Summary
هنا، نقدم تقنية جديدة تهدف إلى تسجيل تخطيط كهربية الدماغ (إيغ) في التحرك بحرية الجراء حديثي الولادة الصرع ووصف إجراءاتها، وميزات، والتطبيقات. يسمح هذا الأسلوب واحد لتسجيل إيغ لأكثر من 1 أسبوع.
Abstract
إيغ هو وسيلة مفيدة للكشف عن النشاط الكهربائي في الدماغ. وعلاوة على ذلك، بل هو أداة تشخيصية تستخدم على نطاق واسع لمختلف الظروف العصبية، مثل الصرع واضطرابات الاعصاب. ومع ذلك، فمن الصعب من الناحية الفنية الحصول على التسجيلات إيغ في حديثي الولادة لأنها تتطلب معالجة متخصصة وعناية كبيرة. هنا، نقدم طريقة جديدة لتسجيل إيغ في الجراء الفئران حديثي الولادة (P8-P15). قمنا بتصميم القطب بسيطة وموثوق بها باستخدام الكمبيوتر دبوس الموقع؛ فإنه يمكن زرعها بسهولة في الجمجمة من الجرو الفئران لتسجيل إشارات إيغ ذات جودة عالية في الدماغ الطبيعي والصرع. أعطيت الجراء الحقن داخل الصفاق (إب) من العصبية حمض الكاينيك (كا) للحث على نوبات الصرع. زرع الجراحة التي أجريت في هذا الإجراء هو أقل تكلفة من إجراءات التخطيط الدماغي الأخرى لحديثي الولادة. هذا الأسلوب يسمح واحد لتسجيل عالية الجودة ومستقرة إيغ إشارات لأكثر من 1 أسبوع. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا الإجراء أيضا را الكبارتيسي والفئران لدراسة الصرع أو غيرها من الاضطرابات العصبية.
Introduction
ومن الثابت أن التواصل المستمر بين الخلايا العصبية مطلوب للحصول على وظيفة الدماغ العادية. يتم الاتصال الداخلي في المقام الأول في نقاط الاشتباك العصبي، حيث يتم نقل المعلومات من الخلايا العصبية واحدة إلى الخلايا العصبية الثانية. وينتقل هذا الإرسال المتشابك بنوعين من الترتيبات الهيكلية المكرسة: المشابك الكهربائية أو الكيميائية 1 . الفيزيولوجيا الكهربية هو المجال الذي يلتقط القدرة الكهربائية المنتجة خلال الاتصالات إنترنيورونال التي تتحكم في وظائف الجسم عموما والسلوك 2 . إيغ هو الأسلوب الأكثر شيوعا بين العديد من التقنيات الكهربية.
إيغ هي تقنية تستخدم للكشف عن التغيرات في الإشارات الكهربائية التي تنتجها المحفزات الداخلية أو الخارجية. وعلاوة على ذلك، فإنه هو اختبار أساسي للتشخيص السريري والتنبؤ النتيجة من مختلف الظروف العصبية مثل الصرع، باركنسون والمرض الزهايمره، وكذلك آثار العوامل الدوائية والسمية 3 . بشكل عام، يظهر المريض الصرع فرط الحساسية و ضعف الاتصال الوظيفي داخل الدماغ. وتتلخص هذه كما التصريف الصرعي إنتيركتال (العبوات الناسفة) ويمكن تسجيلها من قبل إيغ في شكل طفرات حادة، عابرة. موجات حادة. سبايك-ويف كومبليسس؛ أو بوليسبيكيس 4 . السمة الرئيسية للدماغ الصرع هو حدوث عفوية من نوبات الصرع، والتي يمكن تسجيلها إما من فروة الرأس أو من حمة الدماغ من أجل تحديد موقع منطقة الدماغ المسؤولة عن المضبوطات 5 . وعلاوة على ذلك، إيغ له أيضا آثار هامة جدا في الاضطرابات العصبية مثل مرض الزهايمر (أد). وتشير البحوث إلى أن التسجيلات إيغ تغيير وشبكات التذبذب ضعيفة في مرضى م هي شائعة. ومع ذلك، معرفتنا حول الفيزيولوجيا المرضية للتذبذبات الشبكة في أمراض الاعصاب طs غير مكتملة بشكل مدهش ويحتاج إلى مزيد من الاستكشاف 6 .
في هذا البروتوكول، قمنا بتصميم قطب بسيط مع أي واحد يمكن أن تسجل إيغ لفهم الاتصالات الكهربائية في كل من الدماغ الطبيعي والمرضي. الزرع الجراحي في هذه الطريقة هو أرخص من غيرها من الإجراءات المتاحة 7 . وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتسجيل عالية الجودة ومستقرة إشارات التخطيط الدماغي لأطر زمنية أطول ( أي 2-4 ساعة كل يوم لمدة 1 أسبوع). وبالإضافة إلى ذلك، استخدمنا أقطاب أخف وزنا (وزنها حوالي 26 ملغ) التي تمكن الحيوانات من التصرف بشكل أكثر طبيعية 8 . هذا الأسلوب ينطبق على نطاق واسع لدراسة إيغ في الجراء الفئران حديثي الولادة التي تتطلب مكبر للصوت و التحويل الرقمي، وتستخدم عادة في مختبر الكهربية و لا يتطلب أي أجهزة إضافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وكانت رعاية الحيوان، والإجراءات الجراحية، وإجراءات التسجيل وفقا للمبادئ التوجيهية لجامعة جنوب الصين عادي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.
1. إعداد القطب (الشكل 1A-C)
ملاحظة: الكمبيوتر دبوس لوكي هو مجرد اتصال محاور كجزء من واجهة إشارة في أجهزة الاتصالات. وهو يتألف من موصل الذكور الذي المقابس في موصل الإناث.
- فصل بعناية دبابيس الذكور والإناث من الكمبيوتر دبوس الموقع ( الشكل 1A ) مع مساعدة من المكبس. ربط دبابيس الذكور والإناث معا لتشكيل القطب وتطبيق سيانوكريلات لخلق رابطة لاصقة قوية ( الشكل 1C ).
- وضع الأقطاب في كوب مملوء بالماء المقطر ل ووضعه بالموجات فوق الصوتية الأنظف لمدة 10 دقيقة. نقلها إلى فرن التجفيف في 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تعقيم الأقطاب باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
2. الإجراء الجراحي (الشكل 1D-F)
- إعداد الأدوات الجراحية المعقمة وجهاز التجسيمي. تخدير الجرو الفئران حديثي الولادة باستخدام التخدير إيسوفلوران (2.5٪) مع الهواء. عندما الجرو هو تخدير عميق، وضبط جرعة من الأيزوفلورين إلى 1.0٪. أداء ذيل أو أخمص القدمين قرصة قبل الجراحة لضمان العمق المناسب للتخدير.
- إصلاح رأس الجرو في الجهاز التجسيمي عن طريق وضع قضبان الأذن في قنوات الأذن وتشديدها قليلا.
ملاحظة: لا تشديد بشكل مفرط قضبان الأذن، والجمجمة حديثي الولادة لينة جدا. - الحفاظ على الحقل الجراحي العقيمة عن طريق رش جميع المعدات مع الايثانول 70٪. جعل شق 15 ملم على الرأس باستخدام مشرط. باستخدام ملقط، سحب بلطف فروة الرأس بعيدا عن خط الوسط في الزوايا الأربع. وضع بعض القطن المالحة غارقة تحت الجلد للحفاظ على شق مفتوحة على مصراعيها ( الشكل 1D ).
- العثور على بريجما ونقاط لامدا على الجمجمةووضع علامة عليها بقلم رصاص. استخدام إبرة حقنة (26 G) لجعل اثنين من الثقوب لدغ في قشرة الفص الجبهي (بك) والحصين.
ملاحظة: يقع بك في +1.8 ملم الخلفي ل بريجما و -0.5 ملم الوحشي إلى خط الوسط، في حين يقع الحصين في -2.0 ملم الأمامي ل بريجما و ± 0.5 ملم الوحشي إلى خط الوسط ( الشكل 1D و E ). لا ينبغي أن يكون عمق القطب أكثر من 2 مم تحت سطح القشرية للحد من تلف الدماغ. - استخدام ملقط لعقد الأقطاب وإدراج إشارة وتسجيل أقطاب في بك والحصين، على التوالي. تطبيق مرهم الاريثروميسين حول القطب لتجنب أي عدوى محتملة. إصلاح القطب باستخدام سيانوكريلات.
- إعداد الأسمنت الاكريليك الأسنان بحيث يكون لديه غلوي والاتساق لزج. تطبيق الاسمنت الأسنان لتغطية الأقطاب وبقية الجمجمة.
ملاحظة: تجف تماما الجمجمة قبل تطبيق الاسمنت الأسنان. تطبيق حمض البكريك 5٪ على الأقطاب لحمايتهم.
ملاحظة: يجب أن يتم الإجراء بأكمله في غطاء السلامة الحيوية للحفاظ على ظروف معقمة. - إزالة الحيوان من الإطار التجسيمي وحقن 300 ميكرولتر من الجلوكوز 10٪ تحت الجلد. وضعه على بطانية ساخنة للاسترداد. تأكد من أن الحيوان هو دافئ (37 درجة مئوية) والطبية ( أي، تعافى تماما). إدارة البوبرينورفين داخل الصفاق (0.05 ملغ / كلغ) لآلام ما بعد الجراحة.
ملاحظة: لا تترك حيوانا غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية (أي السلوك الطبيعي والحركة). - عودة الجرو إلى قفصها المنزل مع سدهم بعد أن يستعيد وعيه. انتظر لمدة يومين حتى يتم استرداد الحيوان تماما.
3. إيغ تسجيل
- بعد الانتعاش الكامل، وربط الأقطاب مزروع على الجمجمة من الجرو إلى مكبر للصوت في قفص الخاصة بها. توصيل مكبر للصوت إلى التناظرية إلى الرقمية جالعاكس ونعلق محول إلى جهاز كمبيوتر. يجب التعامل مع خطوط التوصيل بعناية بحيث لا تتشابك.
- حدد ما لا يقل عن 10000 هرتز معدل أخذ العينات على وحدة الحصول على البيانات للتسجيل (عرض النطاق الترددي للمرسل هو 1-100 هرتز). تأكد من عينات البيانات بشكل صحيح.
- بعد الحصول على تسجيل خط الأساس، وضخ الجرو داخل البريتون مع حمض الكاينيك (كا) (2 ملغ / كلغ) للحث على نوبات الصرع. 15 دقيقة بعد حقن كا مراقبة وتسجيل التصريف الصرعية. الاستيلاء على المنتج من خلال كا وعادة ما تكون جسدية.
ملاحظة: مدة إكتال-تونيك حوالي 15.2 ± 0.9 ثانية، ومدة الاستيلاء حوالي 62 ± 5 ثانية. يمكن الوقاية من المضبوطات في الفئران حديثي الولادة من خلال إعطاء حقن إب من هيدرات كلورال (400 ملغ / كلغ). - حفظ البيانات الرقمية وتحليلها باستخدام حزم البرمجيات معالجة الإشارات، مثل spike2. كشف مستوى الطاقة من مكونات تردد مختلفة في إشارة إيغ حديثي الولادة من قبل بيرفأو تحليل طاقة الطيف. حساب القدرة في إطار زمني 1 دقيقة من خلال إيجاد الجذر متوسط مربع السعة من 1 إلى 100 هرتز (فرقة إيغ) 9 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إذا تم إجراء العمليات الجراحية المذكورة أعلاه بشكل صحيح، سيتم إجراء واحد قناة الفئران حديثي الولادة تسجيل الجرو إيغ بنجاح. بعد 10 دقائق من حقن كا، ظهر نمط منتظم من العلامات السلوكية في شكل حركات غير منتظمة والخدش، والهزات، وفقدان التوازن. ويبين الشكل 2 آثار ممثل إيغ الخام و إنتيركتال، منشط، منشط، وأثرية الترقيع توسع. المتكررة إنتريكتال و إيكت أنماط التصريف إيغ بدأت 15-60 دقيقة (30 ± 5.2 دقيقة، يعني ± سيم) بعد حقن كا ( الشكل 2A و 2 B). الشكل 2D و 2E يمثل المضبوطات منشط الارتجاجية التي هي النوع الأكثر شيوعا. استمرت فترة منشط-منشط 15.2 ± 0.9 ثانية ( الشكل 2D ). وأظهرت النتائج التمثيلية أن التصريف منشط تليها رشقات نارية الارتجاجية ( الشكل 2B، 2D، و 2 E ).
e_content "فو: كيب-together.within-بادج =" 1 ">
الشكل 1: توضيح بروتوكول زرع الجراحية. ( أ ) دبابيس الكمبيوتر صغيرة. ( B ) أنثى دبوس (يسار) و ذكر دبوس (يمين). شريط مقياس يستخدم لقياس طول دبوس الإناث. ( C ) متصل الإناث والذكور دبوس. ( D ) الجمجمة المكشوفة. يعرض الرقم 1 الموقع المرجعي، ويعرض الرقم 2 مواقع تسجيل بريجما، و 3 و 4، ويعرض الرقم 5 لامدا. ( E ) زرع الكهربائي. رقم 1 يعرض القطب المرجعي، رقم 3 و 4 تقديم القطب تسجيل. ( F ) الجرو المسترد (P9). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
d / 55489 / 55489fig2.jpg "/>
الشكل 2: الناجم عن كا نوبة المواليد. ( A ) أثر إيغ ممثل من الفئران P10 الذي تم حقنه مع كا (2 ملغ / كغ، والملكية الفكرية) أظهرت التصريف انفجارات الصرع المتكررة. ( ب ) عرض موسع لمصطلحات الصرع التي تشبه العنقودية من المربع في أ. ( C و D و E ) تم توسيع الآثار النمطية المتداخلة والأثرية المنشطة والأثرية المستمدة من المربع في B. ( F ) متوسط الطاقة إيغ (1 دقيقة نافذة الوقت) قبل وبعد حقن كا (يعني ± سيم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إيغ تسجيل انشاء المتابعة. تمثيل تتبع التتبع هو شوون في التحرك بحرية الجرو الفئران حديثي الولادة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، ونحن الإبلاغ عن الإجراءات الجراحية وتسجيل للحصول على إيغ في التحرك بحرية الجراء الفئران حديثي الولادة عن طريق طريقة السلكية ( الشكل 3 ). وقد اقترح أن الجرو P7-P12 هو في العصر التنموي الذي يتوافق مع الوليد البشري كامل المدى 10 ، 11 . فمن الصعب من الناحية الفنية للحصول على بيانات تسجيل إيغ عالية الجودة عند العمل مع الجراء الفئران في هذه الفئة العمرية. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتطلب معالجة متخصصة وعناية كبيرة 8 .
وقد أجريت دراسات سابقة فحص في الجسم الحي التسجيلات إيغ في الفئران حديثي الولادة باستخدام حلول تسجيل السلكية في P12 أو الحيوانات الأكبر سنا 12 ، ولكن هذه النهج مكلفة جدا. من خلال الاعتماد على أقطاب بسيطة، وكنا قادرين على جعل القطب ( الشكل 1 ) أن يقلل من تكلفة التجربة إلى أقل من 1 $ في حين لا يزال يعطي عالية الكثافة إيغالتسجيلات. الزرع الجراحي في هذا الأسلوب يمكن أن يستغرق اقل من 10 دقيقة، وهذا يتوقف على تعقيد الجراحة.
الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هو زرع الأقطاب الكهربائية. وينبغي أن يتم ذلك بعناية. للحفاظ على اتصال مستمر من القطب مع الجمجمة، الخطوات التالية هي مهمة للنظر فيها. أولا، إزالة الحطام الأنسجة على الجمجمة مع مساعدة من مسحة القطن معقمة لأنه قد يفصل القطب الكهربائي من الجمجمة. ثانيا، استخدام سيانوكريلات بشكل صحيح لإرفاق القطب مع الجمجمة. ثالثا، الحفاظ على اللزوجة الكافية من الاسمنت الأسنان. فمن الأفضل لتطبيق الاسمنت الأسنان في طبقتين. يجب أن تكون الطبقة الأولى قليلا كثيفة لتغطية الجمجمة في حين أن الطبقة الثانية يجب أن يكون سيلان قليلا لتغطية زوايا الطبقة الأولى. اضغط على الاسمنت الأسنان بلطف مع طرف ماصة لتسويته لجعل السندات لاصقة قوية. إذا كان مائي جدا فإنه قد بناء طبقة عازلة تحت الكهربائية، وإذا كان كثيفا جدا، فإن الاسمنت الأسنان تسقط بسهولة من الجمجمة بسبب وزنه. ومن المهم أيضا للحفاظ على درجة حرارة الجسم الجرو عند 37 درجة مئوية طوال عملية جراحية للبقاء على قيد الحياة.
تطبيق هذا الإجراء يقتصر على تسجيل إيغ في الجراء الفئران حديثي الولادة بين سن P8 و P15 لأن الجراء المتنامية قد إزالة الاسمنت الأسنان والقطب من الجمجمة. من حيث مزيد من التطبيقات، ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتسجيل النشاط الكهربائي من الفئران الكبار والفئران بعد تعديل طفيف. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يفسح المجال لاستخدامها في مختلف التجارب السلوكية، مثل متاهة زائد زائد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (31171355) ومؤسسة العلوم الطبيعية في قوانغدونغ (S2011010003403، 2014A030313440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
- Pereda, A. E. Electrical synapses and their functional interactions with chemical synapses. Nat Rev Neurosci. 15 (4), 250-263 (2014).
- Chorev, E., Epsztein, J., Houweling, A. R., Lee, A. K., Brecht, M. Electrophysiological recordings from behaving animals--going beyond spikes. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 513-519 (2009).
- Freeborn, D. L., McDaniel, K. L., Moser, V. C., Herr, D. W. Use of electroencephalography (EEG) to assess CNS changes produced by pesticides with different modes of action: effects of permethrin, deltamethrin, fipronil, imidacloprid, carbaryl, and triadimefon. Toxicol Appl Pharmacol. 282 (2), 184-194 (2015).
- Werhahn, K. J., Hartl, E., Hamann, K., Breimhorst, M., Noachtar, S. Latency of interictal epileptiform discharges in long-term EEG recordings in epilepsy patients. Seizure. 29, 20-25 (2015).
- Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A.
- Nimmrich, V., Draguhn, A., Axmacher, N. Neuronal Network Oscillations in Neurodegenerative Diseases. Neuromolecular Med. 17 (3), 270-284 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. J Vis Exp. (101), e52554 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Dzhala, V. I., et al. NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. Nat Med. 11 (11), 1205-1213 (2005).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Savard, A., et al. Involvement of neuronal IL-1beta in acquired brain lesions in a rat model of neonatal encephalopathy. J Neuroinflammation. 10, 110 (2013).
- Cuaycong, M., et al. A novel approach to the study of hypoxia-ischemia-induced clinical and subclinical seizures in the neonatal rat. Dev Neurosci. 33 (3-4), 241-250 (2011).
