Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Fluorescerende fargemerking av erytrocytter og leukocytter for å studere strømdynamikken i musens retinalsirkulasjon

Published: July 3, 2017 doi: 10.3791/55495
Automatic Translation
*1,2,3, *2, 2, 2, 1, 2,4,5
1National Healthcare Group Eye Institute, Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore National Eye Center, 3School of Material Science and Engineering, Nanyang Technological University, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University Health Systems, National University of Singapore, 5Ophthalmology Academic Clinical Research Program, DUKE-NUS Graduate Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Levende cellebilder av de merkede blodceller i okulær sirkulasjon kan gi informasjon om betennelse og iskemi ved diabetisk retinopati og aldersrelatert makuladegenerasjon. En protokoll for å merke blodceller og bilde de merkede cellene i retinalsirkulasjonen er beskrevet.

Abstract

Retinal og choroidal blodstrømdynamikk kan gi innsikt i patofysiologien og følgerne av ulike okulære sykdommer, som for eksempel glaukom, diabetisk retinopati, aldersrelatert macular degenerasjon (AMD) og andre okulære inflammatoriske tilstander. Det kan også bidra til å overvåke terapeutiske responsene i øyet. Den riktige merking av blodcellene, kombinert med levende celledannelse av de merkede cellene, muliggjør undersøkelse av strømningsdynamikken i retinal og choroidal sirkulasjon. Her beskriver vi standardiserte protokoller av 1,5% indocyaningrønn (ICG) og 1% natriumfluorescein-merking av henholdsvis mus-erytrocytter og leukocytter. Scanning laser oftalmokopi (SLO) ble påført for å visualisere de merkede cellene i retinal sirkulasjonen av C57BL / 6J mus (villtype). Begge metoder demonstrerte tydelige fluorescensmerkede celler i muskelsirkulasjonen. Disse merkemetoder kan ha bredere anvendelser i ulike okulære sykdommermodeller.

Introduction

Studier av strømningsdynamikken til blodcellene i retinal og choroidal sirkulasjon er viktig for å forstå patogenesen av potensielt syn-truende okulære sykdommer og andre okulære inflammatoriske tilstander. Imidlertid gir de konvensjonelle angiografiteknikker, som involverer binding av fluorescerende fargestoffer til plasmaproteiner, ingen informasjon om dynamikken til erytrocyter eller leukocytter 1 . Den erytrocytiske retinalstrømdynamikken er viktig for å studere metabolisk effektiv sirkulasjon i netthinnen, og leukocytflowdynamikken, for å forstå cellemigrering, anerkjennelse, vedheft og ødeleggelse i forskjellige inflammatoriske tilstander 2 . Det finnes flere fluorescerende molekyler som brukes i identifisering og karakterisering av forskjellige celletyper 3 . Hemodynamikken til blodcellene kan måles ved å fargelegge dem med passende fluorerSent fargestoffer og anvende riktig bildebehandling teknikker 4 .

Tilstedeværelsen av inflammatoriske responser i intraokulære sykdommer som aldersrelatert macular degenerasjon (AMD) og diabetisk retinopati (DR) involverer akkumulering av lymfocytter i det sykeområde 5 , 6 . Sporing av immunceller i vevet kan bidra til å forstå de komplekse hendelsene som er involvert i sykdomspatogenesens mekanisme. Radioaktive isotoper som 51 Cr og 125 I ble brukt som cellesporere i tidlige studier. Disse fargestoffene er toksiske og påvirker cellens levedyktighet. Selv om de radioaktive markørene 3 H og 14 C er mindre giftige for cellene, er det på grunn av deres lavere utslippsenergier vanskelig å oppdage deres signaler i systemet 7 , 8 . En rekke fluorokromfarger ble introdusert for å overvinne de potensielle problemene forbundet med wMed radioaktive markører og sporlymfocytmigrering in vitro ved bruk av fluorescensmikroskopi og strømningscytometri 9 , 10 . Hoechst 33342 og tiazolorange er DNA-bindende fluorescerende fargestoffer, som brukes til å spore lymfocytter in vivo. Hoechst 33342 binder seg til AT-rike regioner i DNA, er membran gjennomtrengelig, beholder fluorescerende signaler i 2 - 4 dager og er motstandsdyktig mot slukking 9 , 10 . Ulempene med Hoechst 33342 og tiazolorange er inhiberingen av lymfocytproliferasjon 11 og den korte halveringstid henholdsvis 9 .

Calcein-AM, fluoresceindiacetat (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-karboksyetyl) -5- (og -6) -karboksyfluorescein, acetoksymetylester (BCECF-AM), 5- (og -6) Karbokyfluoresceindiacetat (CFDA) og 5- (og -6) -karboksyfluoresceindiacetat-acetoksymetylester (CFDA-AM)Er de cytoplasmatiske fluorescerende fargestoffene som brukes til lymfocytmigreringsstudier. FDA, CFDA og CFDA-AM har imidlertid lavere retensjon i cellene 9 . BCECF-AM reduserer proliferativ respons og påvirker kjemotaksis og superoksydproduksjon 9 , 12 . Calcein-AM er et fluorescerende fargestoff og er nyttig for kortvarige in vivo lymfocytmigreringsstudier. Det avgir sterke fluorescerende signaler, forstyrrer ikke de fleste av de cellulære funksjonene og beholder fluorescerende signaler i opptil 3 dager 12 , 13 . Fluorescein-isotiocyanat (FITC) og karbokfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFDA-SE) er kovalente koblings fluorescerende fargestoffer som brukes til lymfocyttmigreringsstudier. FITC utviser ingen effekt på cellens levedyktighet og har sterkere affinitet med B-lymfocytter enn T-lymfocytter 14 , 15 in vivo i mer enn 8 uker og opptil 8 celleavdelinger 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-dioktadecyl-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyaninperklorat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 og PKH26 er membran- Innsetting av fluorescerende lipofile karbocyaninfarger som brukes til å merke leukocytter og erytrocytter. C18 Dil og DiO utviser høyere signaler når de innlemmes i cellemembranen og er relativt giftfri 12 , 17 . PKH2-, PKH3- og PKH26-merkede celler utviser en god retensjon av fluorescerende signaler med mindre toksisitet 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Imidlertid regulerer PKH2 ned CD62L-uttrykket og reduserer ly Mfocyt levedyktighet 23 .

De fleste av de ovennevnte studiene har blitt utført for å spore lymfocyttmigrasjonen og proliferasjonen i lymfatika og studere de merkede erytrocyter i den ikke-okulære sirkulasjon. Det er svært få studier som bruker merketeknikker for å studere blodcellene i okulær sirkulasjon. Anvendelse av skanning laser oftalmokopi (SLO) har en stor fordel ved å studere de merkede cellene i retinal og choroid sirkulasjon in vivo ved fundus angiography 24 . Det finnes flere fluorescerende fargestoffer, slik som ICG, akridinorange, FITC, natriumfluorescein og CFDA som brukes til å studere leukocyttene i retinalsirkulasjonen ved SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . Fototoksisiteten og karsinogeniteten av akridinorange 26 , 27 , interferensen av FITC med den cellulære aktiviteten og kravet til et intravaskulært kontrastmiddel for oppløsning av retinale og koroidale blodkar begrenser deres anvendelse i in vivo dyreforsøk 29 . Natriumfluorescein og ICG er giftfri, godkjent av Food and Drug Administration, og trygt for testing på mennesker 32 , 35 . De fleste av de flytende dynamiske studiene er relatert til merking av leukocytter eller erytrocytter og dets visualisering i retinale og koloride blodkar 36 , 37 , 38 , 39

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreprotokollene som ble benyttet i denne studien ble godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk av SingHealth, Singapore, og er i samsvar med retningslinjene fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for bruk av dyr i øyelege og visjon Forskning.

1. Merking av erytrocytter og leukocytter med fluorescerende fargestoffer

  1. Fremstilling av reagenser
    1. Forbered ICG (1,5 mg / mL) ved å oppløse 3 mg ICG i 1800 μL sterilisert destillert vann. Tilsett 200 μl 10x fosfatbuffert saltvann (PBS).
    2. Forbered 40% 1x PBS ved å tilsette 4 ml 1x PBS til 6 ml sterilisert destillert vann. Forbered 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS ved å tilsette 100 mg BSA til 10 ml 1x PBS. Bland godt inntil BSA er oppløst.
  2. Isolering av erytrocytter og leukocytter ved bruk av tetthetgradient sentrifugering
    1. Bedøv musene (vill tyPe C57BL / 6) ved bruk av en kombinasjon av ketaminhydroklorid (50 mg / kg) og xylazinhydroklorid (0,5 mg / kg) (i henhold til skjema 1, under ARVO-retningslinjer). Bekreft anestesi ved tilbaketrekning av pedaluttak ( dvs. tåneknikk).
    2. Sett langsomt 29 gauge nålen (festet til en 1 ml sprøyte) i en vinkel vinkel rettet mot hjertet. For å bekrefte at nålen er inne i hjertet, trekk stemplet litt ut og kontroller om blodet trekkes tilbake i sprøyten. Exsanguinate 0,8 - 1 ml blod direkte fra hjertet.
    3. Overfør blodet omgående til en etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (1,8 mg / ml blod) som inneholder blodoppsamlingsrør og bland forsiktig for å forhindre koagulering av blodet.
    4. Euthaniser musene ved å administrere pentobarbital (80 mg / kg) ved intraperitoneal injeksjon.
    5. Lag hele blodet på toppen av en polysukrose og natriumdiatrizoatløsning (1: 1 forhold, tetthet 1,077 g / ml) i et 2 ml mikrocentrifugerør og centriFuge (450 xg, 30 min) for å tillate separasjon av leukocytter og erytrocytter fra plasmaet.
    6. Fjern og kast supernatanten (plasma) ved hjelp av en pipette. Overfør forsiktig buffy-kappen (leukocytter) og erytrocyter (rødt blodcellelag) til nye og separate rør ved hjelp av pipetter.
  3. ICG (1,5%) merking av erytrocytter
    1. Vask erytrocytene med 1x PBS for å fjerne eventuelle forurensninger. Resuspender erytrocytene i 1x PBS (1: 1) for å lage 50% hematokrit. Aliquot 0,5 ml 50% hematokrit (~ 250 μl pakket erytrocytter) i mikrocentrifugerør. Sentrifuger erytrocytter (750 xg, 5 min) og kast supernatanten.
    2. Tilsett 200 μl 40% 1x PBS til pelleterte erytrocytter, bland godt og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter. Tilsett 100 μL ICG (1,5 mg / ml) til erytrocyt-suspensjonen, bland forsiktig ved å invertere røret og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter. Tilsett 300 μl 1x PBS og inkuber på37 ° C i en shaker-inkubator i 60 minutter.
    3. Sentrifuger bærer erythrocytter (750 xg, 3 min) og resuspender i 1 ml 1x PBS.
    4. Vask cellene ~ 3 - 5 ganger med 1x PBS til supernatanten er klar (trinn 1.3.3). Etter den siste vasken dekanterer supernatanten og tilsetter 1% BSA PBS (1: 1) til de merkede pre-swelled erythrocytter for å oppnå en 50% hematokrit (1,25 x 108 celler / ml) ICG-merkede erytrocytter.
  4. Natriumfluorescein (1%) merking av leukocytter
    1. Etter separering av buffy-kappen fra blodet ved bruk av tetthetgradient sentrifugering (fra trinn 1.2.6), vask cellene en gang med 10 ml 1x PBS ved sentrifugering ved 450 xg i 10 minutter for å fjerne eventuelle forurensninger. Resuspender pelleten i 900 μl 1x PBS.
    2. Tilsett 100 μl 10% natriumfluorescein til 900 μl av leukocyt-suspensjonen og inkuber ved romtemperatur i 2 minutter. Vask de merkede celler tre ganger med 10 ml 1X PBS ved sentrifugiNg (450 xg, 10 min). Resuspender cellene i 100 μl 1x PBS.

2. Levende bildebehandling av fluorescensmerkede celler

  1. Live-cell bildebehandling av ICG merket erytrocytter
    1. For å forberede celler til injeksjon via halevein eller retro-orbitale rute, fortynne 50% hematokriten av ICG-merkede erytrocytter med 10 ganger og 50 ganger med 1x PBS for å lage henholdsvis 5% og 1% hematokritceller.
    2. Plasser musen under infrarødt lys (250W intensitet) i 5 minutter for å la halevenen dilate. Bedøv musen med ketaminhydroklorid (50 mg / kg) og xylazinhydroklorid (0,5 mg / kg) gjennom intraperitoneal injeksjon (her, i henhold til skjema 1, under ARVO retningslinjer).
    3. Fortynn hver elev av øynene med en dråpe på 0,5% tropicamid og 2,5% fenylefrinhydroklorid.
    4. Plasser kontaktlinsen over ett øye for avbildning. Bruk oftalmisk gel som medium for avbildning og for å forhindre tørrhetS av hornhinnen. Fest det konfokale laserscanning oftalmopopi-kameraet (SLO) med en 25 diopterlins for å kompensere for brytningen av musøyet.
    5. Plasser musen på SLO-bildeplattformen. Sørg for at hornhinnen på musen vender rett mot det optiske hodet til SLO-maskinen.
    6. Slå på bildebehandlingsmodulen. Bruk den tilhørende bildebehandlingsmodulprogramvaren, klikk på "Ny pasient" -knappen og legg til dyreidentifikasjonsdetaljer som øremerket for mus, fødselsdato, prosentandel av fluorescerende fargestoff og merket celletype.
      1. Plasser den optiske nerveen til dyret i midten av bildeskjermen ved å manøvrere bildemodulen. Bruk den tilhørende bildebehandlingsmodulen, klikk på "Acquire" -knappen for å ta inn infrarøde (IR) fundusbildene med 30 ° eller 15 ° vinkelvisning. Sørg for at midten av netthinnen, eleven og den optiske banen til laseren er justert for å oppnå et best mulig kvalitetsbilde.
    7. Ta ICG fundusvideoen.
      1. Slå på ICG-filteret (790 nm), sett kameraet til høyhastighetsmodus med 30 ° eller 15 ° vinkelvisning og sett ICG-intensiteten til 85 for alle målinger for standardisering. På kontrollpanelet klikker du på "Acquire" knappen for å ta videoen (baseline kontroll) ved 8,8 / 15 bilder / s i 1 min.
    8. Last 100 μL ICG merket erytrocytter i en insulinsprøyte festet til en 30 gauge nål.
      1. For injeksjon via haleveinruten, sett nålkanten opp i halevenen. Bekreft intravenøs tilgang ved å sjekke tilbakestrømningen av blodet i sprøyten og injiser de merkede cellene i sirkulasjonen.
      2. For injeksjon via den retro-orbitale ruten, sett nålen ved siden av øyet inn i retro-baneområdete. Bekreft retro-orbitaltilgang ved å sjekke tilbakestrømningen av blodet i sprøyten og injiser de merkede cellene i sirkulasjonen.
    9. Etter injeksjonen, plasser musen og ta IR fundus-bildene (se trinn 2.1.6.1) og video ved hjelp av ICG-filteret (se trinn 2.1.7.1). De merkede cellene i retinalsirkulasjonen kan visualiseres umiddelbart etter injeksjon av cellene.
    10. Etter at du har kjøpt videorammer, trekker du ut .tiff-bilder av videosekvensene ved å velge .tiff-formatet når du eksporterer videoen ved hjelp av SLO-visningsmodulprogramvaren. Lagre filene i en ønsket mappe.
    11. Fjern kontaktlinsen, legg den over det andre øyet, og fullfør bildet som beskrevet i trinn 2.1.4 - 2.1.7.
    12. Etter bildebehandling, legg det bedøvede dyret under infrarødt lys (250W) for å opprettholde kroppstemperaturen til den gjenoppretter fra anestesi. Når dyret er fullstendig gjenopprettet, legg musen tilbake i holderen.
  2. Levende cellebilder av 1% natriumfluorescein-merkede leukocytter
    1. Klargjør musen og sett opp instrumentet som beskrevet i avsnitt 2.1.
    2. Plasser musen og ta IR fundus-bildene som beskrevet i trinn 2.1.4 - 2.1.6.
      1. Hent fluorescein-angiogrammet til musen ved hjelp av fluoresceinfilteret (488 nm) med høyhastighets kameramodus med 30 ° eller 15 ° vinkel og fluoresceinintensitet ved 85 for alle målinger for standardisering. Ta opp videoen (baseline kontroll) ved 8,8 / 15 bilder / s (se trinn 2.1.7.1).
        MERK: Her ble flere spor av videoer (1 min videoer) anskaffet ved forskjellige tidsintervaller.
    3. Injiser 100 μl merkede leukocytter i musen gjennom halevenen eller retro-baneinjeksjonen som beskrevet i avsnitt 2.1.8.
    4. Umiddelbart etter injeksjonen, plasser musen og ta IR fundus bildene (se trinn 2.1.5 og 2.1.6) og fluoenRescein angiogram av musen (se avsnitt 2.2.2).
    5. Vær oppmerksom på de merkede cellene i retina eller choroidale blodårer ved å justere fokuseringspunktet til skannelaseren ved å dreie fokuseringsknappen på bildemodulen.
    6. Skaff videoklippene og bildene ved hjelp av SLO-visningsmodulprogramvaren (se trinn 2.1.10) og lagre den i en ønsket mappe.
    7. Etter prosedyren, følg trinn 2.1.12 for omsorg for dyr.
  3. Bildeanalyse av MtrackJ-programvare
    1. Åpne bildesekvensen i ImageJ ved å klikke på "File". Velg "Import" og velg "Bilde sekvens", velg ønsket bildemappe, og klikk "Åpne". Et popup-vindu som heter "Sequence Options" vises på skjermen. Klikk "Ok"; Bilde sekvensen åpnes.
    2. Sett rammeintervallet for bildevideoen ved å klikke på "Bilde" og velg "Egenskaper" for hastighetsmålinger. Her er det 8,8 frames / s.
    3. Åpne MTrackJ-pluginet ved å velge "Plugins". Velg "Sporing" og velg deretter "MtrackJ". En meny skal vises.
    4. For å justere sporingsinnstillingene, velg "Sporing" (under menyen) og merk av i boksen "Flytt til neste tidsrammeindeks etter tilføyelse av punkt".
    5. Spor den første cellen.
      1. Finn en celle og spor den samme cellen i etterfølgende rammer. På menyen klikk "Legg til" for å legge til et nytt spor.
      2. Hold markøren over bildet (+ tegn) og klikk på den aktuelle cellen.
        MERK: MTrackJ hopper automatisk til neste tidsramme og legger til en liten sirkel, som markerer posisjonen til det første punktet i banen.
      3. Fortsett å klikke på den nåværende posisjonen til cellen mens du beveger deg gjennom rammene i bildesekvensen.
        MERK: Sirklene som markerer de forrige punktene i banen, av og til, forstyrrer evnen til å vise gjeldende plassering. Hvis dette skjer,Fortsett til trinn 2.3.5.3.1.
        1. Endre visningsalternativet for banen ved å klikke på "Vise" i menyen og velge alternativet "bare vise sporpunkter i gjeldende tid". Hvis du vil se alle banene, fjerner du dette alternativet.
      4. Fortsett å klikke til bane av den første cellen er sett. Lagre sporet ved å klikke på "Lagre".
    6. Spor den andre cellen.
      1. I menyen, klikk "Legg til" for å starte et nytt spor. Gjenta trinn 2.3.5.1 - 2.3.5.4 for å spore den nye cellen. Klikk på "Lagre" for å lagre det andre sporet.
      2. Fortsett disse trinnene for alle observerbare sporbare celler. Etter å ha sporet cellene, klikk på "Mål" og "OK" i menyfanen for å få resultatene.
        MERK: Et resultatvindu åpnes automatisk, som kan lagres og åpnes i et regneark for videre analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Erytrocyter merket med 1,5% ICG ble visualisert i retinal sirkulasjon av C57BL / 6J mus (villtype). Både 1% og 5% hematokrit av 1,5% ICG-merket erythrocytter ble skilt i retinal sirkulasjon. De individuelle merkede cellene ble imidlertid tydeligere visualisert med 1% hematokrit av 1,5% ICG-merkede erytrocytter ( Figur 1 ). I 5% hematokrit, på grunn av det store antall merkede celler i retinale kar, var det ikke mulig å markere den enkelte celle. Enkelte erytrostaser ble observert i peripapillærområdet under begge forhold, men det var mer fremtredende i 5% hematokriten av merkede erytrocytter ( figur 2 ).

Leukocytter ble vellykket merket med 1% natriumfluorescein etter ovennevnte protokoll og ble visualisert som grønne merkede celler ved bruk av fluorescerende mikroskopi ( Klasse = "xfig"> Figur 3). Små klumper av celler (4 - 5 celler sammen) ble også observert i merkede prøver. Når cellene ble injisert i musesirkulasjonen, ble merkede leukocytter visualisert i retinalsirkulasjonen ( Figur 4 ). Etter merkingen ble begge erytrocyter og leukocytter umiddelbart injisert i musene og visualisert ved 30 og 60 min tidsintervaller. Fluorescensmerkede celler ble observert umiddelbart etter injeksjonen, men fluorescensintensiteten ble gradvis redusert ved 30 og 60 min tidsintervaller. Vi brukte også leukocyttfargingsprotokollen (1% natriumfluorescein) på erytrocytene og observerte ingen merking av erytrocytene. Ved å bruke Mtrack J-pluginet på Image J-programvaren, ble cellene sporet i retinalsirkulasjonen ( figur 5 ).

95 / 55495fig1.jpg "/>
Figur 1 : 1% hematokrit av 1,5% ICG-merkede erytrocytter i retinalsirkulasjonen. ICG merket individuelle erythrocytter som viser lyse signaler i retinalfartøyene. Enkelte erytrostaser ble observert i peripapillærområdet. Skala = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2 : 5% hematokrit av 1,5% ICG-merket erytrocytter i retinal sirkulasjon. Mange ICG-merkede erytrocyter viser lyse signaler i retinalfartøyene; En stor mengde erytrostase ble observert i peripapillærområdet. Skala = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3 : Fluorescensmikroskopi av 1% natriumfluoresceinmerkede leukocytter. Natriumfluorescein-merkede leukocytter som viser grønne fluorescerende signaler med små klumper (20X forstørrelse, skala = 50 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4 : 1% natriumfluoresceinmerkede leukocytter i retinal sirkulasjon. Natriumfluorescein-merket leukocyt (pil) viser lyst signal i retinalfartøyene. Skala = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5 : Sporing av merkede individuelle celler i retinal sirkulasjon ved hjelp av Image Analysis-programvare. Ulike spor (fargede sirkler og linjer som representert på bildet) ble målt for å beregne gjennomsnittshastigheten til de merkede cellene i retinalsirkulasjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Å studere hemodynamikken i retinal og choroidal sirkulasjon er viktig for å forstå patofysiologien til mange okulære sykdommer. Blodstrømningsdynamikken i retinalsirkulasjonen kan studeres ved hjelp av Fourier-domene optisk koherens tomografi (FD-OCT), laserspjeld flowgraphy (LSFG) og retinaloksymetri. Selv om disse metodene bruker forskjellige tilnærminger for å studere total blodstrøm i retinalsirkulasjonen 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 , deler de begrensningen av manglende evne til å studere strømningsdynamikken til de enkelte celletyper. Næringsstoffene og oksygenforsyningen til retinale og koroidale vev, samt migrasjon av immunceller i okulære inflammatoriske sykdommer og deres rolle i sykdomspatogenesen, kan studeres ved å undersøke strømningsdynamikken til degYthrocytter og leukocytter i henholdsvis retinal og choroid sirkulasjon. Merkingsteknikker kombinert med bildefremgangsmåter vil bidra til å spore de merkede cellene i sirkulasjonen og å studere strømningsdynamikken til de merkede cellene. Flere fluorescerende fargestoffer ble vellykket anvendt for å merke leukocytter og erytrocyter for undersøkelse av deres strømningsdynamikk i sirkulasjonen 3 , 17 , 18 , 19 .

Her rapporterer vi anvendelsen av godkjente, ikke-toksiske fluorescerende fargestoffer, indokyaningrønn og natriumfluorescein, for merking og visualisering av erytrocytter og leukocytter i henholdsvis retinal sirkulasjon. Selv om natriumfluorescein er det mest brukte fargestoffet for å spore leukocytene 31 , 32 , 33 34 , er fordelene ved samtidig merking av erythrocytter og leukocytter med ICG og natriumfluorescein henholdsvis effektiv visualisering av merkede celler samtidig i dyrets øye ved å endre filtrene i SLO. SLO er en ikke-invasiv metode for retinal bildebehandling som i stor grad brukes i studien av patologiske endringer i ulike retinale sykdommer hos mennesker og dyr. Det kan også bidra til å sammenligne retinalendringer som svar på en gitt behandling 46 .

For å oppnå kvalitetsbilder i SLO, må elevene være fullt utvidd og kontaktlinsen må brukes med oftalmisk gel for å opprettholde en fuktig hornhinne og forhindre dannelse av gråstråler. Stillingen av øynene og den optiske banen til kameraet må være rett for å oppnå kvalitet fundus og angiogrambilder. Dyret bør være dypt beroliget for å minimalisere bevegelsen under avbildningen. Selv om både 1% og 5% hematokrit av 1,5% ICGMerkede erytrocytter viste visualisering av fluorescensmerkede celler i retinalsirkulasjonen, 1% hematokrit var bedre egnet for overvåking av de enkelte cellene. Fluorescensmerkede celler kan ikke visualiseres dersom antallet injiserte leukocytter er for lavt. Derfor, for å oppnå bedre resultater ved å overvåke de merkede cellene i retinalsirkulasjonen, anbefales det å samle leukocytter fra minst 4 mus, merker med 1% natriumfluorescein og injiseres i en enkelt mus. Selv om det finnes noen alternative fargestoffer for natriumfluorescein (Calcein, FITC, DIO, FDA og CFDA med absorpsjons- / utslippsmaxima lik eller nær natriumfluorescein), må fargestoffet og giftighet for okularvev evalueres 9 , 12 , 13 , 14 , 17 .

Begrensningen av den rapporterte teknikken erFading av det fluorescerende signalet i omløp etter 60 minutter. Derfor må strømningsdynamikken til de merkede cellene analyseres innen 60 minutter. Her, for å merke leukocytter, ble blod trukket fra en mus, celler ble isolert, merket, injisert i en annen mus og visualisert av SLO. Imidlertid i SLO ble bare 0-1 celle per ramme observert i retinale blodkar. Dette kan skyldes utilstrekkelig leukocyttcelletall, og vi anbefaler derfor å samle blod fra minst 3 - 4 mus for å visualisere et høyere celle nummer per ramme. Kamerahastigheten på 8,8 bilder / s ble brukt i studien, men dette kunne økes for å oppnå mer sekvensielle bilder og videoer av de merkede cellene.

Tidligere studier rapporterte endringer i blodstrømningshastigheten i retinal sirkulasjon av diabetespasienter med forskjellige stadier av DR. Clermont et al. Rapporterte en 33% reduksjon av retinalblodstrømmen hos pasienter med tidlig stadium av DR 47 , og Nguyen etal. Rapporterte en økning i retinal blodstrøm hos diabetespasienter med proliferativ DR 48 . En redusert blodstrømshastighet ble også rapportert å være assosiert med progressiv glaukom 49 . I de nevnte studiene undersøkte forfatterne hele blodstrømningshastigheten i retinalsirkulasjonen. Ved å studere strømningshastighetene for hver celletype kan det gis informasjon om de cellulære samspillet i forskjellige sykdommer og på forskjellige stadier av sykdom og kan bidra til prognose. Her rapporterer vi en metode for å merke erythrocytter og leukocytter med henholdsvis ICG og natriumfluorescein og deres visualisering i retinal sirkulasjon; Denne metoden kan brukes på en hvilken som helst sykdomsmodell for in vivo studier.

Fremtidig forskning kan utnytte våre merketeknikker ved hjelp av SLO for å studere variasjonen i strømningsdynamikken til de merkede erytrocyter og leukocytter under ulike behandlingsbetingelserPå forskjellige stadier av sykdommen. Videre kan våre metoder bidra til å forstå rollen som erytrocytter og leukocytter i sykdomsfototyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre. Ingen økonomisk eller interessekonflikt.

Acknowledgments

Forskningsprosjektet ble finansiert under New Investigator grant fra National Medical Research Council (NMRC), Singapore. Teamet vil gjerne anerkjenne forskningsopplæringen til Dr. Agrawal ved Institute of Ophthalmology (IoO), University College London (UCL) under National Medical Research Council (NMRC) Overseas Research Training fellesskap fra november 2012 til oktober 2014 under mentorskap av prof. David Shima. Dr. Agrawal kjøpte konseptet og ferdighetene til å merke cellene og levende bildebehandling i Dr. Shimas laboratorium. Teamet vil dermed gjenkjenne veiledning og veiledning under treningssamfunnet fra prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh og Dr. Daiju Iwata.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
  2. Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23 (5), 975-987 (2013).
  3. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  4. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
  5. Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58 (3), 353-363 (2006).
  6. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366 (13), 1227-1239 (2012).
  7. Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
  8. Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, Blackwell Scientific Pubs. Oxford. (1978).
  9. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
  10. Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
  11. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  12. DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
  13. Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
  14. Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
  15. Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
  16. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
  17. Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
  18. Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
  19. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
  20. Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
  21. Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
  22. Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
  23. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  24. Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
  25. Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47 (6), 572-577 (2003).
  26. Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
  27. Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
  28. Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14 (7), 579-584 (1995).
  29. Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
  30. Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (10), 1879-1887 (1998).
  31. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235 (1), 27-31 (1997).
  32. Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29 (6), 374-380 (1997).
  33. Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
  34. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104 (10), 1670-1676 (1997).
  35. Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151 (5), 745-751 (2011).
  36. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
  37. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34 (34), 11504-11513 (2014).
  38. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
  39. Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (11), 2228-2233 (1996).
  40. Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93 (5), 634-637 (2009).
  41. Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17 (5), 4061-4073 (2009).
  42. Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1569-1574 (2015).
  43. Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88 (7), 723-729 (2010).
  44. Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11 (7), 0159650 (2016).
  45. Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93 (6), 439-445 (2015).
  46. Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49 (7), 1085-1096 (2004).
  47. Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124 (4), 433-446 (1997).
  48. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25 (2016).
  49. Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129 (6), 728-733 (2000).

Tags

Medisin utgave 125 indocyaningrønn natriumfluorescein erytrocytter leukocytter blodstrømdynamikk fluorescensmerkede blodceller
Fluorescerende fargemerking av erytrocytter og leukocytter for å studere strømdynamikken i musens retinalsirkulasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S.… More

Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter