektroden. ( F ) Gendannet rottepuppe (P9). Klik her for at se en større version af denne figur.
D / 55489 / 55489fig2.jpg "/>
Figur 2: KA-induceret neonatal seizur. ( A ) Et repræsentativt EEG-spor fra en P10-rotte, der blev injiceret med KA (2 mg / kg, ip) viste gentagne epileptiske udbrud. ( B ) Udvidet visning af enkeltklyngelignende epileptiske udladninger fra boksen i A. ( C , D og E ). Typiske interiktale, ictaltoniske og ictal-kloniske spor udvides fra boksen i B. ( F ) Summariserede data viser Den gennemsnitlige EEG-effekt (1 min tidsvindue) før og efter KA-injektionen (middel ± SEM). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Opsætning af EEG-optagelse. Repræsentativ sporoptagelse er shoWn i frit bevægende neonatal rotte pup. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her rapporterer vi kirurgiske og optagelsesprocedurer for at erhverve EEG i frie bevægelige neonatale rottepupper ved hjælp af kablet metode ( Figur 3 ). Det er blevet foreslået, at P7-P12 rottepuppen er i udviklingsalderen, der svarer til et fuldtids menneskeligt nyfødt 10 , 11 . Det er teknisk svært at opnå EEG-optagelsesdata af høj kvalitet, når de arbejder med rottepupper i denne aldersgruppe. Derudover kræver det specialiseret håndtering og stor omhu 8 .
Tidligere undersøgelser, der undersøgte in vivo EEG-optagelser hos neonatale rotter, er blevet udført ved hjælp af kablede optagelsesløsninger hos P12 eller ældre dyr 12 , men disse fremgangsmåder er meget dyre. Ved at stole på enkle elektroder har vi været i stand til at lave en elektrode ( Figur 1 ), der reducerer omkostningerne ved eksperimentet til så lidt som $ 1, mens det stadig giver høj densitet EEGoptagelser. Kirurgisk implantering i denne metode kan tage så lidt som 10 minutter afhængigt af kirurgiets kompleksitet.
De kritiske trin i denne protokol er implantationen af elektroder. Det skal gøres omhyggeligt. For at opretholde konstant kontakt af elektroden med kraniet, er følgende trin vigtige at overveje. For det første skal du fjerne vævsaffaldet på kraniet ved hjælp af steriliseret vatpind, fordi det kan sætte elektroden fra hinanden fra kraniet. For det andet brug cyanoacrylat korrekt til at fastgøre elektroden med kraniet. For det tredje behold den dentalcement tilstrækkelige viskositet. Det er bedre at anvende dentalcement i to lag; Første lag skal være lidt tæt på at dække kraniet, mens det andet lag skal være lidt løbende for at dække hjørnerne af første lag. Tryk let på dentalcementen med et pipettespids for at sætte det ned for at opnå den stærke klæbemiddelbinding. Hvis det er for vandigt, kan det danne et isolerende lag under elOde, og hvis det er for tæt, dentalcement vil let falde fra kraniet på grund af sin egen vægt. Det er også vigtigt at opretholde hvalpens kropstemperatur ved 37 ° C igennem operationen for overlevelse.
Anvendelsen af denne procedure er begrænset til optagelse af EEG hos nyfødte rottepupper mellem P8 og P15, fordi de voksende hvalpe kan fjerne dentalsementet og elektroden fra deres kraniet. Med hensyn til yderligere anvendelser kan denne metode også anvendes til registrering af den elektriske aktivitet af voksne rotter og mus efter mindre modifikation. Desuden gør denne metode sig godt til at bruge i forskellige adfærdsmæssige forsøg, såsom den forhøjede plus labyrint.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Natural Science Foundation of China (31171355) og Guangdong Science Foundation (S2011010003403, 2014A030313440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
- Pereda, A. E. Electrical synapses and their functional interactions with chemical synapses. Nat Rev Neurosci. 15 (4), 250-263 (2014).
- Chorev, E., Epsztein, J., Houweling, A. R., Lee, A. K., Brecht, M. Electrophysiological recordings from behaving animals--going beyond spikes. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 513-519 (2009).
- Freeborn, D. L., McDaniel, K. L., Moser, V. C., Herr, D. W. Use of electroencephalography (EEG) to assess CNS changes produced by pesticides with different modes of action: effects of permethrin, deltamethrin, fipronil, imidacloprid, carbaryl, and triadimefon. Toxicol Appl Pharmacol. 282 (2), 184-194 (2015).
- Werhahn, K. J., Hartl, E., Hamann, K., Breimhorst, M., Noachtar, S. Latency of interictal epileptiform discharges in long-term EEG recordings in epilepsy patients. Seizure. 29, 20-25 (2015).
- Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A.
- Nimmrich, V., Draguhn, A., Axmacher, N. Neuronal Network Oscillations in Neurodegenerative Diseases. Neuromolecular Med. 17 (3), 270-284 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. J Vis Exp. (101), e52554 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Dzhala, V. I., et al. NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. Nat Med. 11 (11), 1205-1213 (2005).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Savard, A., et al. Involvement of neuronal IL-1beta in acquired brain lesions in a rat model of neonatal encephalopathy. J Neuroinflammation. 10, 110 (2013).
- Cuaycong, M., et al. A novel approach to the study of hypoxia-ischemia-induced clinical and subclinical seizures in the neonatal rat. Dev Neurosci. 33 (3-4), 241-250 (2011).
