Summary
在这里，我们介绍一种设计用于记录脑电图（EEG）在自由移动的新生儿癫痫幼仔中的新技术，并描述其程序，特征和应用。这种方法允许一个记录EEG超过1周。
Abstract
脑电图是检测大脑电活动的有用方法。此外，它是广泛使用的各种神经病症的诊断工具，如癫痫和神经退行性疾病。然而，在技术上难以在新生儿获得脑电记录，因为它需要专门的处理和很好的照顾。在这里，我们提出了一种在新生大鼠幼仔（P8-P15）中记录脑电图的新方法。我们设计了一个使用计算机针座的简单可靠的电极;它可以很容易地植入大鼠的颅骨，以在正常和癫痫大脑中记录高质量的脑电信号。给予小鼠腹膜内（ip）注射神经毒素红藻氨酸（KA）以诱导癫痫发作。在这个程序中进行的手术植入比其他新生儿的EEG手术便宜。该方法允许一个记录高质量和稳定的EEG信号超过1周。此外，该程序也可以应用于成人rats和小鼠研究癫痫或其他神经系统疾病。
Introduction
已经确定，需要神经元之间的连续通信来获得正常的脑功能。神经元间通讯主要发生在突触处，其中一个神经元的信息被传送到第二个神经元。这种突触传播由两种类型的专用结构布置介导：电或化学突触1 。电生理学是捕获在神经间通讯期间产生的控制整个身体功能和行为的电位的领域。脑电是许多电生理技术中最常用的方法。
脑电图是用于检测由内部或外部刺激产生的电信号变化的技术。此外，它是临床诊断和各种神经疾病如癫痫，帕金森病和阿尔茨海默氏症患者预后的重要测试e，以及药理和毒理剂的作用3 。一般来说，癫痫患者在脑内表现出过度兴奋性和功能性连接受损;这些被概括为间质性癫痫样放电（IEDs），可以用尖锐的瞬时尖峰的形式记录脑电图。尖锐的波浪尖波复合物或多峰4 。癫痫大脑的主要特征是癫痫发作的自发性发作，可以从头皮或脑实质记录，以定位癫痫发作的脑区5 。此外，EEG对神经变性疾病如阿尔茨海默氏病（AD）也具有非常重要的意义。研究表明，AD患者的EEG记录和受损振荡网络的改变是常见的。然而，我们对神经退行性疾病网络振荡的病理生理学知识令人惊讶的是不完整，需要进一步探索6 。
在这个协议中，我们设计了一个简单的电极，可以记录EEG以了解正常和病理大脑的电气通信。这种方法的手术植入比其他可用的手术便宜7 。此外，该方法可用于记录更长时间内的高质量和稳定的EEG信号（ 即每天2-4小时1周）。此外，我们使用更轻的电极（重约26毫克），使动物的行为更自然8 。该方法广泛适用于需要放大器和数字化仪的新生大鼠幼仔的脑电图研究，通常用于电生理实验室，不需要任何额外的装置。
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Protocol
动物护理，外科手术和记录程序符合华南师范大学动物护理与使用委员会的指引。
电极制备（图1A-C）
注意：计算机引脚位置只是通信设备中作为信号接口的一部分的插脚式接点。它由插入母连接器的公连接器组成。
- 借助于钳子，将公针和母针与计算机引脚位置（ 图1A ）分开。将公母针连接在一起形成电极并施加氰基丙烯酸酯以产生强的粘结（ 图1C ）。
- 将电极放入装有蒸馏水的烧杯中，并将其放入超声波清洗机中10分钟。将它们移动到45℃的烘箱中30分钟。使用UV光灭菌电极30分钟。
外科手术（图1D-F）
- 准备消毒的外科器械和立体定位仪。使用异氟醚麻醉（2.5％）与空气麻醉新生大鼠。当幼仔深度麻醉时，将异氟烷的剂量调整至1.0％。在手术前进行尾部或脚趾捏，以确保适当的麻醉深度。
- 通过将耳棒放入耳道并稍微拧紧，将小狗的头部固定在立体定位装置中。
注意：不要过度收紧耳塞，因为新生儿头骨很软。 - 通过喷洒70％乙醇的所有设备来维持无菌手术领域。使用手术刀在头部做一个15毫米的切口。使用镊子，轻轻地将头皮远离四角的中线。将一些盐水浸泡在皮肤下方，以保持切口大开（ 图1D ）。
- 找到头骨上的阳光和喇叭点并用铅笔标记。使用注射器针头（26 G）在前额叶皮质（PFC）和海马中制造两个毛刺孔。
注意：PFC位于前囟后+1.8毫米，中线为-0.5毫米，而海马位于前囟前方-2.0毫米，中线横向为±0.5毫米（ 图1D和E ）。电极的深度不应大于皮质表面以下2毫米，以减少脑损伤。 - 使用镊子保持电极并将参考和记录电极分别插入PFC和海马。在电极周围涂抹红霉素软膏，以避免任何可能的感染。使用氰基丙烯酸酯固定电极。
- 准备牙科丙烯酸水泥，使其具有胶粘和粘稠的稠度。应用牙科水泥覆盖电极和头骨的其余部分。
注意：在应用牙科水泥之前彻底干燥颅骨。 在电极上涂抹5％苦味酸以保护它们。
注意：整个程序应在生物安全罩中进行，以保持无菌条件。 - 从立体定位框架中取出动物，并皮下注射300μL的10％葡萄糖。将其放在加热的毯子上以进行恢复。确保动物温暖（37°C）和动态（ 即完全恢复）。腹膜内给予丁丙诺啡（0.05 mg / kg）用于手术后疼痛。
注意：在重新获得足够的意识（即正常行为和运动）之前，不要将动物无人值守。 - 在恢复意识之后，将小狗带回他们的水坝。等待两天，直到动物完全康复。
3.脑电录音
- 完全恢复后，将植入颅骨上的电极连接到放大器的笼中。将放大器连接到模拟数字c转换器并将转换器连接到计算机;应仔细对待连接线，以免缠结。
- 在数据采集单元上选择至少10,000 Hz采样率进行记录（发送器的带宽为1-100 Hz）。确保数据正确采样。
- 在进行基线记录后，用红藻氨酸（KA）（2mg / kg）腹膜内注射小鼠以诱导癫痫发作。注射后15分钟观察并记录癫痫放电。通过KA产生的缉获物通常是物理的。
注意：发炎持续时间约为15.2±0.9秒，发作持续时间约为62±5秒。通过IP注射水合氯醛（400 mg / kg）可以预防新生大鼠的癫痫发作。 - 保存数字化数据并使用信号处理软件包（如spike2）进行分析。通过perf显示新生儿EEG信号中不同频率成分的功率水平功率谱分析。通过找到1到100 Hz（EEG频带） 9的均方根幅度，计算1分钟时间内的功率。
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Representative Results
如果上述外科手术正确进行，则可以成功地进行一次大鼠新生儿小脑脑电图记录。 KA注射后10分钟，出现不规则运动和搔抓，震颤和失去平衡的形式的行为体征。图2显示了代表性的原始脑电图痕迹和间质，炎症反应和发作性扩张痕迹。复发性间歇和发作性EEG放电模式在KA注射后开始15-60分钟（30±5.2分钟;平均值±SEM）（ 图2A和2B ）。 图2D和2E表示最常见类型的强直阵挛性发作。发炎持续时间持续15.2±0.9s（ 图2D ）。代表性的结果表明，强直性放电之后是阵挛性爆发（ 图2B，2D和2E）。
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图1：手术植入方案的例证。 （ A ）微小的电脑引脚。 （ B ）母针（左）和公针（右）。比例尺用于测量母针的长度。 （ C ）连接的母头和针头。 （ D ）暴露的头骨。第1号提供参考地点，第2号呈现了伯尔贾，第3和第4个现有录音场所，第5号呈现了Lambda。 （ E ）电极植入。 1号是参考电极，No.3和4存在记录电极。 （ F ）恢复大鼠幼仔（P9）。 请点击此处查看此图的较大版本。
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图2：KA引起的新生儿癫痫发作。 （ A ）来自注射KA（2mg / kg，ip）的P10大鼠的代表性EEG迹线显示出复发性癫痫突发放电。 （ B ）从A框（ C ， D和E ）中的单个簇状癫痫放电的扩展视图。从B框中扩展出的典型的间质，炎症和惊恐曲线。（ F ）总结数据显示KA注射前后的平均EEG功率（1分钟时间窗）（平均值±SEM）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：脑电记录设置。代表追踪记录是sho在自由移动的新生大鼠小狗。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们报告手术和记录程序，通过有线方法自由移动新生大鼠幼仔获得脑电图（ 图3 ）。已经表明P7-P12大鼠的发育年龄对应于全新的人类新生儿10,11 。在这个年龄组的大鼠幼仔工作时，在技术上难以获得高质量的脑电记录数据。此外，它需要专门的处理和很好的保养8 。
以前在新生大鼠体内检测体内 EEG记录的研究已经在P12或更老的动物12中使用有线记录解决方案进行了，但是这些方法是非常昂贵的。通过依靠简单的电极，我们已经能够制造一个电极（ 图1 ），将实验成本降低到低至1美元，同时仍然给予高密度脑电图录音。这种方法的手术植入可能需要10分钟，这取决于手术的复杂性。
该协议中的关键步骤是电极的注入。应该小心点为了保持电极与头骨的恒定接触，以下步骤是重要的。首先，用灭菌棉签去除颅骨上的组织碎屑，因为它可能会使电极与头骨分开。其次，使用氰基丙烯酸酯适当地附着电极与颅骨。第三，保持牙膏粘稠度。最好在两层涂抹牙科水泥;第一层应该有点密集以覆盖头骨，而第二层应该有点流氓覆盖第一层的角落。用移液管尖端轻轻敲打牙科水泥，将其固定下来，使粘结剂粘结牢固。如果它太水了，它可能在电极下面建立一个绝缘层ode，如果它太密集，牙科水泥将由于自身的重量而容易从头骨脱落。在整个手术期间保持小鼠的体温在37°C生存也很重要。
该程序的应用限于在P8和P15年龄之间的新生大鼠幼仔中记录脑电图，因为生长的幼仔可以从其头骨中去除牙科水泥和电极。在进一步的应用方面，该方法也可以用于记录成年大鼠和小鼠在稍微修改后的电活动。此外，该方法很好地适用于各种行为实验，例如高架加迷宫。
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Disclosures
作者宣称没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了中国自然科学基金（31171355）和广东省自然科学基金资助（S2011010003403，2014A030313440）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
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