Summary
ここでは、自由に動く新生児のてんかんの仔に脳波記録（EEG）を記録し、その手順、特徴、および用途を記載するように設計された新規技術を紹介する。この方法は、1週間以上のEEGを記録することを可能にする。
Abstract
脳波は脳内の電気的活動を検出するのに有用な方法です。さらに、それは、てんかんおよび神経変性疾患などの様々な神経学的状態のための広く使用される診断ツールである。しかし、特殊な取り扱いと大きな注意が必要なため、新生児の脳波記録を取得することは技術的に困難です。ここでは、新生児ラットの仔（P8〜P15）にEEGを記録するための新しい方法を紹介します。我々はコンピュータのピン軌跡を用いて簡単で信頼性の高い電極を設計した。ラットの頭蓋骨に簡単に移植することができ、高品質の脳波信号を正常およびてんかんの脳に記録することができます。仔は、癲癇発作を誘発するために神経毒カイニン酸（KA）の腹腔内（ip）注射を与えられた。この手技で実施される外科移植は、新生児の他のEEG処置よりも安価である。この方法により、高品質で安定した脳波信号を1週間以上記録することができます。さらに、この手順は成人RAにも適用できるてんかんまたは他の神経学的障害を研究するために使用される。
Introduction
正常な脳機能を得るためには、ニューロン間の連続的な通信が必要であることは十分に確立されている。神経細胞間通信は、主にシナプスで行われ、シナプスでは、1つのニューロンからの情報が第2のニューロンに伝達される。このシナプス伝達は、電気的または化学的シナプスの2種類の専用構造配置によって媒介される。電気生理学は、身体全体の機能や行動を制御する、インターナルコミュニケーションの間に生成される電位を捕捉する分野です。 EEGは、多くの電気生理学的手法の中で最も一般的に使用される方法である。
EEGは、内部刺激または外部刺激によって生成された電気信号の変化を検出するために使用される技術である。さらに、それは、てんかん、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの様々な神経学的状態の臨床診断および予後予測のための必須試験であるeならびに薬理学的および毒物学的作用物質の影響3 。一般に、てんかん患者は、過興奮性および脳内の機能的連結性を損なう。これらは、間質性てんかん様放電（IED）として要約され、鋭く過渡的なスパイクの形態でEEGによって記録することができる。鋭い波;スパイク波複合体;またはポリスピーク4 。てんかんの脳の主な特徴は、発作5の原因となる脳領域の位置を特定するために、頭皮または脳実質から記録できる、てんかん発作の自発的発生である5 。さらに、脳波はまた、アルツハイマー病（AD）のような神経変性障害において非常に重要な意味を有する。研究によれば、AD患者の脳波記録の変化および振動ネットワークの障害が一般的であることが示唆されている。しかしながら、神経変性疾患iにおけるネットワーク振動の病態生理学に関する我々の知識驚くほど不完全で、さらに調査する必要がある6 。
このプロトコルでは、正常脳と病理学的脳の両方における電気通信を理解するためにEEGを記録することができる簡単な電極を設計した。この方法における外科移植は、他の利用可能な手順7より安価である7 。さらに、この方法は、より長い時間枠（ すなわち、毎日2〜4時間、1週間）の高品質で安定した脳波信号を記録するために使用することができる。さらに、私たちは動物の自然な行動を可能にする軽い電極（体重約26mg）を使用しました8 。この方法は、電気生理学研究室で一般的に使用されるアンプとデジタイザを必要とする新生児ラットの仔犬の脳波検査に広く適用され、追加のデバイスは必要ありません。
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Protocol
動物のケア、外科手術および記録手順は、南中国師範大学の動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従った。
電極調製（図1A〜C）
注記：コンピュータピンの軌跡は、通信デバイスの信号インタフェースの一部としての単なる接触です。それは、雌コネクタに差し込まれる雄コネクタからなる。
- ピンサーの助けを借りて、雄と雌のピンをコンピュータピンの軌跡（ 図1A ）から慎重に分離します。オスとメスのピンを一緒に接続して電極を形成し、シアノアクリレートを塗布して強力な接着結合を作ります（ 図1C ）。
- 電極を蒸留水で満たしたビーカーに入れ、超音波洗浄機に10分間置いてください。 45℃の乾燥オーブンに30分間移動してください。 UV光を用いて30分間電極を滅菌する。
手術手順（図1D〜F）
- 滅菌された外科用器具および定位固定装置を準備する。空気でイソフルラン麻酔（2.5％）を用いて新生児ラットの仔犬を麻酔する。子犬が深く麻酔をかけられたら、イソフルランの用量を1.0％に調整します。適切な麻酔深度を確保するために、手術前に尾またはつまみを締めてください。
- イヤーバーを外耳道の中に入れ、わずかに締め付けることによって、定位固定装置内の幼児の頭を固定する。
注：新生児の頭蓋骨は非常に柔らかいので、イヤーバーを過度に締めすぎないでください。 - すべての装置に70％エタノールを噴霧することにより、無菌の手術野を維持する。メスを使用して頭部に15 mmの切開を行います。鉗子を使用して、静かに四隅の正中線から頭皮を引き離します。切開部を広く開いたままにするために、生理食塩水に浸した綿を皮膚の下に置きます（ 図1D ）。
- 頭蓋骨のブレグマとラムダ点を見つけるそれらを鉛筆でマークしてください。シリンジ針（26G）を使用して、前頭前野皮質（PFC）と海馬に2つの穴をあけます。
注：Pregは、ブレグマの後ろ1.8mmおよび正中線の-0.5mmの側に位置するが、海馬はブレグマの前-2.0mmおよび正中線の±0.5mmに位置する（ 図1DおよびE ）。脳の損傷を最小限に抑えるために、電極の深さは皮質表面の2mmを超えてはならない。 - 電極を保持するために鉗子を使用し、PFCおよび海馬に参照電極および記録電極をそれぞれ挿入する。エリスロマイシン軟膏を電極の周囲に塗布して、感染を避ける。シアノアクリレートを用いて電極を固定する。
- 歯科用アクリルセメントを準備して、粘りと粘りのある一貫性があるようにします。電極と頭蓋骨の残りの部分を覆うように歯科用セメントを塗布します。
注：歯科用セメントを塗布する前に、頭蓋骨を完全に乾燥させます。 5％ピクリン酸を電極に塗布して保護します。
注：滅菌条件を維持するためには、手順全体をバイオセーフティフードで行う必要があります。 - 定位固定フレームから動物を取り出し、300μLの10％グルコースを皮下注射する。加熱した毛布に置き、回復させます。動物が暖かい（37℃）、歩行可能である（ すなわち、完全に回復した）ことを確認する。手術後の痛みに対してブプレノルフィンを腹腔内投与する（0.05mg / kg）。
注意：十分な意識（すなわち、正常な行動や動き）を回復するまで、動物を放置しないでください。 - 意識を取り戻した後、ダムを持ってその家のケージに子犬を戻してください。動物が完全に回復するまで2日間待ちます。
3.脳波記録
- 完全に回復した後、仔犬の頭蓋骨に埋め込まれた電極を、それ自身のケージ内の増幅器に接続する。アンプをアナログ/デジタル変換器に接続します。コンバータをコンピュータに接続します。接続線は絡み合わないように注意深く取り扱わなければなりません。
- 記録のためにデータ取得ユニットで少なくとも10,000 Hzのサンプリングレートを選択します（トランスミッタの帯域幅は1〜100 Hzです）。データが適切にサンプリングされていることを確認してください。
- ベースライン記録を得た後、カイニン酸（KA）（2mg / kg）を腹腔内に注射して、てんかん発作を誘発する。 KA注射の15分後に、てんかん発作を観察し、記録する。 KAによる発作は通常肉体的である。
注：発作持続時間は約15.2±0.9秒であり、発作持続時間は約62±5秒である。新生仔ラットでは、抱水クロラール（400 mg / kg）をIP注射することにより発作を予防することができます。 - デジタル化されたデータを保存し、spike2などの信号処理ソフトウェアパッケージを使用して解析します。 perfによって新生児のEEG信号の異なる周波数成分のパワーレベルを明らかにするパワースペクトル分析を行うこと。 1から100 Hz（EEGバンド）までの二乗平均平方根振幅を求めることによって、1分の時間枠でパワーを計算する。
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Representative Results
上記の外科的処置が適切に行われれば、1チャンネルのラットの新生児の脳波記録が首尾よく行われる。 KA注射の10分後に、規則的な行動徴候のパターンが、不規則な動きおよび掻痒、振戦、およびバランスの喪失の形態で現れた。図2は、代表的な生EEGトレースおよび発作間欠性、発作性痙攣性および発作性発作性拡張性痕跡を示す。 KA注入後、15〜60分（30±5.2分;平均±SEM）の再発性発作および発作性EEG放出パターンが開始した（ 図2Aおよび2B ）。 図2Dおよび2Eは、最も一般的なタイプである強直間代発作を表す。発作持続時間は15.2±0.9秒であった（ 図2D ）。代表的な結果は、緊張放電がクローンバーストに続いていることを示した（ 図2B、2Dおよび2E ）。
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図1：手術用インプラントプロトコルの図。 （ A ）小型のコンピュータピン。 （ B ）メスピン（左）とオスピン（右）。スケールバーは、雌ピンの長さを測定するために使用されます。 （ C ）雌雄ピンを接続した。 （ D ）露出した頭蓋骨。 No.1は参照サイト、No.2はBregma、No.3と4は現在の記録サイト、No.5はLambdaを示している。 （ E ）電極移植。 No.1は参照電極を示し、No.3および4は記録電極を示す。 （ F ）回収されたラットの子犬（P9）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図2：KA誘発新生児発作。 （ A ）KA（2mg / kg、腹腔内）を注射したP10ラットの代表的なEEGトレースは、再発性のてんかん性バースト放出を示した。 （ B ）A.（ C 、 DおよびE ）のボックスからの単一クラスター様癲癇放電の拡大図Bのボックスから拡大した典型的な発作性痙攣性痙攣発作および痙性発作トレース。 KA注射前後の平均EEGパワー（1分の時間窓）（平均±SEM）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：脳波記録セットアップ。代表的なトレース録音は、自由に動く新生児ラットの子犬では、 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、自由に動く新生児ラットの仔犬をEEGで取得するための手術と記録の手順を有線方式で報告する（ 図3 ）。 P7-P12ラットの子犬は、満期のヒト新生児に対応する発達年齢であることが示唆されている10,11 。この年齢層のラットの仔犬と一緒に作業する場合、高品質のEEG記録データを得ることは技術的に困難です。さらに特殊な取り扱いと大きな注意が必要です8 。
新生仔ラットにおけるインビボ EEG記録を調べている以前の研究は、P12またはより古い動物の有線記録溶液を用いて実施されてきたが、これらのアプローチは非常に高価である。シンプルな電極に頼ることで、実験のコストを$ 1に抑えながら高密度の脳波を与える電極を作ることができました（ 図1 ）録音。手術の複雑さにもよるが、この方法の外科移植は、わずか10分かかることがある。
このプロトコルの重要なステップは、電極の植え込みです。それは慎重に行うべきです。電極と頭蓋骨との一定の接触を維持するために、以下のステップが重要である。まず、頭蓋骨から電極を離してしまう可能性があるため、滅菌した綿棒を使用して、頭蓋骨の組織破片を取り除いてください。第二に、シアノアクリレートを適切に使用して、電極を頭蓋骨に取り付ける。第3に、歯科用セメントの適切な粘度を維持する。歯科用セメントを2つの層に塗布する方が良い。最初の層は、頭蓋骨を覆うために少し濃くなければならないのに対し、第2の層は、第1の層の角を覆うために少し鼻をすべきである。歯科用セメントをピペットチップで静かにタップして、強力な接着結合を作ります。水分が多すぎると、電気の下に絶縁層ができてしまいますもしそれが濃すぎると、歯科用セメントは自重によって頭蓋骨から容易に脱落する。また、生存のため手術中、子犬の体温を37℃に維持することも重要です。
この手順の適用は、成長する子犬が頭蓋骨から歯科用セメントおよび電極を除去する可能性があるため、P8およびP15の年齢の間の新生児ラットの仔のEEGを記録することに限定される。さらなる適用の観点から、この方法は、軽度の改変後の成体ラットおよびマウスの電気的活動を記録するためにも使用することができる。さらに、この方法は、上昇したプラス迷路などの様々な行動実験での使用に適している。
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Disclosures
著者らは、利害の対立を宣言していない。
Acknowledgments
この研究は、中国の自然科学財団（31171355）および広東の自然科学財団（S2011010003403,2014A030313440）によって支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
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