Summary
Burada, serbestçe hareket eden neonatal epileptik yavrulara elektroensefalografiyi (EEG) kaydetmek ve prosedürlerini, özelliklerini ve uygulamalarını tanımlamak için tasarlanmış yeni bir teknik sunuyoruz. Bu yöntem, EEG'yi 1 haftadan daha uzun süreyle kayıt ettirmenizi sağlar.
Abstract
EEG, beyindeki elektriksel aktiviteyi saptamak için yararlı bir yöntemdir. Dahası, epilepsi ve nörodejeneratif bozukluklar gibi çeşitli nörolojik durumlar için yaygın olarak kullanılan bir tanı aracıdır. Bununla birlikte, yenidoğanlarda EEG kayıtları elde etmek teknik olarak zor, özel muamele ve büyük bakım gerektirdiğinden. Burada, neonatal sıçan yavrularında EEG kaydetmek için yeni bir yöntem sunuyoruz (P8-P15). Bilgisayarın pin lokusunu kullanarak basit ve güvenilir bir elektrot tasarladık; Normal ve epileptik beyinde yüksek kaliteli EEG sinyallerinin kaydedilmesi için bir sıçan yavrusunun kafatasına kolayca implante edilebilir. Puplara epileptik nöbetleri indüklemek için nörotoksin kainik asitin (KA) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu yapıldı. Bu prosedürde yapılan cerrahi implantasyon yenidoğanlar için diğer EEG prosedürlerinden daha ucuzdur. Bu yöntem, bir kişinin yüksek kaliteli ve istikrarlı EEG sinyallerini 1 haftadan fazla süreyle kaydetmesini sağlar. Dahası, bu prosedür, yetişkin ra'ya da uygulanabilirTs ve farelerden epilepsi veya diğer nörolojik bozuklukları incelemek için kullanılmıştır.
Introduction
Normal beyin fonksiyonunu elde etmek için nöronlar arasındaki sürekli iletişimin gerekli olduğu iyi bilinmektedir. İnterneonal iletişim ilk olarak bir sinir hücresinden gelen bilgilerin ikinci bir sinir hücresine iletildiği sinapslarda gerçekleşir. Bu sinaptik iletim iki tür yapısal düzenlemeyle sağlanır: elektriksel veya kimyasal sinapsler 1 . Elektrofizyoloji, tüm vücut işlevlerini ve davranışını kontrol eden, internöronal iletişim sırasında üretilen elektrik potansiyelini yakalayan alanlardır. EEG birçok elektrofizyolojik teknik arasında en çok kullanılan yöntemdir.
EEG, iç veya dış uyaranlar tarafından üretilen elektrik sinyallerindeki değişiklikleri saptamak için kullanılan bir tekniktir. Dahası, epilepsi, Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi çeşitli nörolojik durumların klinik tanı ve sonuç tahmininde önemli bir testtirE, farmakolojik ve toksikolojik ajanların etkileri 3 . Genellikle epileptik bir hastada beyinde aşırı uyarılma ve işlevsel bağlantının bozulması görülür; Bunlar interiktal epileptiform deşarjlar (IED'ler) olarak özetlenmekte ve keskin, geçici sivri uçlar şeklinde EEG ile kaydedilebilmektedir; Keskin dalgalar; Dikenli dalga kompleksleri; Veya polipropikler 4 . Epileptik beynin asıl özelliği epileptik nöbetlerin kendiliğinden ortaya çıkmasıdır; nöbetlerden sorumlu beyin alanını bulmak için kafa derisinden veya beyin parankiminden kaydedilebilir 5 . Ayrıca, EEG'nin Alzheimer hastalığı (AD) gibi nörodejeneratif bozukluklarda da önemli etkileri bulunmaktadır. Araştırmalar AD hastalarında değiştirilmiş EEG kayıtlarının ve bozulmuş salınım ağlarının yaygın olduğunu ileri sürüyor. Bununla birlikte, nörodejeneratif hastalıklarda ağ salınımlarının patofizyolojisi hakkında bilgi iŞaşırtıcı derecede eksik ve daha fazla araştırılması gerekiyor 6 .
Bu protokolde hem normal hem de patolojik beyindeki elektriksel iletişimi anlamak için EEG'yi kaydedebilen basit bir elektrot tasarladık. Bu yöntemdeki cerrahi implantasyon diğer kullanılabilir prosedürlerden daha ucuzdur 7 . Dahası, bu yöntem, daha uzun zaman aralıkları için yüksek kaliteli ve kararlı EEG sinyallerinin kaydedilmesi için kullanılabilir ( yani, 1 hafta boyunca her gün 2-4 saat). Buna ek olarak, hayvanların daha doğal davranmalarını sağlayan hafif elektrotlar (yaklaşık 26 mg ağırlığında) kullandık. Bu yöntem, elektrofizyoloji laboratuvarında yaygın olarak kullanılan amplifikatör ve sayısallaştırıcıyı gerektiren yenidoğan sıçan yavrularında EEG çalışması için yaygın bir şekilde uygulanabilir ve herhangi bir ek cihaz gerektirmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan bakımı, cerrahi prosedür ve kayıt prosedürleri, Güney Çin Normal Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi için yönergelere uygundu.
1. Elektrot Hazırlama (Şekil 1A-C)
NOT: Bilgisayar pin loküsü, iletişim aygıtlarındaki sinyal arabiriminin bir parçası olarak sadece bir uçlu kontakttır. Dişi konektöre takılan bir erkek konektörden oluşur.
- Bir kıskaç yardımıyla erkek ve dişi pimleri bilgisayarın pin lokusundan dikkatlice ayırın ( Şekil 1A ). Erkek ve dişi pimleri bir elektrot oluşturacak şekilde birleştirin ve güçlü bir yapışkan bağ oluşturmak için siyanoakrilat uygulayın ( Şekil 1C ).
- Elektrotları, damıtılmış su ile dolu bir behere koyun ve 10 dakika boyunca ultrasonik temizleyiciye yerleştirin. Onları 45 ° C'de 30 dakika kurutma fırına taşıyın. Elektrodları UV ışığı kullanarak 30 dakika sterilize edin.
2. Cerrahi prosedür (Şekil 1D-F)
- Sterilize cerrahi aletleri ve stereotaksik aparat hazırlayın. Yenidoğan sıçan yavrusuna isofluran anestezi (% 2.5) ile hava ile anestezi uygulayın. Pedi derin anestezi altına alındığında, izofluran dozunu% 1.0'a ayarlayın. Anestezinin doğru derinliğini sağlamak için cerrahiden önce bir kuyruk veya ayak parmakları tutturun.
- Kulak çubuklarını kulak kanallarına yerleştirerek ve hafif sıkıştırarak yavrunun başını stereotaksik aparatta sabitleyin.
NOT: Yenidoğan kafatası çok yumuşak olduğu için kulak çubuklarını aşırı derecede sıkmayın. - Tüm ekipmana% 70 etanol püskürterek steril cerrahi alanı koruyun. Başınızı bir neşter kullanarak 15 mm'lik bir kesi yapın. Forseps kullanarak, dört köşedeki orta hattan kafa derisini yavaşça çekin. İnsizyonun geniş açık kalmasını sağlamak için salinle ıslanmış bir pamuk cildin altına koyun ( Şekil 1D ).
- Kafatasındaki bregma ve lambda noktalarını bulunVe kalemle işaretleyin. Prefrontal kortekse (PFC) ve hipokampusa iki çapak deliği açmak için bir şırınga iğnesi (26 G) kullanın.
NOT: Perküsyon, bregma'nın önüne -2.0 mm, orta çizgiye ± 0.5 mm lateralde ( Şekil 1D ve E ) bulunduğu sırada bregma'nın arkasından +1.8 mm ve orta hattan -0.5 mm lateralde bulunur. Beyin hasarını en aza indirgemek için elektrot derinliği korteks yüzeyinin 2 mm'den daha aşağıda olmamalıdır. - Elektrotları tutmak için forseps kullanın ve sırasıyla referans ve kayıt elektrodlarını PFC'ye ve hipokampusa yerleştirin. Olası enfeksiyonlardan kaçınmak için elektrotun çevresine eritromisin merhemi uygulayın. Elektrodu siyanoakrilat kullanarak sabitleyin.
- Dental akrilik çimentoyu yapışkan ve yapışkan bir kıvamda olacak şekilde hazırlayın. Elektrotları ve kafatasının geri kalanını örtecek diş çimentosunu uygulayın.
NOT: Diş çimentosunu uygulamadan önce kafatasını iyice kurutun. Onları korumak için elektrotların üzerine% 5 pikrik asit uygulayın.
NOT: Bütün prosedür, steril koşulları korumak için biyogüvenlikli bir kaput içinde yapılmalıdır. - Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve subkutan yoldan 300 μL% 10 glikoz enjekte edin. İyileştirmek için onu ısıtmalı bir battaniye koyun. Hayvanın sıcak (37 ° C) ve ayakta ( diğer bir deyişle tamamen iyileşmiş) olduğundan emin olun. Cerrahi sonrası ağrı için buprenorfin intraperitoneal (0.05 mg / kg) uygulanır.
NOT: Bir hayvanı yeterince bilinç kazanana kadar gözetimsiz bırakmayın (normal davranış ve hareket). - Bilinci geri gelip yavruları barajlarıyla evindeki kafese geri getirin. Hayvan tamamen kurtarılana kadar iki gün bekleyin.
3. EEG Kaydı
- Tam toparlandıktan sonra yavrunun kafatasına implante edilen elektrotları kendi kafesindeki amplifikatöre bağlayın. Amplifikatörü analogdan dijital c'ye bağlayınDönüştürücü ve dönüştürücü bir bilgisayara takın; Bağlantı hatları karışık olmamaları için dikkatle muamele edilmelidir.
- Kayıt için veri toplama ünitesinde en az 10,000 Hz örnekleme hızı seçin (vericinin bant genişliği 1-100 Hz'dir). Verilerin doğru örneklendiğinden emin olun.
- Temel kayıt alınmasından sonra, pupayı epileptik nöbetleri indüklemek için intraperitoneal olarak kainik asit (KA) (2 mg / kg) ile enjekte edin. KA enjeksiyonundan 15 dakika sonra epileptik deşarjları gözlemleyin ve kaydedin. KA aracılığıyla üretilen nöbet genellikle fiziksel.
NOT: İitalt tonik süre yaklaşık 15.2 ± 0.9 s, nöbet süresi yaklaşık 62 ± 5 s'dir. Yenidoğan sıçanında, IP enjeksiyonu kloral hidrat (400 mg / kg) vererek nöbetler önlenebilir. - Dijitalleştirilmiş verileri kaydedin ve spike2 gibi sinyal işleme yazılımı paketlerini kullanarak analiz edin. Yenidoğan EEG sinyalindeki farklı frekans bileşenlerinin güç düzeyini perf ile ortaya koyunBir güç spektrumu analizinin orming edilmesi. 1 ila 100 Hz (EEG bandı) 9 arasındaki kök-ortalama kare genliğini bulmak için gücü 1 dakikalık bir zaman aralığında hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki cerrahi prosedürler düzgün bir şekilde yürütülürse, bir kanallı sıçan yenidoğan yavrusu EEG kaydı başarıyla gerçekleştirilecektir. KA enjeksiyonundan 10 dakika sonra düzensiz hareketler, kaşınma, titreme ve denge kaybı şeklinde düzenli davranış belirtileri paternleri ortaya çıktı. Şekil 2, temsili ham EEG izlerini ve interiktal, ictal tonik ve ictal-klonik genişletilmiş izleri göstermektedir. KA enjeksiyonundan sonra tekrarlayan interiktal ve ictal EEG deşarj paternleri 15-60 dakika (30 ± 5.2 dakika, ortalama ± SEM) başladı ( Şekil 2A ve 2B ). Şekil 2D ve 2E , en yaygın olan tonik-klonik nöbetleri temsil eder. İiktagonik tonik süre 15.2 ± 0.9 saniye sürdü ( Şekil 2D ). Temsilci sonuçlar tonik deşarjların klonik patlamalarla izlendiğini göstermiştir ( Şekil 2B, 2D ve 2E ).
E_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Şekil 1: Cerrahi İmplantasyon Protokolünün İfadesi. ( A ) Küçük bilgisayar pimleri. ( B ) Dişi pim (sol) ve erkek pim (sağda). Ölçek çubuğu dişi pimin uzunluğunu ölçmek için kullanılır. ( C ) Bağlı dişi ve erkek pim. ( D ) Dışa vurulmuş kafatası. 1 no'lu referans yeri, 2 no'lu Bregma, 3 ve 4 no'lu mevcut kayıt yerlerini, 5 no'lu kısmı da Lambda'yı sunmaktadır. ( E ) Elektrot implantasyonu. No 1, referans elektrodunu sunar, No 3 ve 4, kayıt elektrodunu sunar. ( F ) Kurtarılan fare yavrusu (P9). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
D / 55489 / 55489fig2.jpg "/>
Şekil 2: KA'ya bağlı yeni doğan nöbet. ( A ) KA (2 mg / kg, ip) ile enjekte edilen bir P10 sıçanından temsil edilen bir EEG izi, tekrarlayan epileptik patlama deşarjları gösterdi. ( B ) A'daki kutudan tekli küme benzeri epileptik deşarjların genişletilmiş görünümü ( C , D ve E ) B.'deki kutudan genişletilmiş tipik interiktal, ictal tonik ve ictal-klonik izler ( F ) Özetlenen veriler KA enjeksiyonu öncesi ve sonrası ortalama EEG gücü (1 dakika zaman aralığı) (ortalama ± SEM). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: EEG Kayıt Ayarı. Temsilci iz kaydı shoBedensel hareket eden yenidoğan fare yavrusunda wn. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada serbestçe hareket eden yenidoğan sıçan yavrularını kablolu yöntemle EEG elde etmek için cerrahi ve kayıt prosedürlerini bildiriyoruz ( Şekil 3 ). P7-P12 sıçan yavrusunun tam dönem insan yenidoğanına karşılık gelen gelişimsel yaşta olduğu öne sürülmüştür 10,11. Bu yaş grubundaki sıçan yavrularıyla çalışırken teknik olarak yüksek kaliteli EEG kayıt verileri elde etmek zordur. Buna ek olarak, özel kullanım ve çok dikkatli olmayı gerektirir 8 .
Yenidoğan sıçanlarında in vivo EEG kayıtlarını inceleyen daha önceki çalışmalar, P12 ya da daha eski hayvanlarda kablolu kayıt çözümleri kullanılarak yapılmıştır 12 , ancak bu yaklaşımlar çok maliyetlidir. Basit elektrotlara güvenerek, deneyin maliyetini 1 $ 'a kadar düşüren, yine de yüksek yoğunluklu EEG veren bir elektrot yapabildik ( Şekil 1 )kayıtları. Bu yöntemle cerrahi implantasyon ameliyatın karmaşıklığına bağlı olarak 10 dakika kadar sürebilir.
Bu protokolün kritik adımları elektrotların implantasyonudır. Dikkatle yapılmalıdır. Elektrodun kafatasına sürekli temasını sağlamak için, aşağıdaki adımlar dikkate alınması önemlidir. İlk olarak, sterilize edilmiş pamuk çubuk yardımıyla kafatasındaki doku pisliğini çıkarın, çünkü elektrot kafatasından ayrılabilir. İkincisi, elektrotu kafatasına takmak için siyanoakrilat kullanın. Üçüncü olarak, diş çimentosunun yeterli viskozitesini koruyun. Dental çimentoyu iki kat uygulamak daha iyidir; Ilk katmanın kafatasını örtmek için biraz yoğun olması gerekirken ikinci katın, birinci katın köşelerini örterek biraz akması gerekir. Diş çimentosuna kuvvetli yapışkan yapıştırmak için bir pipet ucu ile hafifçe dokunun. Çok sulu ise, elektrık altında bir izolasyon tabakası oluşturabilirÇok yoğun ise, diş çimentosu kendi ağırlığı nedeniyle kafatasından kolaylıkla düşecektir. Hayatta kalma ameliyatı boyunca yavru vücudunun sıcaklığını 37 ° C'de korumak da önemlidir.
Bu prosedürün uygulanması, P8 ve P15 yaşları arasındaki yenidoğan sıçan yavrularında EEG kaydetmekle sınırlıdır, çünkü büyüyen yavrular diş çimentosunu ve elektrotunu kafatasından çıkarabilir. Daha sonraki uygulamalar açısından, bu yöntem yetişkin sıçanların ve farelerin küçük bir değişiklikten sonra elektriksel aktivitesini kaydetmek için de kullanılabilir. Dahası, bu yöntem, yükselen artı labirent gibi çeşitli davranış deneylerinde kullanmak için iyi bir fikir vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Doğa Bilimleri Vakfı (31171355) ve Guangdong Doğa Bilimleri Vakfı (S2011010003403, 2014A030313440) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
- Pereda, A. E. Electrical synapses and their functional interactions with chemical synapses. Nat Rev Neurosci. 15 (4), 250-263 (2014).
- Chorev, E., Epsztein, J., Houweling, A. R., Lee, A. K., Brecht, M. Electrophysiological recordings from behaving animals--going beyond spikes. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 513-519 (2009).
- Freeborn, D. L., McDaniel, K. L., Moser, V. C., Herr, D. W. Use of electroencephalography (EEG) to assess CNS changes produced by pesticides with different modes of action: effects of permethrin, deltamethrin, fipronil, imidacloprid, carbaryl, and triadimefon. Toxicol Appl Pharmacol. 282 (2), 184-194 (2015).
- Werhahn, K. J., Hartl, E., Hamann, K., Breimhorst, M., Noachtar, S. Latency of interictal epileptiform discharges in long-term EEG recordings in epilepsy patients. Seizure. 29, 20-25 (2015).
- Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A. Electrophysiological biomarkers of epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 334-346 (2014).
- Nimmrich, V., Draguhn, A., Axmacher, N. Neuronal Network Oscillations in Neurodegenerative Diseases. Neuromolecular Med. 17 (3), 270-284 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. J Vis Exp. (101), e52554 (2015).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Dzhala, V. I., et al. NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. Nat Med. 11 (11), 1205-1213 (2005).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Savard, A., et al. Involvement of neuronal IL-1beta in acquired brain lesions in a rat model of neonatal encephalopathy. J Neuroinflammation. 10, 110 (2013).
- Cuaycong, M., et al. A novel approach to the study of hypoxia-ischemia-induced clinical and subclinical seizures in the neonatal rat. Dev Neurosci. 33 (3-4), 241-250 (2011).
