Summary
यहां, हम नवजात शिशु पिल्ले को स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ने में इलेक्ट्रोएन्सेफालोग्राफी (ईईजी) को रिकॉर्ड करने के लिए डिजाइन की गई एक नई तकनीक का परिचय देते हैं और इसकी प्रक्रियाओं, विशेषताओं और अनुप्रयोगों का वर्णन करते हैं। यह विधि 1 सप्ताह से अधिक के लिए ईईजी को रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है।
Abstract
मस्तिष्क में विद्युत गतिविधि का पता लगाने के लिए ईईजी एक उपयोगी तरीका है। इसके अलावा, यह विभिन्न न्यूरोलॉजिकल परिस्थितियों के लिए एक व्यापक रूप से प्रयोग किया जाने वाला निदान उपकरण है, जैसे मिर्गी और neurodegenerative विकार। हालांकि, नवनीतियों में ईईजी रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए तकनीकी रूप से मुश्किल है क्योंकि इसमें विशेष संचालन और महान देखभाल की आवश्यकता होती है। यहां, हम नवजात चूहे पिल्ले (पी 8-पी 15) में ईईजी रिकॉर्ड करने के लिए एक उपन्यास विधि पेश करते हैं। हमने कंप्यूटर पिन लोकी का उपयोग करके एक साधारण और विश्वसनीय इलेक्ट्रोड बनाया है; यह आसानी से सामान्य और मिर्गीय मस्तिष्क में उच्च गुणवत्ता वाले ईईजी संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए चूहे के पिल्ला की खोपड़ी में लगाया जा सकता है। पिल्ले को मिरगी के दौरे को प्रेरित करने के लिए न्यूरोटॉक्सिन कैनीक एसिड (केए) के इंट्राप्टेरटोनियल (आईपी) इंजेक्शन दिया गया था। नवनीतियों के लिए अन्य ईईजी प्रक्रियाओं की तुलना में इस प्रक्रिया में किया गया शल्य प्रत्यारोपण कम महंगा है। यह विधि 1 से अधिक सप्ताह के लिए उच्च गुणवत्ता वाले और स्थिर ईईजी संकेतों को रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस प्रक्रिया को वयस्क आरए पर भी लागू किया जा सकता हैमिर्गी या अन्य तंत्रिका संबंधी विकारों का अध्ययन करने के लिए टीएस और चूहों।
Introduction
यह अच्छी तरह से स्थापित है कि सामान्य मस्तिष्क समारोह प्राप्त करने के लिए न्यूरॉन्स के बीच निरंतर संचार आवश्यक है। इंटर्न्योरोनल कम्युनिकेशन मुख्य रूप से सिंकैप्स पर होता है, जहां एक न्यूरॉन से जानकारी दूसरे न्यूरॉन को दी जाती है। यह अन्तर्ग्रथनी संचरण दो प्रकार की समर्पित संरचनात्मक व्यवस्थाओं द्वारा मध्यस्थता है: विद्युत या रासायनिक synapses 1 इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी एक ऐसा क्षेत्र है जो इंटर्न्योरोनियल संचार के दौरान विद्युत उत्पादन को हासिल करता है जो समग्र शरीर के कार्यों और व्यवहार 2 को नियंत्रित करता है। ईईजी कई इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीकों के बीच सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है।
ईईजी एक तकनीक है जो आंतरिक या बाहरी उत्तेजनाओं द्वारा उत्पादित बिजली के संकेतों में परिवर्तन का पता लगाता है। इसके अलावा, यह नैदानिक निदान के लिए एक अनिवार्य परीक्षण है और विभिन्न न्यूरोलॉजिकल स्थितियों जैसे कि मिर्गी, पार्किंसंस और अल्जाइमर के रोगों का परिणाम भविष्यवाणीई, साथ ही साथ औषधीय और विषैले एजेंटों के प्रभाव 3 । आम तौर पर, एक मिर्गीक रोगी मस्तिष्क के भीतर hyperexcitability और बिगड़ा फंक्शनल कनेक्टिविटी दिखाता है; इन्हें इंटरक्टल एपिलेप्टीफॉर्म डिस्चार्ज (आईईडी) के रूप में संक्षेप किया जाता है और ईईजी द्वारा तेज़, क्षणिक स्पाइक्स के रूप में दर्ज किया जा सकता है; तेज लहरें; स्पाइक-वेव परिसरों; या पॉलीस्पॉक्स 4 मिरगी मस्तिष्क की मुख्य विशेषता मिरगी बरामदगी की सहज घटना होती है, जो दौरे के लिए जिम्मेदार मस्तिष्क क्षेत्र का पता लगाने के लिए खोपड़ी या मस्तिष्क पैरेन्काइमा से या तो दर्ज की जा सकती है। इसके अलावा, अल्जाइमर रोग (एडी) जैसे neurodegenerative विकारों में ईईजी का भी बहुत महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। अनुसंधान से पता चलता है कि एडी रोगियों में ईईजी रिकॉर्डिंग और बिगड़ा हुई आसन्न नेटवर्क सामान्य हैं। हालांकि, neurodegenerative रोगों में नेटवर्क दोलनों के रोगविज्ञान के बारे में हमारा ज्ञानहै आश्चर्यजनक रूप से अधूरा और आगे की खोज की जानी चाहिए 6
इस प्रोटोकॉल में हमने एक साधारण इलेक्ट्रोड तैयार किया है जिसके साथ ईईजी को सामान्य और रोग दोनों में विद्युत संचार को समझने के लिए रिकॉर्ड किया जा सकता है। इस विधि में सर्जिकल इम्प्लीमेंटेशन अन्य उपलब्ध प्रक्रियाओं की तुलना में सस्ता है 7 । इसके अलावा, इस पद्धति का उपयोग लंबे समय तक सीमा के लिए उच्च गुणवत्ता और स्थिर ईईजी संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए किया जा सकता है ( यानी, प्रत्येक सप्ताह 2-4 घंटे प्रति दिन)। इसके अलावा, हम हल्के इलेक्ट्रोड (लगभग 26 मिलीग्राम वजन वाले) का इस्तेमाल करते थे जो जानवरों को अधिक स्वाभाविक रूप से व्यवहार करने में सक्षम करते हैं 8 । यह विधि नवजात शिशु के पिल्ले में ईईजी के अध्ययन के लिए व्यापक रूप से लागू होती है, जिसे एम्पलीफायर और डिजिटाइज़र की आवश्यकता होती है, आमतौर पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी लैब में इस्तेमाल होता है और किसी भी अतिरिक्त डिवाइस की आवश्यकता नहीं होती है।
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Protocol
पशु चिकित्सा, शल्य प्रक्रिया, और रिकॉर्डिंग प्रक्रियाएं दक्षिण चीन सामान्य विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार थीं।
1. इलेक्ट्रोड तैयारी (चित्रा 1 ए-सी)
नोट: कंप्यूटर पिन लोकी संचार उपकरणों में सिग्नल इंटरफेस के एक भाग के रूप में बस एक विशाल संपर्क है। इसमें एक पुरुष संबंधक होता है जो महिला कनेक्टर में प्लग करता है।
- पिनर की सहायता से कंप्यूटर पिन लोकी ( चित्रा 1 ए ) से नर और मादा पिंस को ध्यान से अलग करें। एक इलेक्ट्रोड बनाने के लिए नर और मादा पिनों को एक साथ जोड़कर एक मजबूत चिपकने वाला बंधन ( चित्रा 1 सी ) बनाने के लिए साइनोस्रीलाट लागू करें।
- इलेक्ट्रोड को बीकर के लिए आसुत पानी से भरा रखें और इसे 10 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक क्लीनर पर रखें। उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर सुखाने ओवन पर ले जाएं। 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश का उपयोग इलेक्ट्रोड को जीवाणुरहित करें
2. सर्जिकल प्रक्रिया (चित्रा 1 डी एफ)
- निष्फल शल्य चिकित्सा उपकरणों और स्टीरियोटेक्सिक उपकरण तैयार करें वायु के साथ isoflurane संज्ञाहरण (2.5%) का उपयोग कर नवजात चूहे पिट को एनेस्थेटिज़ करें जब पिल्ला गहरी संवेदनाहट करते हैं, तो आइसफ्लुरेन की मात्रा को 1.0% से समायोजित करें। संज्ञाहरण की उचित गहराई सुनिश्चित करने के लिए सर्जरी से पहले एक पूंछ या पैर की अंगुली को चुटकी करें।
- कान की नहरों में कान की सलाखों को रखकर और उन्हें थोड़ा कस कर stereotaxic उपकरण में पिल्ला के सिर को ठीक करें।
नोट: कान की सलाखों को ज़्यादा कसने से न करें, क्योंकि नवजात खोपड़ी बहुत नरम है। - 70% इथेनॉल के साथ सभी उपकरण छिड़काव द्वारा बाँझ शल्य चिकित्सा के क्षेत्र को बनाए रखें। एक स्केलपेल का उपयोग करके सिर पर 15-मिमी चीरा बनाएं। संदंश का उपयोग करना, धीरे-धीरे चारों कोनों पर सिर की चोटी से मिडलाइन से खींचें। चीरा खुली ( चित्रा 1 डी ) रखने के लिए त्वचा के नीचे कुछ खारा लथपथ कपास डालें।
- खोपड़ी पर ब्रेम्मा और लैम्ब्डा अंक ढूंढेंऔर उन्हें एक पेंसिल के साथ चिह्नित करें सिरिंज सुई का उपयोग करें (26 जी) के लिए दो burr छेद prefrontal प्रांतस्था (पीएफसी) और हिप्पोकैम्पस में बनाने के लिए
नोट: पीएफसी बैक्टीरिया के लिए +1.8 मिमी और मिडलाइन के लिए -0.5 मिमी पार्श्व में स्थित है, जबकि हिप्पोकैम्पस ब्रीगममा के लिए -2.0 मिमी पूर्व में स्थित है और मिडलाइन ( चित्रा 1 डी और ई ) के लिए 0.5 मिमी पार्श्व में स्थित है। मस्तिष्क क्षति को कम करने के लिए इलेक्ट्रोड की गहराई कोर्टेक्टिकल सतह के नीचे 2 मिमी से अधिक नहीं होनी चाहिए। - इलेक्ट्रोड को पकड़ने के लिए संदंश का प्रयोग करें और क्रमशः पीएफसी और हिप्पोकैम्पस में संदर्भ और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सम्मिलित करें। किसी भी संभव संक्रमण से बचने के लिए इलेक्ट्रोड के आसपास एरिथ्रोमाइसीन मरहम लगाइए। Cyanoacrylate का उपयोग कर इलेक्ट्रोड को ठीक करें
- दंत ऐक्रेलिक सीमेंट तैयार करें ताकि यह एक चिपचिपा और चिपचिपा स्थिरता हो। इलेक्ट्रोड और शेष खोपड़ी को कवर करने के लिए दंत सिमेंट लागू करें।
नोट: दंत सीमेंट लागू करने से पहले पूरी तरह से खोपड़ी को सूखा। इलेक्ट्रोड पर 5% पिक्रिक एसिड को उनकी रक्षा के लिए लागू करें।
नोट: बाध्यकारी परिस्थितियों को बनाए रखने के लिए पूरी प्रक्रिया एक बायोसाफेटी हुड में की जानी चाहिए। - स्टीरियोटेक्सिक फ़्रेम से जानवर निकालें और 300% μL को 10% ग्लूकोज के नीचे से निकालना। इसे वसूली के लिए एक गर्म कंबल पर रखें सुनिश्चित करें कि जानवर गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) और चलने वाला ( अर्थात, पूरी तरह से पुनर्प्राप्त)। शल्यचिकित्सा के दर्द के लिए ब्यूपेरोनोफिन का इंट्राटेरिटीन (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रशासन करना।
नोट: जब तक यह पर्याप्त चेतना (यानी सामान्य व्यवहार और आंदोलन) वापस आ गया है, तब तक जानवरों को न छोड़ें। - पिंजरे को उसके घर के पिंजरे को अपने बांध के साथ वापस आने के बाद वापस आना चेतना। जब तक जानवर पूरी तरह से ठीक नहीं हो जाता दो दिन तक प्रतीक्षा करें।
3. ईईजी रिकॉर्डिंग
- पूर्ण वसूली के बाद, अपने पिंजरे में एम्पलीफायर को पिल्ले की खोपड़ी पर लगाए गए इलेक्ट्रोड से जुड़ें। प्रवर्धक को एनालॉग-टू-डिजिटल सी से कनेक्ट करेंपलटनेवाला और एक कंप्यूटर को कनवर्टर संलग्न; कनेक्टिंग लाइनों का सावधानी से व्यवहार किया जाना चाहिए ताकि वे गड़बड़ी न करें।
- रिकॉर्डिंग के लिए डेटा अधिग्रहण इकाई पर कम से कम 10,000 हर्ट्ज नमूनाकरण दर चुनें (ट्रांसमीटर का बैंडविड्थ 1-100 हर्ट्ज है)। सुनिश्चित करें कि डेटा को ठीक से नमूना किया गया है।
- आधारभूत रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के बाद, पिल्ला को इंटेराइटिटोन से कैनीक एसिड (केए) (2 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ मिरगी बरामदगी उत्पन्न करने के लिए इंजेक्षन करें। केए इंजेक्शन के 15 मिनट के बाद मिर्गीय डिस्चार्ज का निरीक्षण और रिकॉर्ड करें। केए के माध्यम से जब्ती उत्पादन आमतौर पर शारीरिक हैं।
नोट: ictal- टॉनिक अवधि के बारे में 15.2 ± 0.9 एस है, जब्ती अवधि के बारे में 62 ± 5 एस है क्लोराल हाइड्रेट (400 मिलीग्राम / किग्रा) का आईपी इंजेक्शन देकर नवजात चूहे में बरामद किया जा सकता है। - डिजीटल डेटा को सहेजें और संकेत-प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर संकुल का उपयोग करके इसे विश्लेषण करें, जैसे स्पाइक 2। पेर्फ द्वारा नवजात ईईजी संकेत में विभिन्न आवृत्ति घटकों के विद्युत स्तर को प्रकट करेंएक शक्ति स्पेक्ट्रम विश्लेषण orming 1 से 100 हर्ट्ज (ईईजी बैंड) 9 से मूल-माध्य-वर्ग आयाम को खोजने के द्वारा 1-मिनट की समय-सीमा में बिजली की गणना करें
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Representative Results
यदि उपरोक्त शल्यचिकित्सा प्रक्रिया ठीक से आयोजित की जाती है, तो एक चैनल चूहे नवजात पिल्ला ईईजी रिकॉर्डिंग सफलतापूर्वक किया जाएगा। केए इंजेक्शन के 10 मिनट बाद, अनियमित आंदोलनों और खरोंच, झटके, और संतुलन की हानि के रूप में व्यवहार के संकेतों का एक नियमित पैटर्न उभरा। चित्रा 2 प्रतिनिधि प्रतिनिधि कच्चे ईईजी निशान और interictal, ictal- टॉनिक, और ictal-clonic विस्तारित निशान से पता चलता है। केए इंजेक्शन ( चित्रा 2 ए और 2 बी ) के बाद आवर्ती इंटरक्टल और ictal ईईजी निर्वहन पैटर्न 15-60 मिनट (30 ± 5.2 मिनट; मतलब ± SEM) शुरू किया। चित्रा 2 डी और 2 ई टॉनिक-क्लोनिक दौरे का प्रतिनिधित्व करते हैं जो सबसे सामान्य प्रकार हैं। Ictal- टॉनिक अवधि 15.2 ± 0.9 एस ( चित्रा 2 डी ) तक चली। प्रतिनिधि के परिणाम बताते हैं कि टॉनिक डिस्चार्ज को क्लोनिक फटने ( चित्रा 2 बी, 2 डी और 2 ई ) द्वारा किया गया।
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चित्रा 1: सर्जिकल इम्प्लांटेशन प्रोटोकॉल का चित्रण। ( ए ) छोटे कंप्यूटर पिन ( बी ) महिला पिन (बाएं) और पुरुष पिन (दाएं)। मादा पिन की लंबाई को मापने के लिए स्केल बार का उपयोग किया जाता है ( सी ) जुड़ा हुआ महिला और पुरुष पिन ( डी ) उजागर खोपड़ी। सं। 1 संदर्भ स्थल प्रस्तुत करता है, नं। 2 प्रस्तुत करता है ब्रेग्मा, नंबर 3 और 4 वर्तमान रिकॉर्डिंग साइटें, और नंबर 5 प्रस्तुत करता है लम्बा। ( ई ) इलेक्ट्रोड आरोपण सं। 1 संदर्भ इलेक्ट्रोड प्रस्तुत करता है, नंबर 3 और 4 रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड प्रस्तुत करता है। ( एफ ) बरामद चूहे पिल्ला (पी 9)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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चित्रा 2: केए द्वारा प्रेरित नवजात जब्ती। ( ए ) केए (2 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) के साथ इंजेक्शन वाले पी 10 चूहे से प्रतिनिधि ईईजी ट्रेस ने आवर्तित मिरगी फट डिस्पैच दिखाया। ( बी ) ए ( सी , डी और ई ) में बॉक्स से एकल क्लस्टर जैसी मिरगी विच्छेद का विस्तारित दृष्टिकोण बी ( एफ ) संक्षेप में दिखाए गए आंकड़ों के अनुसार बॉक्स में विस्तारित विशिष्ट इंटरक्टेल, टिक्की-टॉनिक, और ictal- क्लोनिक निशान औसत ईईजी शक्ति (1 मिनट का समय खिड़की) केए इंजेक्शन के पहले और बाद में (मतलब ± एसईएम)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: ईईजी रिकॉर्डिंग सेट अप प्रतिनिधि ट्रेस रिकॉर्डिंग थानेदार हैमुक्त नवजात चूहे पिल्ला चलने में wn इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
यहां, हम वायर्ड विधि ( चित्रा 3 ) द्वारा नवजात शिशु के पिल्ले को स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ने में ईईजी प्राप्त करने के लिए सर्जिकल और रिकॉर्डिंग प्रक्रिया की रिपोर्ट करते हैं। यह सुझाव दिया गया है कि पी 7-पी 12 चूहे पिल्ला विकासात्मक उम्र में है जो पूर्णकालिक मानव नवजात 10 , 11 से मेल खाती है। इस उम्र के समूह में चूहे पिल्ले के साथ काम करते समय उच्च गुणवत्ता वाली ईईजी रिकॉर्डिंग डेटा प्राप्त करना तकनीकी रूप से मुश्किल है। इसके अलावा, इसमें विशेष से निपटने और महान देखभाल की आवश्यकता है 8 ।
नवजात शिशुओं में विवो ईईजी रिकॉर्डिंग की जांच के पिछला अध्ययन पी 12 या पुराने जानवरों में वायर्ड रिकॉर्डिंग समाधानों के जरिए 12 आयोजित किए गए हैं, लेकिन ये दृष्टिकोण बहुत महंगा हैं। साधारण इलेक्ट्रोड पर भरोसा करके, हम एक इलेक्ट्रोड ( चित्रा 1 ) बनाने में सक्षम हुए हैं जो कि प्रयोग की लागत को कम कर देता है जबकि $ 1 को अभी भी उच्च घनत्व ईईजीरिकॉर्डिंग। सर्जरी की जटिलता के आधार पर, इस पद्धति में सर्जिकल आरोपण के रूप में 10 मिनट लग सकते हैं।
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम इलेक्ट्रोड का आरोपण है। इसे सावधानी से किया जाना चाहिए खोपड़ी के साथ इलेक्ट्रोड के लगातार संपर्क बनाए रखने के लिए, निम्न चरणों पर विचार करना महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, बाँझ कपास झाड़ू की मदद से खोपड़ी पर ऊतक मलबे को हटा दें क्योंकि यह खोपड़ी से इलेक्ट्रोड को अलग कर सकता है। दूसरे, खोपड़ी के साथ इलेक्ट्रोड को संलग्न करने के लिए ठीक साइनोस्रीलेट का उपयोग करें। तीसरा, दंत सीमेंट की पर्याप्त चिपचिपाहट रखें। दो परतों में दंत सिमेंट लागू करना बेहतर है; पहली परत खोपड़ी को कवर करने के लिए थोड़ा घने होनी चाहिए, जबकि दूसरी परत को पहली परत के कोनों को कवर करने के लिए थोड़ा बह जाना चाहिए। डेंटल सीमेंट को धीरे से विंदुक टिप के साथ टैप करें ताकि इसे मजबूत चिपकने वाला बंधन बना सके। यदि यह बहुत पानी है तो यह विद्युत के तहत एक इन्सुलेट परत बना सकता हैओडे, और यदि यह बहुत घना है, तो दंत सीमेंट आसानी से अपने वजन के कारण खोपड़ी से गिर जाएगी। अस्तित्व के लिए सर्जरी के दौरान पिल्ला के शरीर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखना भी महत्वपूर्ण है।
इस प्रक्रिया का आवेदन पी 8 और पी 15 की उम्र के बीच नवजात चूहे पिल्ले में ईईजी रिकॉर्डिंग तक सीमित है क्योंकि बढ़ते पिल्ले दंत सीमेंट और इलेक्ट्रल को अपनी खोपड़ी से हटा सकते हैं। आगे के अनुप्रयोगों के संदर्भ में, इस पद्धति का उपयोग छोटे परिवर्तन के बाद वयस्क चूहों और चूहों की विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, इस पद्धति का इस्तेमाल विभिन्न व्यवहार प्रयोगों में भी होता है, जैसे ऊंचा प्लस भूलभुलैया।
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Disclosures
ऑथर ने किसी हित संघर्ष की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
यह काम चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31171355) और गुआंगडोंग के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एस2011010003403, 2014 ए 3030343440) द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
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