Summary
Levende cellebilleddannelse af de mærkede blodceller i okulærcirkulationen kan give information om inflammation og iskæmi i diabetisk retinopati og aldersrelateret maculadegenerering. En protokol til mærkning af blodceller og billede af de mærkede celler i nethindecirkulationen er beskrevet.
Abstract
Den retinale og choroidale blodstrømdynamik kan give indsigt i patofysiologien og følgerne af forskellige okulære sygdomme, såsom glaukom, diabetisk retinopati, aldersrelateret maculadegeneration (AMD) og andre okulære inflammatoriske tilstande. Det kan også hjælpe med at overvåge de terapeutiske reaktioner i øjet. Den korrekte mærkning af blodcellerne, kombineret med levende celledannelse af de mærkede celler, muliggør undersøgelse af strømningsdynamikken i retinal og choroid cirkulation. Her beskriver vi de standardiserede protokoller af henholdsvis 1,5% indocyaningrøn (ICG) og 1% natriumfluoresceinmærkning af henholdsvis mus-erythrocytter og leukocytter. Scanning laser ophthalmoskopi (SLO) blev anvendt til at visualisere de mærkede celler i retinalcirkulationen af C57BL / 6J mus (vildtype). Begge metoder demonstrerede tydelige fluorescensmærkede celler i mus-retinalcirkulationen. Disse mærkningsmetoder kan have bredere anvendelser i forskellige okulære sygdommemodeller.
Introduction
At studere blodcellernes strømningsdynamik i retinal og choroid cirkulation er afgørende for at forstå patogenesen af potentielt synstruende okulære sygdomme og andre okulære inflammatoriske tilstande. De konventionelle angiografiteknikker, der involverer binding af fluorescerende farvestoffer til plasmaproteiner, tilvejebringer imidlertid ingen oplysninger om dynamikken af erythrocytterne eller leukocytterne 1 . Den erytrocytiske retinale strømningsdynamik er vigtig for at studere metabolisk effektiv cirkulation i nethinden og leukocytflowdynamikken til forståelse af cellemigration, genkendelse, vedhæftning og ødelæggelse under forskellige inflammatoriske tilstande 2 . Der er flere fluorescerende molekyler anvendt til identifikation og karakterisering af forskellige celletyper 3 . Hemodynamikken af blodcellerne kan måles ved farvning af dem med de passende fluorerCent farvestoffer og anvende de rette billeddannelsesteknikker 4 .
Tilstedeværelsen af inflammatoriske responser i intraokulære sygdomme som aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og diabetisk retinopati (DR) involverer ophobning af lymfocytter i det syge område 5 , 6 . Sporing af immuncellerne i vævene kan hjælpe med at forstå de komplekse hændelser, der er involveret i sygdomspatogenesemekanismen. Radioaktive isotoper som 51 Cr og 125 I blev anvendt som cellestoffer i tidlige studier. Disse farvestoffer er toksiske og påvirker cellens levedygtighed. Skønt de radioaktive markører 3 H og 14 C er mindre giftige for cellerne, er det på grund af deres lavere emissionsenergier vanskeligt at detektere deres signaler i systemet 7 , 8 . En række fluorochromfarvestoffer blev indført for at overvinde de potentielle problemer forbundet med wMed radioaktive markører og sporlymfocytmigrering in vitro under anvendelse af fluorescerende mikroskopi og flowcytometri 9 , 10 . Hoechst 33342 og thiazolorange er DNA-bindende fluorescerende farvestoffer, som anvendes til at spore lymfocytter in vivo. Hoechst 33342 binder til AT-rige regioner i DNA'et, er membrangennemtrængeligt, bevarer fluorescerende signaler i 2 - 4 dage og er modstandsdygtig over for slukning 9 , 10 . Ulemperne ved Hoechst 33342 og thiazolorange er inhiberingen af lymfocytproliferation 11 og den korte halveringstid henholdsvis 9 .
Calcein-AM, fluoresceindiacetat (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (og -6) -carboxyfluorescein, acetoxymethylester (BCECF-AM), 5- (og -6) Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) og 5- (og -6) -carboxyfluoresceindiacetatacetoxymethylester (CFDA-AM)Er de cytoplasmatiske fluorescerende farvestoffer anvendt til lymfocytmigrationsundersøgelser. FDA, CFDA og CFDA-AM har imidlertid lavere retention i cellerne 9 . BCECF-AM reducerer det proliferative respons og påvirker kemotaxis- og superoxidproduktionen 9 , 12 . Calcein-AM er et fluorescerende farvestof og anvendeligt til kortvarige in vivo lymfocytmigrationsundersøgelser. Det udsender stærke fluorescerende signaler, interfererer ikke med de fleste af de cellulære funktioner og bevarer fluorescerende signaler i op til 3 dage 12 , 13 . Fluoresceinisothiocyanat (FITC) og carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFDA-SE) er kovalente koblings fluorescerende farvestoffer, som anvendes til lymfocytmigrationsstudier. FITC udviser ingen virkning på cellens levedygtighed og har en stærkere affinitet med B-lymfocytter end T-lymfocytter 14 , 15 in vivo i mere end 8 uger og op til 8 celledele 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 og PKH26 er membran- Indsættelse af fluorescerende lipofile carbocyaninfarvestoffer anvendt til mærkning af leukocytter og erythrocytter. C18 Dil og DiO udviser højere signaler, når de inkorporeres i cellemembranen og er relativt ikke-toksiske 12 , 17 . PKH2-, PKH3- og PKH26-mærkede celler udviser en god retention af fluorescerende signaler med mindre toksicitet 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Imidlertid regulerer PKH2 ned CD62L-udtrykket og reducerer ly Mphocyt-levedygtighed 23 .
De fleste af de ovennævnte undersøgelser er blevet udført for at spore lymfocytmigrationen og proliferationen i lymfatika og studere de mærkede erytrocytter i den ikke-okulære cirkulation. Der er meget få undersøgelser, der anvender mærkningsteknikkerne til at studere blodcellerne i okulærcirkulationen. Anvendelse af scanning laser ophthalmoskopi (SLO) har en stor fordel ved at studere de mærkede celler i retinal og choroid cirkulation in vivo ved fundus angiography 24 . Der er flere fluorescerende farvestoffer, såsom ICG, acridinorange, FITC, natriumfluorescein og CFDA, der anvendes til at studere leukocytterne i retinalcirkulationen ved SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . Fototoksiciteten og carcinogeniciteten af acridinorange 26 , 27 , interferensen af FITC med den cellulære aktivitet og behovet for et intravaskulært kontrastmiddel til opløsning af retinale og choroidale blodkar begrænser deres anvendelse i in vivo dyreforsøg 29 . Natriumfluorescein og ICG er ikke-toksiske, godkendt af Food and Drug Administration, og er sikre til test på mennesker 32 , 35 . De fleste flowdynamiske undersøgelser er relateret til mærkning af leukocytterne eller erythrocytterne og dets visualisering i retinale og choroidale blodkar 36 , 37 , 38 , 39
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprotokollerne anvendt i denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle dyrepleje- og brugskomité for SingHealth, Singapore, og er i overensstemmelse med retningslinjerne fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklæring om brug af dyr i øjet og øjne Forskning.
1. Mærkning af erythrocytter og leukocytter med fluorescerende farvestoffer
- Fremstilling af reagenser
- Forbered ICG (1,5 mg / ml) ved at opløse 3 mg ICG i 1800 μL steriliseret destilleret vand. Tilsæt 200 μl 10x phosphatpufret saltvand (PBS).
- Forbered 40% 1x PBS ved at tilsætte 4 ml 1x PBS til 6 ml steriliseret destilleret vand. Forbered 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS ved at tilsætte 100 mg BSA til 10 ml 1x PBS. Bland godt, indtil BSA er opløst.
- Isolering af erythrocytter og leukocytter ved anvendelse af densitetsgradientcentrifugering
- Bedøve musene (wild tyPe C57BL / 6) ved anvendelse af en kombination af ketaminhydrochlorid (50 mg / kg) og xylazinhydrochlorid (0,5 mg / kg) (ifølge skema 1 under ARVO retningslinjer). Bekræft anæstesi ved tilbagetrækning af pedaludtag ( dvs. tåneknap).
- Sæt langsomt 29 gauge nålen (fastgjort til en 1 ml sprøjte) ved en korsvinkel rettet mod hjertet. For at bekræfte, at nålen er inde i hjertet, skal du straks fjerne stemplet og kontrollere, om blodet trækkes tilbage i sprøjten. Exsanguinate 0,8 - 1 ml blod direkte fra hjertet.
- Overfør straks blodet til en ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (1,8 mg / ml blod), der indeholder blodopsamlingsrør og bland forsigtigt for at forhindre koagulering af blodet.
- Euthaniser musene ved at administrere pentobarbital (80 mg / kg) ved intraperitoneal injektion.
- Lag hele blodet på toppen af en polysucrose- og natriumdiatrizoatopløsning (1: 1-forhold, densitet 1,077 g / ml) i et 2 ml mikrocentrifugerør og centriFuge (450 xg, 30 min) for at muliggøre adskillelsen af leukocytter og erythrocytter fra plasmaet.
- Fjern og kassér supernatanten (plasma) ved hjælp af en pipette. Overfør forsigtigt buffy coat (leukocytter) og erythrocytter (rød blodcellelag) til nye og separate rør ved hjælp af pipetter.
- ICG (1,5%) mærkning af erythrocytter
- Vask erythrocytterne med 1x PBS for at fjerne eventuelle forurenende stoffer. Resuspender erythrocytterne i 1x PBS (1: 1) for at gøre 50% hæmatokrit. Aliquot 0,5 ml 50% hæmatokrit (~ 250 μl pakket erythrocytter) i mikrocentrifugerør. Centrifuger erythrocytterne (750 xg, 5 min) og kassér supernatanten.
- Tilsæt 200 μl 40% 1x PBS til de pelleterede erythrocytter, bland godt og inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter. Tilsæt 100 μL ICG (1,5 mg / ml) til erytrocyt suspensionen, bland forsigtigt ved at omvendte røret og inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter. Tilsæt 300 μl 1x PBS og inkuber på37 ° C i en shaker-inkubator i 60 minutter.
- Centrifuge bærer erythrocytter (750 xg, 3 min) og resuspender i 1 ml 1x PBS.
- Vask cellerne ~ 3 - 5 gange med 1x PBS indtil supernatanten er klar (trin 1.3.3). Efter den sidste vask dekanterer supernatanten og tilsættes 1% BSA PBS (1: 1) til de mærkede forsvulmede erythrocytter for at opnå en 50% hæmatokrit (1,25 x 108 celler / ml) af ICG-mærket erythrocytter.
- Natriumfluorescein (1%) mærkning af leukocytter
- Efter separering af buffy coat fra blodet ved anvendelse af densitetsgradientcentrifugering (fra trin 1.2.6) vaskes cellerne en gang med 10 ml 1x PBS ved centrifugering ved 450 xg i 10 minutter for at fjerne eventuelle forurenende stoffer. Resuspender pelleten i 900 μl 1x PBS.
- Tilsæt 100 μl 10% natriumfluorescein til 900 μl af leukocyt-suspensionen og inkuber ved stuetemperatur i 2 minutter. Vask de mærkede celler tre gange med 10 ml 1X PBS ved centrifugiNg (450 xg, 10 min). Resuspender cellerne i 100 μl 1x PBS.
2. Levende billeddannelse af fluorescensmærkede celler
- Live-celledannelse af ICG mærket erythrocytter
- For at forberede celler til injektion via haleven eller retro-kredsløbsrute fortyndes 50% hæmatokrit af ICG-mærket erythrocytter med 10 gange og 50 gange med 1x PBS for henholdsvis henholdsvis 5% og 1% hæmatokritceller.
- Placer musen under infrarødt lys (250W intensitet) i 5 minutter for at lade svalevenen dilate. Bedøv musen med ketaminhydrochlorid (50 mg / kg) og xylazinhydrochlorid (0,5 mg / kg) gennem intraperitoneal injektion (her ifølge skema 1 under ARVO retningslinjer).
- Fortynd hver elev af øjnene med en dråbe på 0,5% tropicamid og 2,5% phenylephrinhydrochlorid.
- Placer kontaktlinsen over et øje til billeddannelse. Brug oftalmisk gel som medium til billeddannelse og for at forhindre drynesS af hornhinden. Fix det konfokale laserscanning ophthalmoskopi (SLO) kamera med +25 diopter linse for at kompensere for brydningen af musens øje.
- Placer musen på SLO billedplatformen. Sørg for, at hornhinden af musen vender lige mod SLO-maskineens optiske hoved.
- Tænd imagingmodulet. Brug den tilhørende billedmodul software, klik på knappen "Ny patient" og tilføj animal identifikation detaljer såsom øre tag nummer, fødselsdato, procentdel af fluorescerende farve og mærket celletype.
- Anbring dyrets optiske nerve i midten af billedskærmen ved at manøvrere billeddannelsesmodulet. Brug det tilhørende billedmodul software, klik på "Acquire" knappen for at tage infrarød (IR) fundus billeder med 30 ° eller 15 ° vinkel visning indstilling. Sørg for, at midten af nethinden, pupillen og den optiske vej af laseren er justeret for at opnå et bedste kvalitetsbillede.
- Anbring dyrets optiske nerve i midten af billedskærmen ved at manøvrere billeddannelsesmodulet. Brug det tilhørende billedmodul software, klik på "Acquire" knappen for at tage infrarød (IR) fundus billeder med 30 ° eller 15 ° vinkel visning indstilling. Sørg for, at midten af nethinden, pupillen og den optiske vej af laseren er justeret for at opnå et bedste kvalitetsbillede.
- Tag ICG fundus videoen.
- Tænd for ICG-filteret (790 nm), indstil kameraet til højhastighedstilstand med vinkelvisningen 30 ° eller 15 ° og indstil ICG-intensiteten til 85 for alle målinger til standardisering. På kontrolpanelet skal du klikke på "Acquire" knappen for at tage videoen (baseline kontrol) ved 8,8 / 15 billeder / s i 1 min.
- Indlæs 100 μL ICG mærket erythrocytter i en insulin sprøjte fastgjort til en 30 gauge nål.
- Til indsprøjtningen via halevenen, indsæt nålens kant i halevenen. Bekræft den intravenøse adgang ved at kontrollere blodets tilbagestrømning i sprøjten og injicere de mærkede celler i cirkulationen.
- Til injektionen via den retro-orbitale rute indsætter nålen ved siden af øjet ind i retro-kredsløbets afstande. Bekræft retro-kredsløbets adgang ved at kontrollere blodets tilbagestrømning i sprøjten og injicere de mærkede celler i cirkulationen.
- Efter indsprøjtningen skal du placere musen og tage IR fundus-billederne (se trin 2.1.6.1) og video ved hjælp af ICG-filteret (se trin 2.1.7.1). De mærkede celler i retinalcirkulationen kan visualiseres umiddelbart efter injektionen af cellerne.
- Efter at have købt videorammerne, skal du udtrække .tiff-billeder af videosekvenserne ved at vælge .tiff-formatet, når du eksporterer videoen ved hjælp af SLO-billedmodulets software. Gem filerne i en ønsket mappe.
- Fjern kontaktlinsen, læg den over det andet øje og afslut billeddannelsen som beskrevet i trin 2.1.4 - 2.1.7.
- Efter billeddannelse anbringes det bedøvede dyr under infrarødt lys (250W) for at opretholde kroppstemperaturen, indtil den genopstår fra anæstesi. Når dyret er fuldt ud gendannet, skal du placere musen tilbage i holderen.
- Live-celledannelse af 1% natriumfluoresceinmærkede leukocytter
- Klargør musen og sæt instrumentet op som beskrevet i afsnit 2.1.
- Placer musen og tag IR fundus billederne som beskrevet i trin 2.1.4 - 2.1.6.
- Hent fluorescein-angiogrammet fra musen ved hjælp af fluoresceinfilteret (488 nm) med højhastigheds-kameramodus med 30 ° eller 15 ° vinkel og fluoresceinintensitet ved 85 for alle målinger til standardisering. Optag videoen (baseline kontrol) ved 8,8 / 15 rammer / s (se trin 2.1.7.1).
BEMÆRK: Her blev flere spor af videoer (1 min videoer) erhvervet med forskellige tidsintervaller.
- Hent fluorescein-angiogrammet fra musen ved hjælp af fluoresceinfilteret (488 nm) med højhastigheds-kameramodus med 30 ° eller 15 ° vinkel og fluoresceinintensitet ved 85 for alle målinger til standardisering. Optag videoen (baseline kontrol) ved 8,8 / 15 rammer / s (se trin 2.1.7.1).
- Injicer 100 μL mærket leukocytter i musen gennem halevenen eller den retro-orbitale injektion som beskrevet i afsnit 2.1.8.
- Lige efter injektionen skal du placere musen og tage IR fundus billederne (se trin 2.1.5 og 2.1.6) og fluoRescein angiogram af musen (se afsnit 2.2.2).
- Overhold de mærkede celler i retina eller choroidale blodkar ved at justere fokuseringspunktet for scanningslaseren ved at dreje fokuseringsknappen på billedmodulet.
- Få videobilleder og billeder ved hjælp af SLO-billedmodulprogrammet (se trin 2.1.10) og gem det i en ønsket mappe.
- Efter proceduren skal du følge trin 2.1.12 til pasning af dyr.
- Billedanalyse af MtrackJ software
- Åbn billedsekvensen i ImageJ ved at klikke på "File". Vælg "Import" og vælg "Billedsekvens", vælg den ønskede billedmappe og klik på "Åbn". Et popup-vindue kaldet "Sekvensoptioner" vises på skærmen. Klik på "Ok"; Billedsekvensen åbnes.
- Indstil rammeintervallet for billedvideoen ved at klikke på "Billede" og vælg "Egenskaber" for hastighedsmålinger. Her er det 8,8 fremes / s.
- Åbn MTrackJ plugin ved at vælge "Plugins". Vælg "Sporing" og vælg derefter "MtrackJ". En menu skal vises.
- For at justere sporingsindstillingerne skal du vælge "Sporing" (under menuen) og markere feltet "Flyt til næste tidsrammeindeks efter tilføjelse af punkt".
- Spor den første celle.
- Find en celle og spor den samme celle i efterfølgende rammer. På menuen klik på "Tilføj" for at tilføje et nyt spor.
- Hold markøren over billedet (+ tegn) og klik på den relevante celle.
BEMÆRK: MTrackJ hopper automatisk til næste tidsramme og tilføjer en lille cirkel, der markerer positionen for det første punkt i banen. - Fortsæt med at klikke på den aktuelle position af cellen, mens du flytter gennem rammerne i billedsekvensen.
BEMÆRK: De cirkler, der markerer de foregående punkter i banen, lejlighedsvis forstyrrer evnen til at se den aktuelle placering. Hvis dette sker,Fortsæt til trin 2.3.5.3.1.- Skift visningsindstilling for bane ved at klikke på "Visning" i menuen og vælge indstillingen "vis kun sporpunkter på nuværende tidspunkt". For at se alle baner skal du afvælge denne indstilling.
- Fortsæt med at klikke, indtil bane af den første celle ses. Gem derefter sporet ved at klikke på "Gem".
- Spor den anden celle.
- Klik på "Tilføj" i menuen for at starte et nyt spor. Gentag trin 2.3.5.1 - 2.3.5.4 for at spore den nye celle. Klik på "Gem" for at gemme det andet spor.
- Fortsæt disse trin for alle observerbare sporbare celler. Efter at have sporet cellerne skal du klikke på "Mål" og "OK" i menufanen for at få resultaterne.
BEMÆRK: Et resultatvindue åbnes automatisk, som kan gemmes og åbnes i et regneark for yderligere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erythrocytter mærket med 1,5% ICG blev visualiseret i retinalcirkulationen af C57BL / 6J mus (vildtype). Både 1% og 5% hæmatokrit af 1,5% ICG-mærket erythrocytter skelnes i retinalcirkulationen. De individuelle mærkede celler blev dog tydeligere visualiseret med 1% hæmatokrit af 1,5% ICG-mærket erythrocytter ( Figur 1 ). I 5% hæmatokrit var det ikke muligt at markere den enkelte celle på grund af det store antal mærkede celler i retinalkarrene. Nogle erythrostaser blev observeret i peripapillærområdet under begge betingelser, men det var mere fremtrædende i 5% hæmatokriten af mærket erythrocytter ( figur 2 ).
Leukocytter blev med succes mærket med 1% natriumfluorescein efter ovennævnte protokol og blev visualiseret som grønne mærkede celler under anvendelse af fluorescerende mikroskopi (
95 / 55495fig1.jpg "/>
Figur 1 : 1% hæmatokrit af 1,5% ICG-mærket erythrocytter i retinalcirkulationen. ICG mærket individuelle erythrocytter, der udviser lyse signaler i retinalkarrene. Nogle erythrostaser blev observeret i peripapillærområdet. Skala = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : 5% hæmatokrit af 1,5% ICG-mærket erythrocytter i retinalcirkulation. Mange ICG-mærket erythrocytter viser lyse signaler i retinalkarrene; En stor mængde erythrostase blev observeret i peripapillærområdet. Skala = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 : Fluorescensmikroskopi billede af 1% natriumfluoresceinmærkede leukocytter. Natriumfluoresceinmærkede leukocytter, der viser grønne fluorescerende signaler med små klumper (20X forstørrelse, skala = 50 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : 1% natriumfluoresceinmærkede leukocytter i retinalcirkulation. Natriumfluoresceinmærkede leukocytter (pil), der viser lyst signal i retinalkarrene. Skala = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5 : Sporing af mærkede individuelle celler i retinalcirkulation ved hjælp af Image Analysis-software. Forskellige spor (farvede cirkler og linjer som repræsenteret på billedet) blev målt til beregning af gennemsnitshastigheden af de mærkede celler i nethindecirkulationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
At studere hæmodynamikken i retinal og choroid cirkulation er afgørende for at forstå patofysiologien i mange okulære sygdomme. Blodstrømningsdynamikken i nethindecirkulationen kan studeres ved Fourier-domæne optisk kohærens tomografi (FD-OCT), laser speckle flowgraphy (LSFG) og retinal oximetri. Selvom disse metoder bruger forskellige metoder til at studere den totale blodgennemstrømning i nethindecirkulationen 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 , deler de begrænsningen af manglende evne til at studere strømningsdynamikken af individuelle celletyper. Næringsstoffer og iltforsyning til retinale og choroidale væv samt migration af immunceller i okulære inflammatoriske sygdomme og deres rolle i sygdomspatogenese kan studeres ved at undersøge strømningsdynamikken hos digYthrocytter og leukocytter i henholdsvis retinal og choroid cirkulation. Mærkningsteknikker kombineret med billeddannelsesmetoder vil hjælpe med at spore de mærkede celler i kredsløbet og studere strømningsdynamikken af de mærkede celler. Flere fluorescerende farvestoffer blev med succes anvendt til at mærke leukocytterne og erythrocyterne til undersøgelse af deres strømningsdynamik i cirkulationen 3 , 17 , 18 , 19 .
Her rapporterer vi anvendelsen af godkendte ikke-toksiske fluorescerende farvestoffer, indocyaningrøn og natriumfluorescein, til mærkning og visualisering af erythrocytterne og leukocytterne i henholdsvis retinalcirkulationen. Selvom natriumfluorescein er det mest anvendte farvestof til sporing af leukocytterne 31 , 32 , 33
For at opnå kvalitetsbilleder i SLO skal eleverne udvides fuldt ud, og kontaktlinsen skal bruges med oftalmisk gel for at opretholde en fugtig hornhinde og forhindre dannelse af grå stær. Øjnens position og den optiske vej i kameraet skal være lige for at opnå kvalitets fundus og angiogrambilleder. Dyret bør være dybt sederet for at minimere bevægelsen under billeddannelsen. Selvom både 1% og 5% hæmatokrit af 1,5% ICGMærket erythrocytter viste visualisering af fluorescensmærkede celler i nethindecirkulationen, 1% hæmatokrit var bedre egnet til overvågning af de enkelte celler. Fluorescensmærkede celler kan ikke visualiseres, hvis antallet af injicerede leukocytter er for lavt. For at opnå bedre resultater ved overvågning af de mærkede celler i nethindecirkulationen anbefales det at samle leukocytter fra mindst 4 mus, mærke med 1% natriumfluorescein og injicere i en enkelt mus. Selv om der er nogle alternative farvestoffer til natriumfluorescein (Calcein, FITC, DIO, FDA og CFDA med absorptions- / emissionsmaxima svarende til eller nær natriumfluorescein), skal fedtstofretention og toksicitet for okularvæv evalueres 9 , 12 , 13 , 14 , 17 .
Begrænsningen af den rapporterede teknik er denFading af det fluorescerende signal i omløb efter 60 minutter. Derfor skal strømningsdynamikken af de mærkede celler analyseres inden for 60 minutter. Her for at mærke leukocytter blev blod trukket tilbage fra en mus, celler blev isoleret, mærket, injiceret i en anden mus og visualiseret ved SLO. I SLO blev der imidlertid observeret kun 0-1 celle pr. Ramme i retinale blodkar. Dette kan skyldes utilstrækkeligt leukocytcelleantal, og vi anbefaler derfor at samle blod fra mindst 3 - 4 mus for at visualisere et højere celleantal pr. Ramme. Kameraets hastighed på 8,8 rammer / s blev brugt i undersøgelsen, men dette kunne øges for at opnå mere sekventielle billeder og videoer af de mærkede celler.
Tidligere studier rapporterede ændringer i blodgennemstrømningshastigheden i nethindecirkulationen hos diabetespatienter med forskellige stadier af DR. Clermont et al. Rapporterede et 33% fald i retinal blodgennemstrømning hos patienter med tidlig stadium af DR 47 og Nguyen etal. Rapporterede en stigning i nethindeblodstrømmen hos diabetespatienter med proliferativ DR 48 . En nedsat blodgennemstrømningshastighed blev også rapporteret at være forbundet med progressiv glaukom 49 . I ovennævnte undersøgelser undersøgte forfatterne hele blodgennemstrømningshastighederne i nethindecirkulationen. At studere strømningshastighederne for hver celletype kan give information om de cellulære interaktioner i forskellige sygdomme og på forskellige sygdomsstadier og kan hjælpe med prognose. Her rapporteres en metode til mærkning af erythrocytterne og leukocytterne med henholdsvis ICG og natriumfluorescein og deres visualisering i nethindecirkulationen; Denne metode kan anvendes på en hvilken som helst sygdomsmodel til in vivo undersøgelser.
Fremtidig forskning kan udnytte vores mærkningsteknikker ved hjælp af SLO for at studere variationen i strømningsdynamikken af de mærkede erytrocytter og leukocytter under forskellige lægemiddelbehandlingskriterierPå forskellige stadier af sygdommen. Desuden kan vores metoder hjælpe med at forstå rolle som erythrocytter og leukocytter i sygdomsfænotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre. Ingen økonomisk eller interessekonflikt.
Acknowledgments
Forskningsprojektet blev finansieret under New Investigator grant fra National Medical Research Council (NMRC), Singapore. Holdet vil gerne anerkende den forskningsuddannelse, der tilbydes til Dr. Agrawal ved Institute for Ophthalmology (IoO), University College London (UCL) under National Medical Research Council (NMRC) Oversøisk Forskeruddannelsesforening fra november 2012 til oktober 2014 under mentorskab af prof. David Shima. Dr. Agrawal erhvervede konceptet og færdigheder til mærkning af cellerne og levende billeddannelse i Dr. Shimas laboratorium. Holdet vil således gerne anerkende tilsyn og vejledning under træningsfællesskabet fra prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh og Dr. Daiju Iwata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Shaker incubator | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10 G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |
References
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23 (5), 975-987 (2013).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
- Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58 (3), 353-363 (2006).
- Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W.
- Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
- Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, Blackwell Scientific Pubs. Oxford. (1978).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
- Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
- Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
- DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
- Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
- Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
- Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
- Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
- Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
- Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
- Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
- Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
- Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
- Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
- Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47 (6), 572-577 (2003).
- Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
- Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
- Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14 (7), 579-584 (1995).
- Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
- Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (10), 1879-1887 (1998).
- Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235 (1), 27-31 (1997).
- Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29 (6), 374-380 (1997).
- Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
- Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104 (10), 1670-1676 (1997).
- Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151 (5), 745-751 (2011).
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34 (34), 11504-11513 (2014).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (11), 2228-2233 (1996).
- Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93 (5), 634-637 (2009).
- Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17 (5), 4061-4073 (2009).
- Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1569-1574 (2015).
- Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88 (7), 723-729 (2010).
- Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11 (7), 0159650 (2016).
- Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93 (6), 439-445 (2015).
- Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49 (7), 1085-1096 (2004).
- Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124 (4), 433-446 (1997).
- Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25 (2016).
- Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129 (6), 728-733 (2000).
