Summary
안구 혈액 순환에서 표지 된 혈액 세포의 라이브 셀 이미징은 당뇨 망막 병증 및 연령 관련 황반변 성의 염증 및 허혈에 대한 정보를 제공 할 수있다. 망막 순환에서 혈액 세포를 표지하고 표지 된 세포를 영상화하는 프로토콜이 기술되어있다.
Abstract
망막 및 맥락막 혈류 역학은 녹내장, 당뇨병 성 망막증, 연령 관련 황반변 성 (AMD) 및 기타 안구 염증성 질환과 같은 다양한 안구 질환의 병태 생리 및 후유증에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 눈의 치료 반응을 모니터하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표지 세포의 살아있는 세포 이미징과 결합 혈액 세포의 적절한 라벨링, 망막과 맥락 순환에 흐름 역학의 조사 수 있습니다. 여기에서 마우스 적혈구 및 백혈구의 1.5 % indocyanine green (ICG) 및 1 % sodium fluorescein 표지의 표준화 된 프로토콜을 각각 설명합니다. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO)는 C57BL / 6J 마우스 (야생형)의 망막 순환에서 표지 된 세포를 시각화하기 위해 적용되었습니다. 두 방법 모두 생쥐 망막 순환에서 특이 적으로 형광 표지 된 세포를 보였다. 이러한 표지 방법은 다양한 안구 질환에서 더 넓은 적용 범위를 가질 수 있습니다모델.
Introduction
망막 및 맥락막 순환에서 혈구의 유동 역학을 연구하면 잠재적으로 시력이 위협되는 안구 질환 및 기타 안구 염증성 질환의 병인을 이해하는 것이 필수적입니다. 그러나 혈장 단백질에 형광 염료를 결합시키는 기존의 혈관 조영술은 적혈구 또는 백혈구의 동력학에 관한 정보를 제공하지 않습니다 1 . 적혈구 망막 혈류 역학은 망막에서의 대사 적으로 효율적인 순환과 다양한 염증 조건에서 세포 이동, 인식, 부착 및 파괴를 이해하기위한 백혈구 유동 역학을 연구하는데 중요합니다 2 . 다양한 세포 유형 3 의 동정과 특성 규명에 사용되는 몇 가지 형광 분자가 있습니다. 혈액 세포의 혈류 역학은 적절한 형광으로 염색하여 측정 할 수 있습니다염료 및 적절한 이미징 기술 적용 4 .
연령 관련 황반변 성 (AMD)과 당뇨 망막 병증 (DR)과 같은 안구 질환에서 염증 반응의 존재는 병변에 림프구가 축적되는 것을 의미합니다 5 , 6 . 조직에서 면역 세포를 추적하면 질병 발병 기전과 관련된 복잡한 사건을 이해하는 데 도움이됩니다. 51 Cr과 125 I와 같은 방사성 동위 원소는 초기 연구에서 세포 추적자로 사용되었다. 이 염료는 독성이 있고 세포 생존 능력에 영향을줍니다. 방사성 마커 3 H와 14 C는 낮은 방출 에너지로 인해 세포에 덜 독성이 있지만 시스템 7,8 에서 신호를 검출하기가 어렵습니다. 여러 가지 형광 염료가 잠재적 인 문제를 극복하기 위해 도입되었습니다.i 방사능 마커 및 형광 현미경 및 유동 세포 계측법을 사용하여 체외에서 림프구 이동 을 추적 9,10 . Hoechst 33342와 thiazole orange는 DNA 결합 형광 염료이며, 생체 내에서 림프구를 추적하는데 사용됩니다 . Hoechst 33342는 DNA의 AT가 풍부한 영역에 결합하고, 막 투과성이며, 2 ~ 4 일 동안 형광 시그널을 유지하며 9 , 10 소실에 내성입니다. Hoechst 33342와 thiazole orange의 단점은 림프구 증식의 억제 11 과 짧은 반감기 9 입니다.
(FDA), 2 ', 7'- 비스 - (2- 카르복시 에틸) -5- (및 -6) - 카르복시 플루 오레 신, 아세 톡시 메틸 에스테르 (BCECF-AM), 5- (및 -6) (CFDA) 및 5- (및 -6) - 카르복시 플루 오레 신 디 아세테이트 아세 톡시 메틸 에스테르 (CFDA-AM)림프구 이동 연구에 사용되는 세포질 형광 염료입니다. 그러나 FDA, CFDA 및 CFDA-AM은 세포 내 보유력이 낮습니다 9 . BCECF-AM은 증식 반응을 감소시키고 주 화성 및 과산화물 생산에 영향을 미친다. Calcein-AM은 형광 염료이며 단기 생체 내 림프구 이동 연구 에 유용합니다. 그것은 강한 형광 신호를 방출하고 대부분의 세포 기능을 방해하지 않으며 최대 3 일 동안 형광 신호를 유지합니다 12 , 13 . Fluorescein isothiocyanate (FITC)와 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE)는 공유 결합 형광 염료이며 림프구 이동 연구에 사용됩니다. FITC는 세포 생존 능력에 영향을 미치지 않으며 T 림프구보다 B 림프구에 더 강한 친 화성을 갖는다 14 , 15 9 , 16 시간 동안 생체 내에서 추적 할 수 있습니다. C18 DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 및 PKH26은 막 - 백혈구 및 적혈구를 표지하기 위해 사용되는 형광 친 지성 카보시 아닌 염료를 삽입한다. C18 Dil과 DiO는 세포막에 결합 될 때 더 높은 신호를 나타내며 상대적으로 독성이 없습니다 12 , 17 . PKH2, PKH3 및 PKH26로 표지 된 세포는 독성이 적은 18 , 19 , 20 , 21 , 22 의 형광 신호를 잘 유지합니다. 그러나, PKH2는 CD62L 발현을 감소시키고 ly를 감소시킨다 림프구 생존율 23 .
상기 언급 된 대부분의 연구는 림프계에서 림프구 이동 및 증식을 추적하고 비 안과 순환에서 표지 된 적혈구를 연구하기 위해 수행되었다. 안과 순환에서 혈액 세포를 연구하기위한 표지 기술을 적용한 연구는 거의 없습니다. 주사 레이저 안검 내시경 (SLO)의 적용은 안저 혈관 조영술 24에 의한 생체 내 망막 및 맥락막 순환 에서 표지 된 세포를 연구하는데 큰 이점이 있습니다. SLG 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 30에 의해 망막 순환에서 백혈구를 연구하는데 사용되는 ICG, 아 크리 딘 오렌지, FITC, 나트륨 플루오 레세 인 및 CFDA와 같은 여러 가지 형광 염료가있다 .class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . acridine 오렌지의 광 독성과 발암 성 26 , 27 , 세포 활동과 FITC의 간섭, 망막과 맥락막 혈관의 해상도를위한 혈관 내 조영제의 요구 사항은 생체 내 동물 실험 29 그들의 응용 프로그램을 제한합니다. Sodium fluorescein 및 ICG는 식품 의약품 안전청 (Food and Drug Administration)의 승인을 얻은 무독성이며 인체 검사시 안전합니다 32 , 35 . 유동 역학 연구의 대부분은 백혈구 또는 적혈구의 표지 및 망막 및 맥락막 혈관에서의 시각화와 관련이있다 36 , 37 , 38 , 39
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Protocol
이 연구에 사용 된 동물 프로토콜은 싱가포르 싱가포르 SingHealth의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 얻었으며 안과 / 안과 분야에서의 동물 사용을위한 안과 / 안과 연구 협회 (ARVO)의 성명서 연구.
1. 형광 염료를 이용한 적혈구 및 백혈구의 표지
- 시약 준비
- 멸균 된 증류수 1800 μL에 ICG 3 mg을 녹여 ICG (1.5 mg / mL)를 준비하십시오. 10x 인산 완충 식염수 (PBS) 200 μL를 추가합니다.
- 멸균 증류수 6 ML에 1X PBS 4 ML을 추가하여 40 % 1X PBS를 준비합니다. 1x PBS 10 ML에 BSA 100 MG를 추가하여 PBS에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 준비합니다. BSA가 녹을 때까지 잘 섞는다.
- 밀도 구배 원심 분리를 이용한 적혈구 및 백혈구 분리
- 생쥐 마취 (야생 타이(ARVO 지침에 따라 스케쥴 1에 따라) 케타민 하이드로 클로라이드 (50mg / kg)와 크 실라 진 하이드로 클로라이드 (0.5mg / kg)의 조합을 사용하여 투여 하였다 (C57BL / 6). 페달 철수 반사 ( 즉 , 발가락 핀치)로 마취를 확인하십시오.
- 29 게이지 바늘 (1 mL 주사기에 부착 됨)을 천천히 심장쪽으로 향하게하여 삽입하십시오. 바늘이 심장 안에 있는지 확인하려면 플런저를 약간 빼내고 혈액이 주사기 안으로 빠지는지 확인하십시오. 심장에서 0.8 - 1 mL의 피를 직접 뽑아냅니다.
- 즉시 혈액 수집 튜브가 들어있는 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (혈액 1.8 mL / mL)에 혈액을 옮기고 혈액 응고를 방지하기 위해 부드럽게 혼합하십시오.
- pentobarbital (80mg / kg)을 복강 내 주사하여 마우스를 안락사하십시오.
- 2 ML의 microcentrifuge 튜브와 centri에서 polysucrose과 나트륨 diatrizoate 솔루션 (1 : 1 비율, 밀도 1.077 g / ML)의 상단에 전혈을 계층화fuge (450 xg, 30 min)를 사용하여 혈장에서 백혈구와 적혈구를 분리시킵니다.
- 피펫을 사용하여 상등액 (플라스마)을 제거하고 버립니다. 조심스럽게 피펫을 사용하여 버피 코트 (백혈구)와 적혈구 (적혈구 층)를 새롭고 분리 된 튜브로 옮깁니다.
- 적혈구의 ICG (1.5 %) 표지
- 오염 물질을 제거하기 위해 1x PBS로 적혈구를 씻으십시오. 1x PBS (1 : 1)에 적혈구를 재 침투하여 50 % 헤마토크리트를 만듭니다. 50 % 헤마토크리트 0.5 mL (~ 250 μL 포장 된 적혈구)를 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 적혈구를 원심 분리하고 (750 xg, 5 분) 상등액을 버립니다.
- pelleted erythrocytes에 40 % 1x PBS 200 μL를 추가 잘 혼합하고 5 분 동안 실온에서 품어. 적혈구 현탁액에 ICG (1.5 MG / ML)의 100 μL를 추가 튜브 부드럽게 혼합하여 5 분 실온에서 품어. 1x PBS 300 μL를 첨가하고쉐이커 배양기에서 37 ℃로 60 분간 방치 하였다.
- 담체 적혈구 (750 xg, 3 분)를 원심 분리하고 1 ML 1X PBS에 resuspend.
- 상청액이 맑아 때까지 1x PBS로 세포 ~ 3 ~ 5 번 씻으십시오 (1.3.3 단계). 마지막 세척 후 상층 액을 버리고 ICG 표지 된 적혈구의 50 % 헤마토크리트 (1.25 x 10 8 세포 / mL)를 얻기 위해 1 % BSA PBS (1 : 1)를 표지 된 미리 부풀린 적혈구에 첨가한다.
- 백혈구의 나트륨 fluorescein (1 %) 표시
- 밀도 그라디언트 원심 분리 (단계 1.2.6에서)를 사용하여 혈액에서 버피 코트를 분리 후, 어떤 오염 물질을 제거하기 위해 10 분 동안 450xg에서 원심 분리하여 1x PBS 10 ML로 세포를 한 번 씻으십시오. 1x PBS 900 μL에 펠렛을 Resuspend.
- 백혈구 현탁액의 900 μL에 10 % 나트륨 fluorescein의 100 μL를 추가하고 2 분 동안 실온에서 품어. centrifugi하여 10 ML 1X PBS로 세 번 레이블 세포를 씻으십시오ng (450 xg, 10 분). 100 μL 1X PBS에 세포를 Resuspend.
2. 형광 라벨이 붙은 세포의 라이브 영상
- ICG 표지 된 적혈구의 라이브 셀 이미징
- 꼬리 정맥 또는 역 궤도 경로 를 통한 주사 용 세포를 준비하려면 ICG 표지 된 적혈구의 50 % 헤마토크리트를 1x PBS로 10 배 및 50 배 희석하여 각각 5 % 및 1 % 헤마토크리트 세포를 만듭니다.
- 꼬리 정맥이 팽창하도록 5 분 동안 적외선 (250W 강도) 아래에 마우스를 놓습니다. 마우스를 케타민 하이드로 클로라이드 (50mg / kg)와 크 실라 진 하이드로 클로라이드 (0.5mg / kg)로 복강 내 주사 (여기서는 스케줄 1에 따라 ARVO 지침에 따라)로 마취시킨다.
- 눈의 각 동공을 0.5 % 트로피 아미드와 2.5 % 페닐에 프린 하이드로 클로라이드 한 방울로 증량하십시오.
- 이미징을 위해 콘택트 렌즈를 한쪽 눈 위에 올려 놓습니다. 이미징을위한 매체로 안과 용 젤을 사용하고 건조를 방지하십시오.s의 각막. 마우스 눈의 굴절을 보상하기 위해 + 25 디옵터 렌즈가있는 공 촛점 레이저 스캐닝 검안경 (SLO) 카메라를 수정하십시오.
- 마우스를 SLO 이미징 플랫폼 위에 놓습니다. 마우스의 각막이 SLO 기계의 광학 헤드를 향해 직면하는지 확인하십시오.
- 이미징 모듈을 켭니다. 관련 이미징 모듈 소프트웨어를 사용하여 "New Patient"버튼을 클릭하고 마우스 귀 태그 번호, 생년월일, 형광 염료의 백분율 및 분류 된 세포 유형과 같은 동물 식별 정보를 추가하십시오.
- 이미징 모듈을 조작하여 동물의 시신경을 이미징 스크린의 중앙에 배치합니다. 관련 이미징 모듈 소프트웨어를 사용하여 "Acquire"버튼을 클릭하여 30 ° 또는 15 ° 앵글 뷰 설정으로 적외선 (IR) 안저 이미지를 가져옵니다. 망막의 중심, 동공 및 레이저의 광학 경로가 최상의 품질의 이미지를 얻기 위해 정렬되어 있는지 확인하십시오.
- 이미징 모듈을 조작하여 동물의 시신경을 이미징 스크린의 중앙에 배치합니다. 관련 이미징 모듈 소프트웨어를 사용하여 "Acquire"버튼을 클릭하여 30 ° 또는 15 ° 앵글 뷰 설정으로 적외선 (IR) 안저 이미지를 가져옵니다. 망막의 중심, 동공 및 레이저의 광학 경로가 최상의 품질의 이미지를 얻기 위해 정렬되어 있는지 확인하십시오.
- ICG 안저 영상을 가져 가라.
- ICG 필터 (790 nm)를 켜고 30 ° 또는 15 ° 각도로 카메라를 고속 모드로 설정하고 표준화를위한 모든 판독 값에 대해 ICG 밝기를 85로 설정하십시오. 제어판에서 "Acquire"버튼을 클릭하여 1 분 동안 8.8 / 15 프레임 / 초로 비디오 (기본 제어)를 촬영하십시오.
- 30 게이지 바늘에 부착 된 인슐린 주사기에 ICG로 표지 된 적혈구 100 μL를 넣으십시오.
- 꼬리 정맥 경로 를 통한 주사의 경우, 바늘 베벨을 꼬리 정맥에 삽입하십시오. 혈액이 주사기로 역류되었는지 확인하여 정맥 내 접근을 확인하고 혈액 순환 세포에 표식 세포를 주입하십시오.
- retro-orbital 경로를 통한 주입의 경우, 눈에 인접한 바늘을 retro-orbital spac이자형. 주사기에 혈액의 역류를 확인하여 retro - orbital 액세스를 확인하고 순환에 라벨 세포를 주입.
- 주입 후 마우스를 재배치하고 IR 안저 영상 (단계 2.1.6.1 참조) 및 비디오를 ICG 필터 (단계 2.1.7.1 참조)로 가져옵니다. 망막 순환에서 라벨 세포는 세포 주입 직후 시각 수 있습니다.
- 비디오 프레임을 획득 한 후 SLO보기 모듈 소프트웨어를 사용하여 비디오를 내보낼 때 .tiff 형식을 선택하여 비디오 시퀀스의 .tiff 이미지를 추출하십시오. 원하는 폴더에 파일을 저장하십시오.
- 콘택트 렌즈를 꺼내 다른 눈 위에 올려 놓고 2.1.4 - 2.1.7 단계에 설명 된대로 이미징을 완료하십시오.
- 이미징 후 마취에서 회복 될 때까지 체온을 유지하기 위해 마취 동물을 적외선 (250W) 아래에 두십시오. 동물이 완전히 회복되면 마우스를 다시 새장에 넣으십시오.
- 1 % sodium fluorescein으로 표지 된 백혈구의 라이브 셀 이미징
- 마우스를 준비하고 2.1 절의 설명에 따라 장비를 설정하십시오.
- 단계 2.1.4 - 2.1.6에서 설명한대로 마우스를 위치시키고 IR 안저 사진을 찍습니다.
- 표준화를 위해 모든 판독 값에 대해 30 ° 또는 15 ° 각도보기 및 85에서의 형광 강도를 갖는 고속 카메라 모드의 형광 물질 필터 (488 nm)를 사용하여 마우스의 형광 안저 혈관 조영상을 얻습니다. 8.8 / 15 프레임 / 초 (기준 2.1.7.1 참조)에 비디오 (기준선 제어)를 기록하십시오.
참고 : 여기서 여러 비디오 트랙 (1 분 비디오)이 서로 다른 시간 간격으로 획득되었습니다.
- 표준화를 위해 모든 판독 값에 대해 30 ° 또는 15 ° 각도보기 및 85에서의 형광 강도를 갖는 고속 카메라 모드의 형광 물질 필터 (488 nm)를 사용하여 마우스의 형광 안저 혈관 조영상을 얻습니다. 8.8 / 15 프레임 / 초 (기준 2.1.7.1 참조)에 비디오 (기준선 제어)를 기록하십시오.
- 2.1.8 절에서 설명한대로 꼬리 정맥 또는 역 궤도 주사를 통해 마우스에 100 μL 표지 백혈구를 주사하십시오.
- 주사 직후에 마우스를 위치시키고 IR 안저 영상 (단계 2.1.5 및 2.1.6 참조)과 fluo마우스의 혈관 조영술 재개 (2.2.2 절 참조).
- 이미징 모듈의 초점 노브를 돌려 스캐닝 레이저의 초점을 조정하여 망막 또는 맥락막 혈관의 표시된 세포를 관찰합니다.
- SLO보기 모듈 소프트웨어 (단계 2.1.10 참조)를 사용하여 비디오 프레임과 이미지를 가져 와서 원하는 폴더에 저장하십시오.
- 절차가 끝나면 동물 관리를 위해 2.1.12 단계를 수행하십시오.
- MtrackJ 소프트웨어로 이미지 분석
- "파일"을 클릭하여 ImageJ에서 이미지 시퀀스를 엽니 다. "가져 오기"를 선택하고 "이미지 시퀀스"를 선택하고 원하는 이미지 폴더를 선택한 다음 "열기"를 클릭하십시오. "시퀀스 옵션"팝업 창이 화면에 나타납니다. "확인"을 클릭하십시오; 이미지 시퀀스가 열립니다.
- "이미지"를 클릭하고 속도 측정을 위해 "속성"을 선택하여 이미지 비디오의 프레임 간격을 설정하십시오. 여기, 8.8 프레임es / s.
- "Plugins"을 선택하여 MTrackJ 플러그인을여십시오. "Tracking"을 선택하고 "MtrackJ"를 선택하십시오. 메뉴가 나타납니다.
- 추적 설정을 조정하려면 메뉴 아래의 "추적"을 선택하고 "점 추가 후 다음 시간 프레임 색인으로 이동"확인란을 선택하십시오.
- 첫 번째 셀을 추적하십시오.
- 하나의 셀을 찾고 후속 프레임에서 동일한 셀을 추적하십시오. 메뉴에서 "추가"를 클릭하여 새 트랙을 추가하십시오.
- 이미지 위에 커서를 놓고 (+ 기호) 적절한 셀을 클릭하십시오.
참고 : MTrackJ는 자동으로 다음 시간 프레임으로 이동하고 궤도의 첫 번째 점의 위치를 표시하는 작은 원을 추가합니다. - 이미지 시퀀스의 프레임을 이동하면서 셀의 현재 위치를 계속 클릭합니다.
참고 : 때때로 궤도의 이전 점을 표시하는 원이 현재 위치를 보는 기능을 방해합니다. 이 경우,단계 2.3.5.3.1로 진행하십시오.- 메뉴에서 "표시"를 클릭하고 "현재 트랙 포인트 만 표시"옵션을 선택하여 궤적의 표시 옵션을 변경하십시오. 모든 궤도를 보려면이 옵션의 선택을 취소하십시오.
- 첫 번째 셀의 궤도가 보일 때까지 계속 클릭하십시오. 그런 다음 "저장"을 클릭하여 트랙을 저장하십시오.
- 두 번째 셀을 추적하십시오.
- 메뉴에서 "추가"를 클릭하여 새 트랙을 시작하십시오. 새 셀을 추적하려면 2.3.5.1 - 2.3.5.4 단계를 반복하십시오. 두 번째 트랙을 저장하려면 "저장"을 클릭하십시오.
- 관찰 된 모든 추적 가능한 셀에 대해이 단계를 계속하십시오. 셀을 추적 한 후 메뉴 탭에서 "측정"및 "확인"을 클릭하여 결과를 가져옵니다.
참고 : 결과 창은 자동으로 열리 며 추후 분석을 위해 스프레드 시트에 저장하고 열 수 있습니다.
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Representative Results
1.5 % ICG로 표지 된 적혈구를 C57BL / 6J 마우스 (야생형)의 망막 순환에서 시각화 하였다. 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 1 % 및 5 % 헤마토크릿 모두 망막 순환에서 구별 할 수 있었다. 그러나 개별 표식 된 세포는 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 1 % 헤마토크리트로 더 명확하게 시각화되었습니다 ( 그림 1 ). 5 % 헤마토크리트에서 망막 혈관의 많은 수의 표식 세포로 인해 개별 세포를 표시 할 수 없었습니다. 두 조건 모두에서 약간의 erythrostasis가 peripapillary region에서 관찰되었지만, 표지 된 적혈구의 5 % 적혈구 용적률에서 더 두드러졌다 ( 그림 2 ).
백혈구는 상기 프로토콜에 따라 1 % 나트륨 플루오 레세 인으로 성공적으로 표지되고 형광 현미경을 사용하여 녹색 표지화 된 세포로서 시각화된다 (
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그림 1 : 망막 순환에서 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 1 % 헤마토크릿. ICG는 망막 혈관에 밝은 신호를 나타내는 개별 적혈구를 표시했다. 일부 적혈구 증이 유두 주위 부위에서 관찰되었습니다. 스케일 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 망막 순환에서 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 5 % 적혈구 용적. 망막 혈관에 밝은 신호를 나타내는 많은 ICG 표지 된 적혈구; 유두 주위 영역에서 많은 양의 적혈구 증이 관찰되었다. 스케일 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 1 % 나트륨 Fluorescein 표지 백혈구의 형광 현미경 이미지. 작은 덩어리 (20X 배율, 크기 = 50 μm)가있는 녹색 형광 신호를 나타내는 나트륨 플루오르세틴 표지 백혈구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 망막 순환에서 1 % 나트륨 플루 오레 신 라벨 백혈구. 망막 혈관에 밝은 신호를 나타내는 나트륨 fluorescein 백혈구 (화살표). 스케일 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 망막 순환에서 라벨이있는 개별 세포의 추적. 망막 순환에서 표지 된 세포의 평균 속도를 계산하기 위해 다른 트랙 (이미지 상에 표시된 것과 같은 색의 원 및 선)을 측정 하였다.
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Discussion
망막 및 맥락막 순환에서 혈류 역학을 연구하는 것은 많은 안구 질환의 병리 생리학을 이해하는 데 중요합니다. 망막 순환에서의 혈류 역학은 Fourier-domain optical coherence tomography (FD-OCT), laser speckle flowgraphy (LSFG) 및 망막 산소 측정법에 의해 연구 될 수있다. 이 방법은 망막 순환에서 총 혈류를 연구하기 위해 다른 접근법을 사용하지만 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 개별 세포 유형의 유동 역학을 연구 할 수 없다는 한계가 있습니다. 망막과 맥락막 조직에 영양분과 산소 공급뿐만 아니라 안구 염증성 질환에서 면역 세포의 이동과 질병 발병 기전에서의 역할은 연구팀의 흐름 역학을 조사함으로써 연구 할 수있다망막 및 맥락막 순환에서의 적혈구 및 백혈구 이미징 방법과 결합 된 표지 기술은 혈액 순환에서 표지 된 세포를 추적하고 표지 된 세포의 유동 역학을 연구하는 데 도움이 될 것입니다. 백혈구 및 적혈구에 3 , 17 , 18 , 19 순환계의 유동 역학 조사를 위해 여러 가지 형광 염료가 성공적으로 적용되었습니다.
여기서는 식품 의약품 안전청에서 승인 한 무독성 형광 염료 인 indocyanine green과 sodium fluorescein을 망막 순환에서의 적혈구 및 백혈구의 표시 및 시각화에 대해보고합니다. 나트륨 fluorescein은 백혈구를 추적하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 염료입니다 31 , 32 , 33 SLO에서 우수한 이미지를 얻기 위해서는 눈꺼풀이 완전히 팽창되어야하고 콘택트 렌즈가 안과 용 젤과 함께 사용되어 축축한 각막을 유지하고 백내장 형성을 예방해야합니다. 안구의 위치와 카메라의 광학 경로는 고화질의 안저 및 혈관 조영상을 얻기 위해 직선이어야합니다. 이미징하는 동안 움직임을 최소화하기 위해 동물을 깊이 진정시켜야합니다. 1.5 % ICG의 1 % 및 5 % 헤마토크리트 모두표지 된 적혈구는 망막 순환에서 형광으로 표지 된 세포의 시각화를 보여 주었으며, 1 % 헤마토크리트는 개별 세포를 모니터링하는 데 더 적합했다. 주입 된 백혈구의 수가 너무 적 으면 형광으로 표지 된 세포를 시각화 할 수 없습니다. 따라서 망막 순환계에서 표식 세포를 모니터링하는 데 더 나은 결과를 얻으려면 적어도 4 마리의 마우스에서 백혈구를 수집하고 1 % 나트륨 플루 오레 신으로 라벨을 붙이고 단일 마우스에 주사하는 것이 좋습니다. 나트륨 플루오 레세 인 (칼레 신, FITC, DIO, FDA 및 FDA 및 CFDA는 나트륨 플루오 레세 인과 유사하거나 그 근소치와 유사 함)에 대한 염료 유지율 및 안구 조직에 대한 독성은 9 , 12 , 13 , 14 , 17 . 보고 된 기술의 한계는60 분 후에 순환하는 형광 신호의 페이딩 따라서, 라벨 세포의 흐름 역학은 60 분 이내에 분석해야합니다. 여기에서 백혈구를 표지하기 위해 한 마우스에서 혈액을 빼내고 세포를 분리하고 라벨을 붙이고 다른 마우스에 주입 한 다음 SLO에서 시각화했습니다. 그러나 SLO에서는 망막 혈관에서 1 프레임 당 0-1 세포 만 관찰되었습니다. 이것은 백혈구 세포 수가 불충분하여 발생할 수 있으므로 적어도 3 ~ 4 마리의 마우스에게서 혈액을 채취하여 프레임 당 더 높은 세포 수를 시각화하는 것이 좋습니다. 이 연구에서는 8.8 프레임 / 초의 카메라 속도가 사용되었지만이 방법을 사용하여 레이블이있는 셀의 연속적인 이미지와 비디오를 더 많이 얻을 수있었습니다. 이전 연구들은 DR의 다른 단계를 가진 당뇨병 환자의 망막 순환에서 혈류 속도의 변화를보고했다. Clermont et al. DR 47 의 초기 단계의 환자에서 망막 혈류가 33 % 감소했다고보고하고 Nguyen et.al. 증식 성 DR 48을 가진 당뇨병 환자에서 망막 혈류의 증가를보고했다. 감소 된 혈류 속도는 또한 진행성 녹내장 49 과 관련이 있다고보고되었다. 앞에서의 연구에서 저자들은 망막 순환에서 전체 혈류 속도를 조사했다. 각 세포 유형의 유속을 연구하면 여러 질병 및 질병의 여러 단계에서 세포 상호 작용에 대한 정보를 제공 할 수 있으며 예후를 도울 수 있습니다. 여기 적혈구 및 백혈구에 ICG 및 나트륨 플루오 레세 인을 라벨링하고 망막 순환에서 이들의 시각화 방법을보고한다. 이 방법은 생체 내 연구에 대한 모든 질병 모델에 적용 할 수 있습니다. 미래의 연구는 SLO를 사용하여 우리의 표지 기술을 활용하여 다른 약물 치료 조건 하에서 표지 된 적혈구 및 백혈구의 유동 역학 변화를 연구 할 수 있습니다이 질병의 여러 단계에서. 또한, 우리의 방법은 질병 표현형에서 적혈구 및 백혈구의 역할을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다. 재정적 또는 이해 상충은 없습니다.
Acknowledgments
이 연구 프로젝트는 싱가포르 국립 의료 연구 협의회 (National Medical Research Council, NMRC)의 New Investigator 기금으로 지원되었습니다. 연구팀은 2012 년 11 월부터 2012 년 10 월까지 National Medical Research Council (NMRC) 해외 연구 연수 펠로우 십을 통해 University University of London (UCL)의 안과 연구소 (IoO)에서 Agrawal 박사에게 제공 한 연구 훈련에 대해 감사를 표합니다. David Shima. Agrawal 박사는 시마 박사의 실험실에서 세포에 라벨을 붙이고 영상을 찍기위한 개념과 기술을 습득했습니다. 따라서 팀은 David Shima 교수, Kenith Meissner 박사, Peter Lundh 박사 및 Daiju Iwata 교수의 훈련 펠로우쉽 중 감독과지도를 인정하고자합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Shaker incubator | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10 G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |
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