Summary
Qui introduciamo una nuova tecnica per la registrazione dell'elettroencefalografia (EEG) nei cuccioli epilettici neonatali liberi e descrivere le sue procedure, le sue caratteristiche e le sue applicazioni. Questo metodo consente di registrare EEG per più di una settimana.
Abstract
EEG è un metodo utile per rilevare l'attività elettrica nel cervello. Inoltre, è uno strumento diagnostico ampiamente usato per varie condizioni neurologiche, come l'epilessia e le patologie neurodegenerative. Tuttavia, è tecnicamente difficile ottenere le registrazioni EEG nei neonati in quanto richiede una manipolazione specializzata e una grande cura. Qui presentiamo un nuovo metodo per registrare EEG nei cuccioli di ratto neonatale (P8-P15). Abbiamo progettato un elettrodo semplice e affidabile usando pin loci del computer; Può essere facilmente impiantato nel cranio di un cucciolo di topi per registrare segnali EEG di alta qualità nel cervello normale e epilettico. I cuccioli sono stati somministrati un'iniezione intraperitoneale (ip) dell'acido cainico neurotossico (KA) per indurre crisi epilettiche. L'impianto chirurgico eseguito in questa procedura è meno costoso di altre procedure EEG per i neonati. Questo metodo consente di registrare segnali EEG di alta qualità e stabili per più di una settimana. Inoltre, questa procedura può essere applicata anche ad adultiTs e topi per studiare l'epilessia o altri disturbi neurologici.
Introduction
È ben accertato che la comunicazione continua tra i neuroni sia necessaria per ottenere una normale funzione cerebrale. La comunicazione interneuronale avviene principalmente in sinapsi, dove le informazioni da un neurone vengono trasmesse ad un secondo neurone. Questa trasmissione sinaptica è mediata da due tipi di strutture strutturali dedicate: sinapsi elettrici o chimici 1 . L'elettrofisiologia è il campo che cattura il potenziale elettrico prodotto durante la comunicazione interneuronale che controlla le funzioni e il comportamento del corpo complessivo 2 . EEG è il metodo più comunemente usato tra molte tecniche elettrofisiologiche.
EEG è una tecnica utilizzata per rilevare i cambiamenti nei segnali elettrici prodotti da stimoli interni o esterni. Inoltre, è un test essenziale per la diagnosi clinica e la predizione dei risultati di varie condizioni neurologiche come l'epilessia, il morbo di Parkinson e AlzheimerE, nonché gli effetti degli agenti farmacologici e tossicologici 3 . In generale, un paziente epilettico mostra iperexcitabilità e compromettere la connettività funzionale all'interno del cervello; Questi sono riassunti come scariche epilettiche interattive (IEDs) e possono essere registrate da EEG in forma di picchi affilati e transienti; Onde acute; Complessi ad onda a picco; O polyspikes 4 . La caratteristica principale del cervello epilettico è la comparsa spontanea di crisi epilettiche, che possono essere registrate sia dal cuoio capelluto o dal cervello parenchima per individuare l'area cerebrale responsabile delle crisi epilettiche 5 . Inoltre, l'EEG ha anche importanti implicazioni nei disturbi neurodegenerativi come la malattia di Alzheimer (AD). La ricerca suggerisce che le alterate registrazioni EEG e le reti oscillatorie compromesse nei pazienti AD sono comuni. Tuttavia, le nostre conoscenze sulla fisiopatologia delle oscillazioni di rete nelle malattie neurodegenerative iÈ sorprendentemente incompleto e deve essere ulteriormente esplorato 6 .
In questo protocollo abbiamo progettato un semplice elettrodo con cui si può registrare EEG per comprendere la comunicazione elettrica sia nel cervello normale che nel cervello patologico. L'impianto chirurgico in questo metodo è più economico di altre procedure disponibili 7 . Inoltre, questo metodo può essere usato per registrare segnali EEG di alta qualità e stabili per tempi più lunghi ( cioè 2-4 ore ogni giorno per 1 settimana). Inoltre, abbiamo utilizzato elettrodi più leggeri (pesa circa 26 mg) che permettono agli animali di comportarsi più naturalmente 8 . Questo metodo è ampiamente applicabile allo studio di EEG nei cuccioli di ratto neonatale che richiede l'amplificatore e il digitalizzatore, comunemente usato nel laboratorio di elettrofisiologia e non richiede alcun dispositivo aggiuntivo.
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Protocol
La cura degli animali, la procedura chirurgica e le procedure di registrazione sono state conformi alle linee guida del comitato per la cura e l'uso degli animali normali dell'Università del Sud della Cina.
1. Preparazione elettrodi (Figura 1A-C)
NOTA: Il pin loci del computer è semplicemente un contatto a contatto come parte dell'interfaccia di segnale nei dispositivi di comunicazione. È costituito da un connettore maschio che si collega al connettore femmina.
- Separare con cautela i perni maschi e femmine dal perno del computer ( Figura 1A ) con l'aiuto di un pincer. Collegare i perni maschi e femmine per formare un elettrodo e applicare cianoacrilato per creare un forte legame adesivo ( figura 1C ).
- Mettere gli elettrodi in un bicchiere pieno di acqua distillata per e metterlo in un detergente ultrasonico per 10 min. Spostarli in un forno a secco a 45 ° C per 30 minuti. Sterilizzare gli elettrodi con luce UV per 30 min.
2. Procedura chirurgica (Figura 1D-F)
- Preparare gli strumenti chirurgici sterilizzati e gli apparecchi stereotossici. Anestetizzare il cucciolo al neonato con anestesia isoflurana (2,5%) con aria. Quando il cucciolo è profondamente anestetizzato, regolare la dose di isoflurano all'1, 0%. Eseguire un pizzico di coda o punta prima della chirurgia per assicurare la giusta profondità dell'anestesia.
- Fissare la testa del cucciolo nell'apparato stereotossico posando le barre degli orecchi nei canali dell'orecchio e leggermente stringendoli.
NOTA: Non stringere eccessivamente le barre d'orecchio, poiché il cranio neonatale è molto morbido. - Mantenere il campo chirurgico sterile spruzzando tutte le apparecchiature con il 70% di etanolo. Effettuare un'incisione di 15 mm sulla testa usando un bisturi. Usando le pinze, tirare delicatamente il cuoio capelluto dalla linea mediana ai quattro angoli. Mettere un po 'di cotone imbevuto di soluzione salina sotto la pelle per mantenere l'incisione aperta ( Figura 1D ).
- Trova i punti bregma e lambda sul cranioE contrassegnarli con una matita. Utilizzare un ago a siringa (26 G) per realizzare due fori della burrata nella corteccia prefrontale (PFC) e nell'ippocampo.
NOTA: Il PFC si trova a +1,8 mm posteriormente al bregma e -0,5 mm lateralmente alla linea mediana, mentre l'ippocampo è posizionato a -2,0 mm anteriori a bregma e ± 0,5 mm laterali alla linea mediana ( Figura 1D e E ). La profondità dell'elettrodo non deve superare i 2 mm sotto la superficie corticale per ridurre al minimo i danni cerebrali. - Utilizzare pinze per tenere gli elettrodi e inserire rispettivamente gli elettrodi di riferimento e di registrazione nel PFC e nell'ippocampo. Applicare unguento eritromicina intorno all'elettrodo per evitare eventuali infezioni. Fissare l'elettrodo usando cianoacrilato.
- Preparare il cemento acrilico dentale in modo che abbia una consistenza leggiadrabile e viscosa. Applicare il cemento dentale per coprire gli elettrodi e il resto del cranio.
NOTA: Asciugare bene il cranio prima di applicare il cemento dentale. Applicare 5% di acido picrico sugli elettrodi per proteggerli.
NOTA: L'intera procedura deve essere eseguita in un cappuccio di biosicurezza per mantenere le condizioni sterili. - Rimuovere l'animale dalla struttura stereotaxicica e iniettare 300 μL di glucosio al 10% sottocutaneo. Metterlo su una coperta riscaldata per il recupero. Assicurarsi che l'animale sia caldo (37 ° C) e ambulatorio ( cioè completamente recuperato). Somministrare buprenorfina intraperitonealmente (0,05 mg / kg) per il dolore post-chirurgico.
NOTA: Non lasciare un animale incustodito finché non ha ripreso sufficiente coscienza (comportamento e movimento normali). - Ritorna il cucciolo alla sua gabbia di casa con la loro diga dopo che ristabilisce la coscienza. Attendere due giorni fino a che l'animale non sia completamente recuperato.
3. Registrazione EEG
- Dopo il ripristino completo, collegare gli elettrodi implantati sul cranio del cucciolo all'amplificatore nella propria gabbia. Collegare l'amplificatore ad un cavo analogico-digitaleOnverter e collegare il convertitore ad un computer; Le linee di collegamento devono essere trattate attentamente in modo che non si aggrappano.
- Selezionare almeno 10.000 Hz di frequenza di campionamento sull'unità di acquisizione dati per la registrazione (la larghezza di banda del trasmettitore è 1-100 Hz). Assicurarsi che i dati siano campionati correttamente.
- Dopo avere ottenuto la registrazione baseline, iniettare il cucciolo intraperitonealmente con acido kainico (KA) (2 mg / kg) per indurre crisi epilettiche. 15 minuti dopo l'iniezione di KA osservare e registrare gli scarichi epilettici. I sequestri prodotti attraverso KA sono solitamente fisici.
NOTA: La durata ictal-tonic è di circa 15,2 ± 0,9 s, la durata della sequenza è di circa 62 ± 5 s. È possibile prevenire sequestri nel ratto neonatale dando l'iniezione IP di cloridrato (400 mg / kg). - Salvare i dati digitalizzati e analizzarli utilizzando pacchetti software di elaborazione del segnale, ad esempio spike2. Rivelare il livello di potenza dei diversi componenti di frequenza nel segnale EEG neonatale da perfL'analisi di spettro di potenza. Calcola la potenza in un tempo di 1 min, trovando l'ampiezza radice-media quadrata da 1 a 100 Hz (banda EEG) 9 .
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Representative Results
Se le suddette procedure chirurgiche sono condotte correttamente, sarà eseguita con successo una registrazione del neonato pupino di ratto del canale EEG. 10 minuti dopo l'iniezione KA, un regolare schema di segni comportamentali è emerso sotto forma di movimenti irregolari e graffi, tremori e perdita di equilibrio. La Figura 2 mostra le tracce EEG esplosive rappresentative e le tracce espanse interattive, ictal-tonic e ictal-clonic. Gli schemi di scarico ETS intermittenti e ictali ricorrenti hanno iniziato 15-60 min (30 ± 5,2 min; media ± SEM) dopo l'iniezione KA ( Figura 2A e 2B ). La figura 2D e 2E rappresentano le crisi tonico-cloniche che sono il tipo più comune. La durata ictal-tonic durò 15,2 ± 0,9 s ( figura 2D ). I risultati rappresentativi hanno mostrato che gli scarichi tonici sono stati seguiti da burst cloni ( Figura 2B, 2D e 2 E ).
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Figura 1: Illustrazione del protocollo di impianto chirurgico. ( A ) Perni di computer minuscoli. ( B ) Perno femminile (a sinistra) e perno maschio (a destra). La barra di scala viene utilizzata per misurare la lunghezza del perno femminile. ( C ) Pin femmina e maschio connessa. ( D ) Cranio esposto. N. 1 presenta il sito di riferimento, n. 2 presenta Bregma, n. 3 e 4 presenti siti di registrazione, e n. 5 presenta Lambda. ( E ) Impianto elettrodo. N ° 1 presenta l'elettrodo di riferimento, n. 3 e 4 presenti l'elettrodo di registrazione. ( F ) Cucciolo di ratto recuperato (P9). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Figura 2: sequestro neonatale indotto da KA. ( A ) Una traccia EEG rappresentata da un topo P10 che è stato iniettato con KA (2 mg / kg, ip) ha mostrato scariche ricorrenti di scoppio epilettico. ( B ) Visualizzazione estesa di scariche epilettiche simili a cluster a partire dalla scatola in A. ( C , D e E ) Le tracce tipiche interictali, ictal-tonic e ictal-clonic espanse dalla casella in B. ( F ) Dati summenzionati La potenza media EEG (1 min di tempo) prima e dopo l'iniezione KA (media ± SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Impostazione della registrazione EEG. La registrazione di traccia rappresentativa è shoWn nel cucciolo di topo neonatale liberamente mobile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui riportiamo procedure chirurgiche e di registrazione per acquisire EEG in cuccioli di ratto neonatale liberamente in movimento mediante metodo cablato ( Figura 3 ). È stato suggerito che il cucciolo di topi P7-P12 è all'età di sviluppo che corrisponde a un neonato umano a pieno termine 10 , 11 . E 'tecnicamente difficile ottenere dati di registrazione EEG di alta qualità quando si lavora con i cuccioli di ratto in questo gruppo di età. Inoltre, richiede una gestione specializzata e una grande cura 8 .
Precedenti studi che esaminano le registrazioni in vivo di EEG in ratti neonatali sono state condotte utilizzando soluzioni di registrazione cablate in P12 o negli anziani 12 , ma questi approcci sono molto costosi. Basandosi su semplici elettrodi, siamo stati in grado di realizzare un elettrodo ( Figura 1 ) che riduce il costo dell'esperimento a un minimo di $ 1 mentre ancora fornisce EEG ad alta densitàregistrazioni. L'impianto chirurgico in questo metodo può richiedere fino a 10 minuti, a seconda della complessità dell'intervento.
I passi critici in questo protocollo sono l'impianto degli elettrodi. Dovrebbe essere fatto con attenzione. Per mantenere il contatto costante dell'elettrodo con il cranio, i seguenti passi sono importanti da considerare. Innanzitutto, rimuovere i detriti tissutali sul cranio con l'aiuto di un tampone di cotone sterilizzato perché può disporre l'elettrodo dal cranio. In secondo luogo, utilizzare correttamente il cianoacrilato per fissare l'elettrodo con il cranio. In terzo luogo, mantenere l'adeguata viscosità del cemento dentale. È meglio applicare cemento dentale in due strati; Il primo strato dovrebbe essere un po 'densa per coprire il cranio mentre il secondo strato dovrebbe essere un po' corto per coprire gli angoli del primo strato. Toccare delicatamente il cemento dentale con una punta della pipetta per sistemarlo giù per fare il forte legame adesivo. Se è troppo acquoso può costruire uno strato isolante sotto l'elettrOde, e se è troppo denso, il cemento dentale scenderà facilmente dal cranio a causa del proprio peso. È inoltre importante mantenere la temperatura corporea del pupino a 37 ° C per tutta la durata della chirurgia.
L'applicazione di questa procedura è limitata alla registrazione di EEG nei cuccioli di ratti neonatali tra le età di P8 e P15, poiché i cuccioli in crescita possono rimuovere il cemento dentale e l'elettrodo dal loro cranio. In termini di ulteriori applicazioni, questo metodo può essere utilizzato anche per registrare l'attività elettrica di ratti e topi adulti dopo modifica minima. Inoltre, questo metodo si presta bene ad utilizzare in vari esperimenti comportamentali, come il labirinto elevato più.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione della Scienza Naturale della Cina (31171355) e dalla Fondazione della Scienza Naturale del Guangdong (S2011010003403, 2014A030313440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
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