Summary
Ici, nous introduisons une nouvelle technique conçue pour enregistrer l'électrodéphalographie (EEG) dans les chiots épileptiques néonataux à déplacement libre et décrire ses procédures, leurs caractéristiques et leurs applications. Cette méthode permet d'enregistrer EEG pendant plus d'une semaine.
Abstract
L'EEG est une méthode utile pour détecter l'activité électrique dans le cerveau. En outre, il s'agit d'un outil de diagnostic largement utilisé pour diverses affections neurologiques, telles que l'épilepsie et les troubles neurodégénératifs. Cependant, il est techniquement difficile d'obtenir des enregistrements EEG chez les nouveau-nés car il nécessite une manipulation spécialisée et un grand soin. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour enregistrer EEG chez les chiots de rats néonataux (P8-P15). Nous avons conçu une électrode simple et fiable utilisant des loci de broches informatiques; Il peut être facilement implanté dans le crâne d'un chien de rat pour enregistrer des signaux EEG de haute qualité dans le cerveau normal et épileptique. Les chiots ont reçu une injection intrapéritonéale (ip) de l'acide neurotoxine kainique (KA) pour induire des crises épileptiques. L'implantation chirurgicale effectuée dans cette procédure est moins coûteuse que les autres procédures EEG pour les nouveau-nés. Cette méthode permet d'enregistrer des signaux EEG de haute qualité et stables pendant plus d'une semaine. En outre, cette procédure peut également être appliquée à l'adulte raTs et souris pour étudier l'épilepsie ou d'autres troubles neurologiques.
Introduction
Il est bien établi qu'une communication continue entre les neurones est requise pour obtenir une fonction cérébrale normale. La communication interneuronale se déroule principalement dans les synapses, où l'information provenant d'un neurone est transmise à un deuxième neurone. Cette transmission synaptique est médiée par deux types d'arrangements structurels dédiés: synapses électriques ou chimiques 1 . L'électrophysiologie est le domaine qui capture le potentiel électrique produit lors de la communication interneuronale qui contrôle les fonctions et le comportement du corps 2 . L'EEG est la méthode la plus couramment utilisée parmi de nombreuses techniques électrophysiologiques.
L'EEG est une technique utilisée pour détecter les changements dans les signaux électriques produits par des stimuli internes ou externes. En outre, c'est un test essentiel pour le diagnostic clinique et la prédiction des résultats de diverses affections neurologiques telles que l'épilepsie, la maladie de Parkinson et la maladie d'AlzheimerE, ainsi que les effets des agents pharmacologiques et toxicologiques 3 . Généralement, un patient épileptique montre une hyperexcitabilité et une connectivité fonctionnelle réduite dans le cerveau; Ceux-ci sont résumés comme des décharges interculturelles d'épileptiforme (IED) et peuvent être enregistrés par EEG sous la forme de pointes pointues et transitoires; Ondes nettes; Complexes piquants; Ou polyspikes 4 . La principale caractéristique du cerveau épileptique est l'apparition spontanée de convulsions épileptiques, qui peuvent être enregistrées à partir du cuir chevelu ou du parenchyme cérébral afin de localiser la zone cérébrale responsable des crises 5 . En outre, EEG a également des implications très importantes dans les troubles neurodégénératifs comme la maladie d'Alzheimer (AD). La recherche suggère que les enregistrements d'EEG altérés et les réseaux oscillants altérés chez les patients atteints d'AD sont fréquents. Cependant, notre connaissance de la pathophysiologie des oscillations du réseau dans les maladies neurodégénératives iEst étonnamment incomplet et doit être exploré plus avant 6 .
Dans ce protocole, nous avons conçu une électrode simple avec laquelle on peut enregistrer EEG pour comprendre la communication électrique dans le cerveau normal et le cerveau pathologique. L'implantation chirurgicale dans cette méthode est moins coûteuse que les autres procédures disponibles 7 . En outre, cette méthode peut être utilisée pour enregistrer des signaux EEG de haute qualité et stables pour des délais plus longs ( c.-à-d. 2-4 h tous les jours pendant 1 semaine). En outre, nous avons utilisé des électrodes plus légères (pesant environ 26 mg) qui permettent aux animaux de se comporter plus naturellement 8 . Cette méthode est largement applicable à l'étude de l'EEG chez les chiots de rat néonatale qui nécessite l'amplificateur et le numériseur, couramment utilisé dans le laboratoire d'électrophysiologie et ne nécessite aucun dispositif supplémentaire.
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Protocol
Les procédures de soins, d'intervention chirurgicale et d'enregistrement des animaux étaient conformes aux lignes directrices pour le Comité de soins et d'utilisation des animaux de l'Université normale de Chine du Sud.
1. Préparation de l'électrode (figure 1A-C)
REMARQUE: Les loci des broches de l'ordinateur sont simplement un contact en longueur comme une partie de l'interface du signal dans les dispositifs de communication. Il se compose d'un connecteur mâle qui se branche dans le connecteur femelle.
- Séparez soigneusement les broches mâle et femelle des loci des broches de l'ordinateur ( Figure 1A ) à l'aide d'une pincée. Connectez les broches mâle et femelle ensemble pour former une électrode et appliquez du cyanoacrylate pour créer une forte liaison adhésive ( Figure 1C ).
- Mettez les électrodes dans un bécher rempli d'eau distillée et placez-la sur un nettoyeur à ultrasons pendant 10 min. Déplacez-les dans un four à sécher à 45 ° C pendant 30 min. Stériliser les électrodes à l'aide de la lumière UV pendant 30 min.
2. Procédure chirurgicale (figure 1D-F)
- Préparez les instruments chirurgicaux stérilisés et les appareils stéréotaxiques. Anesthésier le cancer du neonatal utilisant une anesthésie à l'isoflurane (2,5%) avec de l'air. Lorsque le chiot est profondément anesthésié, ajustez la dose d'isoflurane à 1,0%. Effectuer une pincée de queue ou de pied avant la chirurgie pour assurer la bonne profondeur de l'anesthésie.
- Fixer la tête du chiot dans l'appareil stéréotaxique en plaçant les barres de l'oreille dans les canaux de l'oreille et en les serrant légèrement.
REMARQUE: Ne pas serrer excessivement les barres de l'oreille, car le crâne néonatal est très doux. - Maintenir le champ chirurgical stérile en pulvérisant tout l'équipement avec 70% d'éthanol. Faire une incision de 15 mm sur la tête en utilisant un scalpel. À l'aide d'une pince, retirez doucement le cuir chevelu loin de la ligne médiane aux quatre coins. Mettez du coton imprégné de solution saline sous la peau pour garder l'incision bien ouverte ( Figure 1D ).
- Trouvez les points bregma et lambda sur le crâneEt les marquer avec un crayon. Utilisez une aiguille de seringue (26 G) pour créer deux trous de bavure dans le cortex préfrontal (PFC) et l'hippocampe.
NOTE: Le PFC est situé à +1,8 mm postérieur à bregma et -0,5 mm latéralement à la ligne médiane, tandis que l'hippocampe est situé à -2,0 mm avant bregma et ± 0,5 mm latéralement à la ligne médiane ( Figure 1D et E ). La profondeur de l'électrode ne doit pas être supérieure à 2 mm sous la surface corticale pour minimiser les dommages au cerveau. - Utilisez une pince pour maintenir les électrodes et insérer les électrodes de référence et d'enregistrement dans le PFC et l'hippocampe, respectivement. Appliquer la pommade à l'érythromycine autour de l'électrode pour éviter toute infection possible. Fixer l'électrode à l'aide de cyanoacrylate.
- Préparez un ciment acrylique dentaire afin qu'il ait une consistance gluante et visqueuse. Appliquer le ciment dentaire pour couvrir les électrodes et le reste du crâne.
REMARQUE: Sécher complètement le crâne avant d'appliquer le ciment dentaire. Appliquer 5% d'acide picrique sur les électrodes pour les protéger.
REMARQUE: toute la procédure doit être effectuée dans un capot de sécurité biologique pour maintenir des conditions stériles. - Enlevez l'animal du cadre stéréotaxique et injectez 300 μL de glucose à 10% par voie sous-cutanée. Placez-le sur une couverture chauffée pour récupérer. Assurez-vous que l'animal soit chaud (37 ° C) et ambulatoire ( c.-à-d. Entièrement récupéré). Administrer la buprénorphine par voie intrapéritonéale (0,05 mg / kg) pour la douleur post-chirurgicale.
REMARQUE: Ne laissez pas un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait retrouvé une conscience suffisante (c'est-à-dire un comportement et un mouvement normaux). - Retournez le chiot à sa cage à la maison avec leur barrage après avoir retrouvé la conscience. Attendez deux jours jusqu'à ce que l'animal soit complètement récupéré.
3. Enregistrement EEG
- Après une récupération complète, connectez les électrodes implantées sur le crâne du chiot à l'amplificateur dans sa propre cage. Connectez l'amplificateur à un c analogique-numériqueOnverter et attacher le convertisseur à un ordinateur; Les lignes de raccordement doivent être soigneusement traitées afin qu'elles ne s'imbriquent pas.
- Sélectionnez le taux d'échantillonnage d'au moins 10 000 Hz sur l'unité d'acquisition de données pour l'enregistrement (la bande passante de l'émetteur est de 1 à 100 Hz). Assurez-vous que les données sont échantillonnées correctement.
- Après avoir obtenu l'enregistrement de base, injecter le chien par voie intrapéritonéale avec de l'acide kainique (KA) (2 mg / kg) pour induire des crises épileptiques. 15 minutes après l'injection de KA, observer et enregistrer les décharges d'épilepsie. La saisie produite à travers KA est habituellement physique.
NOTE: La durée ictal-tonique est d'environ 15,2 ± 0,9 s, la durée de la crise est d'environ 62 ± 5 s. Les convulsions peuvent être évitées chez le rat néonatal en injectant de l'hydrate de chloral (400 mg / kg). - Enregistrez les données numérisées et analysez-les à l'aide de logiciels tels que spike2. Révéler le niveau de puissance de différentes composantes de fréquence dans le signal EEG néonatal par perfL'analyse d'un spectre de puissance. Calculez la puissance dans un intervalle de temps de 1 min en trouvant l'amplitude de la moyenne de la racine de 1 à 100 Hz (bande EEG) 9 .
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Representative Results
Si les procédures chirurgicales ci-dessus sont menées correctement, un enregistrement EEG de neonatat de rat d'un canal sera exécuté avec succès. 10 min après l'injection de KA, un schéma régulier de signes comportementaux a émergé sous la forme de mouvements irréguliers, de rayures, de tremblements et de perte d'équilibre. La figure 2 montre les traces représentatives d'EEG brutes et les traces expansées interictal, ictal-tonique et ictal-clonique. Les modèles récurrents de décharge d'EEG intertital et ictal ont commencé 15-60 min (30 ± 5,2 min; moyenne ± SEM) après l'injection de KA ( Figure 2A et 2B ). La figure 2D et 2E représente les convulsions toniques-cloniques qui sont le type le plus courant. La durée ictal-tonique a duré 15,2 ± 0,9 s ( figure 2D ). Les résultats représentatifs ont montré que les décharges toniques étaient suivies par des éclatements cloniques ( figure 2B, 2D et 2 E ).
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Figure 1: Illustration du protocole d'implantation chirurgicale. ( A ) Petits boutons informatiques. ( B ) Broche femelle (gauche) et broche mâle (droite). La barre d'échelle sert à mesurer la longueur de la broche femelle. ( C ) Épinglettes femelles et mâles connectées. ( D ) Crâne exposé. Le numéro 1 présente le site de référence, le n ° 2 présente les sites d'enregistrement Bregma, n ° 3 et 4 et le numéro 5 présente Lambda. ( E ) Implantation d'électrodes. Le numéro 1 présente l'électrode de référence, n ° 3 et 4 présentent l'électrode d'enregistrement. ( F ) Chou de rat retrouvé (P9). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 2: convulsions néonatales induites par KA. ( A ) Une trace EEG représentative d'un rat P10 qui a été injecté avec KA (2 mg / kg, ip) a montré des rejets périodiques d'éclatement épileptique. ( B ) Vue étendue des décharges épileptiques à une seule grappe de la boîte dans A. ( C , D et E ) Les traces typiques interictal, ictal-tonique et ictal-clonique ont été étendues dans la case de B. ( F ) Données résumées montrant La puissance EEG moyenne (fenêtre de temps de 1 min) avant et après l'injection KA (moyenne ± SEM). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: configuration de l'enregistrement EEG. L'enregistrement de traces représentatif est shoWn dans le chien de rat néonatal à mouvement libre. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici, nous signalons des procédures chirurgicales et d'enregistrement pour acquérir EEG dans les chiots de rats néonataux à déplacement libre par méthode filaire ( Figure 3 ). Il a été suggéré que le chi de rat P7-P12 est à l'âge de développement qui correspond à un nouveau-né humain à terme 10 , 11 . Il est techniquement difficile d'obtenir des données d'enregistrement EEG de haute qualité lorsqu'ils travaillent avec des chiots de rat dans ce groupe d'âge. En outre, il nécessite une manipulation spécialisée et un grand soin 8 .
Des études antérieures portant sur des enregistrements d' EEG in vivo chez des rats néonatals ont été menées en utilisant des solutions d'enregistrement câblées dans des animaux 12 ou plus 12 , mais ces approches sont très coûteuses. En s'appuyant sur des électrodes simples, nous avons pu fabriquer une électrode ( Figure 1 ) qui réduit le coût de l'expérience à seulement 1 $ tout en donnant à l'EEG haute densitéEnregistrements. L'implantation chirurgicale dans cette méthode peut prendre jusqu'à 10 min, selon la complexité de la chirurgie.
Les étapes critiques de ce protocole sont l'implantation d'électrodes. Il faut le faire avec attention. Pour maintenir un contact constant de l'électrode avec le crâne, les étapes suivantes sont importantes à considérer. Tout d'abord, enlever les débris tissulaires sur le crâne avec l'aide d'un coton-tige stérilisé parce qu'il peut séparer l'électrode du crâne. Deuxièmement, utilisez le cyanoacrylate correctement pour attacher l'électrode avec le crâne. Troisièmement, conserver la viscosité adéquate du ciment dentaire. Il est préférable d'appliquer du ciment dentaire en deux couches; La première couche devrait être un peu dense pour couvrir le crâne tandis que la deuxième couche devrait être un peu écrasante pour couvrir les coins de la première couche. Tapotez délicatement le ciment dentaire avec une pointe de pipette pour l'installer vers le bas pour obtenir une adhérence solide. Si elle est trop aqueuse, elle peut construire une couche isolante sous l'électronOde, et si elle est trop dense, le ciment dentaire tombera facilement du crâne en raison de son propre poids. Il est également important de maintenir la température du corps du chiot à 37 ° C tout au long de la chirurgie pour la survie.
L'application de cette procédure est limitée à l'enregistrement de l'EEG chez les chiots de rats néonatals entre les âges de P8 et P15 car les chiots croisés peuvent retirer le ciment dentaire et l'électrode de leur crâne. En ce qui concerne d'autres applications, cette méthode peut également être utilisée pour enregistrer l'activité électrique des rats et des souris adultes après une modification mineure. En outre, cette méthode se prête bien à l'utilisation dans diverses expériences comportementales, comme le plus grave labyrinthe.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Natural Science Foundation of China (31171355) et la Natural Science Foundation de Guangdong (S2011010003403, 2014A030313440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
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