Summary
הדמיה חיה של תאי הדם המסומנים במחזור העין יכולה לספק מידע על דלקת ואיסכמיה ברטינופתיה סוכרתית וניוון מקולרי הקשור לגיל. פרוטוקול לתווית תאי דם ותמונה תאים שכותרתו במחזור הרשתית מתואר.
Abstract
דינמיקה זרימת הדם של הרשתית והקורואידאלית עשויה לספק תובנה לגבי הפתופיזיולוגיה והשלכות של מחלות עיניים שונות, כגון גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) ותנועות דלקתיות אחרות. זה עשוי גם לעזור לפקח על התגובות הטיפוליות בעין. התיוג הנכון של תאי הדם, יחד עם הדמיה תא חי של תאים שכותרתו, מאפשר חקירה של דינמיקה הזרימה של הרשתית ואת זרימת הדם הצורואידית. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים סטנדרטית של 1.5% indocyanine ירוק (ICG) ו 1% תיוג פלואורסצין נתרן של עכברים אריתרוציטים ו leukocytes, בהתאמה. סריקה לייזר ophthalmoscopy (SLO) הוחל לדמיין את התאים שכותרתו במחזור הרשתית של עכברים C57BL / 6J (סוג בר). שתי השיטות הפגינו תאים שונים שכותרתו fluorescently במחזור הרשתית של העכבר. שיטות תיוג אלה יכולות להיות יישומים רחבים יותר במחלות עיניים שונותמודלים.
Introduction
לימוד דינמיקה הזרימה של תאי הדם במחזור הרשתית והקורואידית היא הכרחית להבנת הפתוגנזה של מחלות עיניים אפשריות המסתכנות בראייה ובעיות דלקתיות אחרות. עם זאת, טכניקות אנגיוגרפיה קונבנציונאלי, אשר כרוך מחייב של צבעים פלואורסצנטי חלבונים פלזמה, אינם מספקים כל מידע לגבי הדינמיקה של אריתרוציטים או לויקוציטים 1 . דינמיקה זרימת כדורית הדם החשמלית חשובים לחקר זרימת הדם ביעילות מטבולית ברשתית, ואת הדינמיקה זרימת לויקוציטים, להבנת נדידת תאים, הכרה, הדבקה והרס בתנאים דלקתיים שונים 2 . ישנן מספר מולקולות ניאון המשמשים זיהוי ואפיון של סוגי תאים שונים 3 . המודינמיקה של תאי הדם ניתן למדוד על ידי מכתים אותם עם fluores המתאיםCent צבע ויישום טכניקות הדמיה נאותה 4 .
נוכחות של תגובות דלקתיות במחלות תוך עינית כמו ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) ו רטינופתיה סוכרתית (DR) כרוך הצטברות של לימפוציטים באזור חולה 5 , 6 . מעקב אחר תאי החיסון ברקמות יכול לעזור להבין את האירועים המורכבים המעורבים במנגנון של מחלה פתוגנזה. איזוטופים רדיואקטיביים כמו 51 Cr ו 125 שימשו כמחקרי תאים במחקרים מוקדמים. צבעים אלה רעילים ומשפיעים על הכדאיות התא. למרות שהסמנים הרדיואקטיביים 3 H ו- 14 C פחות רעילים לתאים, בשל אנרגיית הפליטה התחתונה שלהם, קשה לזהות את האותות שלהם במערכת 7 , 8 . מספר צבעים fluorochrome הוכנסו כדי להתגבר על הבעיות הפוטנציאליות הקשורות wIth סמנים רדיואקטיביים ו לימפוציטים מסלול המעבר במבחנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי cytometry זרימה 9 , 10 . Hoechst 33342 ו thiazole כתום הם DNA צבע מחייב ניאון, אשר משמשים כדי לעקוב אחר לימפוציטים in vivo. Hoechst 33342 נקשר אזורים עשירים ב- DNA, הוא קרום חדיר, שומרת על אותות ניאון עבור 2 - 4 ימים והוא עמיד מרווה 9 , 10 . החסרונות של Hochcht 33342 וכתום thiazole הם עיכוב של התפשטות לימפוציטים 11 ואת מחצית חיים קצר, בהתאמה 9 .
Calcein-AM, פלואורסצין diacetate (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (ו- 6) - carboxyfluorescein, אצטוקסימטיל אסתר (BCECF-AM), 5- (ו -6) Carposyfluorescein diacetate (CFDA), ו 5- (ו -6) - carboxyfluorescein אצטט acetoxymethyl diacetate (CFDA-AM)הם הצבעים ניאון cytoplasmic המשמש ללימודי לימפוציטים הגירה. עם זאת, ה- FDA, CFDA ו CFDA-AM יש שמירה נמוכה יותר בתאים 9 . BCECF-AM מפחית את התגובה שגשוג משפיע על chemotaxis ו superoxide ייצור 9 , 12 . Calcein-AM הוא צבע פלואורסצנטי ושימושי לטווח קצר ללימודים לימפוציטים vivo vivo . הוא פולט אותות ניאון חזקים, אינו מפריע לרוב הפונקציות הסלולר ושומר על אותות ניאון עד 3 ימים 12 , 13 . פלואורסצין isothiocyanate (FITC) ו carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA-SE) הם צבעים קוולנטיים צימוד פלואורסצנטי, אשר משמשים ללימודים הגירה לימפוציטים. FITC מציג שום השפעה על הכדאיות התא ויש לו זיקה חזקה עם לימפוציטים B מאשר לימפוציטים 14 , 15 , in vivo במשך יותר מ 8 שבועות ועד 8 חטיבות תא 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate), פול קרל הוראן (PKH) 2, PKH3 ו- PKH26 הם קרום- הוספת צבעי lbophilic carbocyanine lipophilic המשמשים תווית leukocytes ו אריתרוציטים. C18 דיל ו DiO התערוכה אותות גבוהים יותר כאשר שולבו לתוך קרום התא הם יחסית לא רעילים 12 , 17 . PKH2, PKH3 ו PKH26 שכותרתו התאים שמירה טובה של אותות ניאון עם פחות רעילות 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . עם זאת, PKH2 למטה מסדיר את הביטוי CD62L ומקטין את ly 23 .
רוב המחקרים הנ"ל בוצעו למעקב אחר הגירה הלימפוציטים והתפשטות הלימפה וללמוד את אריתרוציטים שכותרתו במחזור הלא עיני. יש מעט מאוד מחקרים החלים את הטכניקות תיוג ללמוד את תאי הדם במחזור העין. יישום של סריקה לייזר ophthalmoscopy (SLO) יש יתרון גדול בלימוד התאים שכותרתו את זרימת הרשתית ואת choroidal in vivo על ידי אנגיוגרפיה פונדוס 24 . ישנם מספר צבעים פלורסנט, כגון ICG, כתום אקרידין, FITC, פלואורסצין נתרן, CFDA המשמשים ללמוד את הלייקוציטים של זרימת הרשתית על ידי SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . Phototoxicity ו מסרטן של כתום acridine 26 , 27 , הפרעה של FITC עם פעילות הסלולר, ואת הדרישה של סוכן ניגוד intravascular לפתרון של כלי הדם ברשתית הרשתית ו choroidal מגביל את היישום שלהם בניסויים בבעלי חיים vivo 29 . נתרן פלואורסצין ICG אינם רעילים, אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות, ובטוח לבדיקות על בני אדם 32 , 35 . רוב הזרימה הדינמית מחקרים קשורים תיוג של leukocytes או אריתרוציטים והדמיה שלה כלי הדם ברשתית הרשתית 36 , 37 , 38 , 39
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקולים של בעלי חיים המשמשים במחקר זה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת SingHealth, סינגפור והם בהתאם להנחיות של האגודה לחקר חזון ורפואת עיניים (ARVO) הצהרה לשימוש בבעלי חיים עיניים או חזון מחקר.
1. תיוג של Erythrocytes ו leukocytes עם צבעים ניאון
- הכנה של ריאגנטים
- הכן ICG (1.5 מ"ג / מ"ל) על ידי המסת 3 מ"ג ICG ב 1800 μL של מים מזוקקים מעוקרים. הוסף 200 μL של 10x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS).
- הכן 40% 1x PBS ידי הוספת 4 מ"ל של 1x PBS ל 6 מ"ל של מים מזוקקים מעוקרים. הכן 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ב PBS על ידי הוספת 100 מ"ג של BSA ל 10 מ"ל של 1x PBS. מערבבים היטב עד BSA הוא מומס.
- בידוד של אריתרוציטים ו leukocytes באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות
- להרדים את העכברים (פרוע tyPE C57BL / 6) באמצעות שילוב של קטמין הידרוכלוריד (50 מ"ג / ק"ג) ו xylazine hydrochloride (0.5 מ"ג / ק"ג) (על פי לוח זמנים 1, תחת הנחיות ARVO). אישור הרדמה על ידי רפלקס נסיגה רפלקס ( כלומר , קמצוץ הבוהן).
- לאט לאט להכניס את המחט 29 מד (מחובר מזרק 1 מ"ל) בזווית costal מכוונת כלפי הלב. כדי לאשר את המחט הוא בתוך הלב, למשוך את הבוכנה מעט לבדוק אם הדם הוא נסוג לתוך המזרק. Exsanguinate 0.8 - 1 מ"ל של דם ישירות מהלב.
- מיד להעביר את הדם לתוך ethylene diamine tetra חומצה אצטית (EDTA) (1.8 מ"ג / מ"ל של דם) המכיל צינור איסוף דם ומערבבים בעדינות כדי למנוע קרישה של הדם.
- להרדים את העכברים על ידי מתן pentobarbital (80 מ"ג / ק"ג) על ידי הזרקה intraperitoneal.
- שכבת הדם כולו על גבי פוליסוקרוז ונתרן פתרון diatrizoate (יחס 01: 1, צפיפות 1.077 גרם / מ"ל) בצינור microcentrifuge 2 מ"ל ו centriFuge (450 xg, 30 דקות) כדי לאפשר את ההפרדה של leukocytes ו אריתרוציטים מהפלזמה.
- הסר לבטל את supernatant (פלזמה) באמצעות פיפטה. בזהירות להעביר את המעיל באפי (leukocytes) ו אריתרוציטים (אדום תא דם שכבת) לתוך צינורות חדשים נפרדים באמצעות טפטפות.
- ICG (1.5%) תיוג של אריתרוציטים
- שטפו את אריתרוציטים עם 1x PBS להסיר כל מזהמים. Resuspend את אריתרוציטים 1x PBS (1: 1) לעשות 50% hematocrit. 0.5 מ"ל Aliquot של 50% hematocrit (~ 250 μL אריתיות ארז) לתוך צינורות microcentrifuge. צנטריפוגה אריתרוציטים (750 xg, 5 דקות) וזורקים supernatant.
- הוסף 200 μL של 40% 1x PBS ל אריתיות pelleted, לערבב היטב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הוסף 100 μL של ICG (1.5 מ"ג / מ"ל) ההשעיה אדומה, לערבב בעדינות על ידי הפיכת הצינור, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הוסף 300 μL של 1x PBS ו דגירה ב37 מעלות צלזיוס חממה שייקר במשך 60 דקות.
- צנטריפוגה אריתרוציטים המוביל (750 xg, 3 דקות) ו resuspend ב 1 מ"ל 1x PBS.
- שטפו את התאים ~ 3 - 5 פעמים עם 1x PBS עד supernatant ברור (שלב 1.3.3). לאחר לשטוף האחרון, לסלק את supernatant ולהוסיף 1% BSA PBS (1: 1) כדי שכותרתו מראש מסומנת אריתרוציטים כדי להשיג 50% hematocrit (1.25 x 10 8 תאים / מ"ל) של ICG שכותרתו אריתרוציטים.
- נתרן פלואורסצין (1%) תיוג של לויקוציטים
- לאחר הפרדת המעיל באפי מן הדם באמצעות צנטריפוגה שיפוע שיפוע (משלב 1.2.6), לשטוף את התאים פעם עם 10 מ"ל של 1x PBS על ידי צנטריפוגה ב XG 450 למשך 10 דקות כדי להסיר כל מזהמים. Resuspend גלולה ב 900 μL של 1x PBS.
- הוסף 100 μL של 10% נתרן פלואורסצין μL 900 ההשעיה של ליקוציט ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. לשטוף את התאים שכותרתו שלוש פעמים עם 10 מ"ל 1X PBS על ידי centrifugiNg (450 xg, 10 דקות). Resuspend התאים 100 μL 1x PBS.
2. Live הדמיה של תאים תווית fluorescently
- Live-cell הדמיה של ICG שכותרתו אריתרוציטים
- כדי להכין תאים להזרקת דרך וריד זנב או מסלול רטרו מסלולית, לדלל את 50% hematocrit של ארתרוציטים שכותרתו ICG ידי פי 10 ו -50 פי עם 1x PBS לעשות 5% ו 1% hematocrit תאים, בהתאמה.
- מניחים את העכבר תחת אור אינפרא אדום (עוצמת 250W) במשך 5 דקות לתת וריד הזנב להתרחב. להרדים את העכבר עם קטמין הידרוכלוריד (50 מ"ג / ק"ג) ו xylazine hydrochloride (0.5 מ"ג / ק"ג) באמצעות הזרקת intraperitoneal (כאן, על פי לוח זמנים 1, תחת הנחיות ARVO).
- להשמיד כל תלמיד של העיניים עם ירידה של 0.5% tropicamide ו 2.5% phenylephrine hydrochloride.
- מניחים את עדשת המגע מעל עין אחת עבור הדמיה. השתמש ג'ל עיניים כ מדיום עבור הדמיה כדי למנוע drynesS של הקרנית. תקן את לייזר confocal סריקה ophthalmoscopy (SLO) מצלמה עם עדשה דיופטר +25 כדי לפצות על שבירה של העין העכבר.
- מניחים את העכבר על פלטפורמת הדמיה SLO. ודא כי הקרנית של העכבר פונה ישר לכיוון הראש האופטי של מכונת SLO.
- הפעל את מודול ההדמיה. באמצעות תוכנת מודול הדמיה המשויך, לחץ על כפתור "חולה חדש" ולהוסיף פרטים זיהוי בעלי חיים כגון מספר תג אוזן העכבר, תאריך הלידה, אחוז של צבע פלואורסצנטי וסוג התא שכותרתו.
- מיקום עצב הראייה של החיה במרכז המסך הדמיה על ידי תמרון מודול הדמיה. באמצעות תוכנת מודול ההדמיה המשויכת, לחץ על הלחצן 'רכש' כדי לצלם את תמונות הפונדוס אינפרא אדום (IR) באמצעות הגדרת הזווית של 30 ° או 15 °. ודא כי מרכז הרשתית, את התלמיד ואת הנתיב האופטי של הלייזר מיושרים כדי להשיג את התמונה באיכות הטובה ביותר.
- מיקום עצב הראייה של החיה במרכז המסך הדמיה על ידי תמרון מודול הדמיה. באמצעות תוכנת מודול ההדמיה המשויכת, לחץ על הלחצן 'רכש' כדי לצלם את תמונות הפונדוס אינפרא אדום (IR) באמצעות הגדרת הזווית של 30 ° או 15 °. ודא כי מרכז הרשתית, את התלמיד ואת הנתיב האופטי של הלייזר מיושרים כדי להשיג את התמונה באיכות הטובה ביותר.
- קח את הווידאו ICG ICG.
- הפעל את מסנן ה- ICG (790 ננומטר), הגדר את המצלמה למצב מהירות גבוהה עם תצוגת הזווית של 30 ° או 15 ° והגדר את עוצמת ICG ב -85 עבור כל הקריאות עבור סטנדרטיזציה. בלוח הבקרה, לחץ על כפתור "רכש" כדי לקחת את הווידאו (שליטה בסיסית) ב 8.8 / 15 מסגרות / s במשך 1 דקות.
- טען 100 μL של ארתרוציטים ICG שכותרתו לתוך מזרק אינסולין המצורפת מחט 30 מד.
- להזרקת דרך דרך הווריד הזנב, להכניס את המחט שפוע למעלה לתוך הווריד הזנב. אישור גישה תוך ורידי על ידי בדיקת זרימת הדם לתוך המזרק ולהזריק את התאים שכותרתו לתוך השאלה.
- להזרקת דרך מסלול רטרו מסלולית, הכנס את המחט הסמוכה העין לתוך רטרו מסלולית spacה. לאשר את הגישה רטרו מסלולית על ידי בדיקת זרימת הדם לתוך המזרק ולהזריק את התאים שכותרתו לתוך השאלה.
- לאחר הזריקה, מקם מחדש את העכבר וקח את תמונות ה- IR של ה- IR (ראה שלב 2.1.6.1) וסרטון באמצעות מסנן ה- ICG (ראה שלב 2.1.7.1). תאים שכותרתו במחזור הרשתית ניתן דמיינו מיד לאחר הזרקת התאים.
- לאחר רכישת מסגרות וידאו, לחלץ. תמונות Tiff של רצפי וידאו על ידי בחירת פורמט .tiff בעת ייצוא וידאו באמצעות תוכנת מודול צפייה SLO. שמור את הקבצים בתיקייה הרצויה.
- הסר את עדשות המגע, הנח אותו מעל העין השנייה, והשלם את ההדמיה כמתואר בשלבים 2.1.4 - 2.1.7.
- לאחר ההדמיה, במקום חיה הרדים תחת אור אינפרא אדום (250W) כדי לשמור על טמפרטורת הגוף עד שהוא מתאושש מהרדמה. כאשר החיה הוא התאושש לחלוטין, במקום את העכבר בחזרה לכלוב מחזיק.
- Live- הדמיה תא של 1% נתרן פלואורסצין שכותרתו לויקוציטים
- הכן את העכבר ואת הגדרת המכשיר כמתואר בסעיף 2.1.
- מקמו את העכבר וקחו את תמונות ה- IR של ה- IR כפי שמתואר בשלבים 2.1.4 - 2.1.6.
- השג את angiogram פלואורסצין של העכבר באמצעות מסנן פלואורסצין (488 ננומטר) עם מצב מצלמה במהירות גבוהה עם 30 ° או 15 ° זווית תצוגה ועוצמת פלואורצין ב 85 עבור כל הקריאות עבור סטנדרטיזציה. הקלט את הווידאו (בקרת בסיס) ב 8.8 / 15 מסגרות / s (ראה שלב 2.1.7.1).
הערה: כאן, רצועות מרובות של קטעי וידאו (1 דקות קטעי וידאו) נרכשו במרווחי זמן שונים.
- השג את angiogram פלואורסצין של העכבר באמצעות מסנן פלואורסצין (488 ננומטר) עם מצב מצלמה במהירות גבוהה עם 30 ° או 15 ° זווית תצוגה ועוצמת פלואורצין ב 85 עבור כל הקריאות עבור סטנדרטיזציה. הקלט את הווידאו (בקרת בסיס) ב 8.8 / 15 מסגרות / s (ראה שלב 2.1.7.1).
- להזריק 100 μL שכותרתו leukocytes לתוך העכבר דרך הווריד הזנב או הזרקת מסלול רטרו כמתואר בסעיף 2.1.8.
- מיד לאחר ההזרקה, מקמו את העכבר ולקחו את התמונות IR פונדוס (ראה צעדים 2.1.5 ו 2.1.6) ואת פלואResiin angiogram של העכבר (ראה סעיף 2.2.2).
- שים לב לתאים שכותרתו ברשתית או בכלי הדם של הצורואידים על ידי התאמת מוקד הלייזר הסורק על ידי סיבוב כפתור המיקוד על מודול ההדמיה.
- לרכוש את מסגרות וידאו ותמונות באמצעות SLU צפייה מודול תוכנה (ראה שלב 2.1.10) ולשמור אותו בתיקיה הרצויה.
- לאחר ההליך, בצע את שלב 2.1.12 לטיפול בבעלי חיים.
- ניתוח תמונה על ידי תוכנת MtrackJ
- פתח את רצף התמונה ב- ImageJ על ידי לחיצה על "קובץ". בחר "ייבוא" ובחר "רצף תמונות", בחר את תיקיית התמונה הרצויה, ולחץ על "פתח". חלון מוקפץ הנקרא "אפשרויות רצף" יופיע על המסך. לחץ על "אישור"; רצף התמונות ייפתח.
- הגדר את המרווח מסגרת של וידאו התמונה על ידי לחיצה על "תמונה" ובחר "מאפיינים" עבור מדידות מהירות. הנה, זה 8.8 מסגרתEs / s.
- פתח את תוסף MTrackJ על ידי בחירת "Plugins". בחר "מעקב" ולאחר מכן בחר "MtrackJ". התפריט אמור להופיע.
- כדי לשנות את הגדרות המעקב, בחר "מעקב" (תחת תפריט) וסמן את התיבה "מעבר לאינדקס מסגרת הזמן הבאה לאחר הוספת נקודה".
- עקוב אחר התא הראשון.
- אתר תא אחד ולעקוב אחר התא אותו במסגרות הבאות. בתפריט לחץ על "הוסף" כדי להוסיף רצועה חדשה.
- העבר את הסמן מעל התמונה (+ הירשם) ולחץ על התא המתאים.
הערה: MTrackJ יקפוץ באופן אוטומטי למסגרת הזמן הבאה ומוסיף מעגל קטן, המסמן את המיקום של הנקודה הראשונה במסלול. - המשך ללחוץ על המיקום הנוכחי של התא תוך כדי תנועה דרך המסגרות של רצף התמונה.
הערה: לעתים, המעגלים המסמנים את הנקודות הקודמות במסלול מפריעים ליכולת להציג את המיקום הנוכחי. במקרה זה,המשך לשלב 2.3.5.3.1.- לשנות את האפשרות להציג את המסלול על ידי לחיצה על "תצוגה" בתפריט ובחירה באפשרות "להציג רק לעקוב אחר נקודות בזמן הנוכחי". כדי לראות את כל המסלולים, בטל בחירה באפשרות זו.
- המשך ללחוץ עד שיופיע המסלול של התא הראשון. לאחר מכן שמור את המסלול על ידי לחיצה על "שמור".
- עקוב אחר התא השני.
- בתפריט, לחץ על "הוסף" כדי להתחיל רצועה חדשה. חזור על שלבים 2.3.5.1 - 2.3.5.4 למעקב אחר התא החדש. לחץ על "שמור" כדי לשמור את המסלול השני.
- המשך שלבים אלה עבור כל התאים הניתנים למעקב נצפו. לאחר מעקב אחר התאים, לחץ על "מדוד" ו "אישור" בכרטיסייה התפריט כדי לקבל את התוצאות.
הערה: חלון תוצאות נפתח באופן אוטומטי, אשר ניתן לשמור ולפתוח בגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erythrocytes שכותרתו עם ICG 1.5% היו דמיינו את זרימת הרשתית של עכברים C57BL / 6J (סוג בר). הן 1% ו 5% hematocrit של 1.5% ICG שכותרתו אריתרוציטים היו להבדיל במחזור הרשתית. עם זאת, אדם שכותרתו תאים היו בבירור יותר דמיינו עם 1% hematocrit של 1.5% ICG שכותרתו אריתרוציטים ( איור 1 ). ב 5% hematocrit, בשל המספר הגדול של תאים שכותרתו בכלי הרשתית, לא ניתן היה לסמן את התא הפרט. כמה אריתרוסטזיס נצפתה באזור peripapillary בשני התנאים, אבל זה היה בולט יותר ב 5% hematocrit של אריתרוציטים שכותרתו ( איור 2 ).
Leukocytes היו מסומנים בהצלחה עם 1% נתרן פלואורסצין בעקבות הפרוטוקול לעיל היו דמיינו כמו תאים שכותרתו ירוק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (
95 / 55495fig1.jpg "/>
איור 1 : 1% Hematocrit של 1.5% ICG תווית Erythrocytes במחזור הרשתית. ICG שכותרתו אריתרוציטים בודדים הצגת אותות בהירים בכלי הרשתית. כמה אריתרוסטזיס נצפתה באזור peripapillary. סולם = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : 5% Hematocrit של 1.5% ICG תווית Erythrocytes ב מחזורית הרשתית. רבים ICG שכותרתו אריתרוציטים הצגת אותות בהירים כלי הרשתית; כמות גדולה של אריתרוסטזיס נצפתה באזור peripapillary. סולם = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 : תמונה מיקרוסקופית פלואורסצנטי של 1% נתרן פלואורסצין תוויות Leukocytes. נתרן פלואורסצין שכותרתו לויקוציטים מראה אותות ניאון ירוק עם גושים קטנים (הגדלה 20X, סולם = 50 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : 1% נתרן פלואורסצין תוויות Leukocytes במחזור הרשתית. סודיום פלואורסצין שכותרתו לויקוציטים (חץ) מראה אות בהיר בכלי הרשתית. סולם = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 : מעקב אחר תאים בודדים שכותרתם במחזור רשתית באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. מסלולים שונים (עיגולים צבעוניים וקווים המיוצגים על התמונה) נמדדו כדי לחשב את המהירות הממוצעת של התאים שכותרתו את זרימת הרשתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לימוד המודינמיקה במחזור הרשתית והקורואידאל חיוני להבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות עיניים רבות. זרימת הדם הדינמיקה במחזור הרשתית ניתן ללמוד על ידי טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של תחום פורייה (FD-OCT), לייזר speckle flowgraphy (LSFG) ו oximetry רשתית. למרות ששיטות אלה משתמשות בגישות שונות כדי לחקור את זרימת הדם הכוללת במחזור הרשתית 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 , הם חולקים את המגבלה של חוסר היכולת ללמוד את דינמיקה הזרימה של סוגי תאים בודדים. החומרים המזינים ואספקת החמצן לרקמות הרשתית והקורואידית, כמו גם את ההגירה של תאי החיסון במחלות דלקתיות עיניים ואת תפקידם במחלת המחלה, ניתן ללמוד על ידי חקר דינמיקה הזרימה של אהYitrocytes ו leukocytes במחזור הרשתית ו choroidal, בהתאמה. טכניקות תיוג בשילוב עם שיטות הדמיה יעזור לעקוב אחר התאים שכותרתו במחזור ללמוד את דינמיקה הזרימה של התאים שכותרתו. מספר צבעים ניאון הוחלו בהצלחה התווית lukocytes ו אריתרוציטים לחקירה של הדינמיקה שלהם זרימה במחזור 3 , 17 , 18 , 19 .
כאן, אנו מדווחים על יישום של מזון ותרופות אישר שאינם רעילים צבעים פלואורסצנטי, indocyanine ירוק ו נתרן והעמסת, על תיוג והדמיה של אריתרוציטים ו leukocytes במחזור הרשתית, בהתאמה. למרות פלואורסצין הנתרן הוא צבע הנפוץ ביותר למעקב אחר leukocytes 31 , 32 , 33
כדי להשיג תמונות באיכות SLO, התלמידים צריכים להיות מורחבים במלואם ואת עדשות מגע יש להשתמש עם ג'ל עיניים כדי לשמור על קרנית לחות ולמנוע היווצרות קטרקט. המיקום של העיניים ואת הנתיב האופטי של המצלמה חייב להיות ישר כדי להשיג איכות פונדוס ותמונות angiogram. החיה צריכה להיות הרגעה עמוקה כדי למזער את התנועה במהלך ההדמיה. אמנם הן 1% ו 5% hematocrit של ICG 1.5%שכותרתו אריתרוציטים הפגינו להדמיה של תאים שכותרתו fluorescently במחזור הרשתית, hematocrit 1% היה מתאים יותר לניטור תאים בודדים. תאים שכותרתו fluorescently לא יכול להיות דמיינו אם מספר לויקוציטים מוזרק נמוך מדי. לכן, כדי להשיג תוצאות טובות יותר ניטור התאים שכותרתו במחזור הרשתית, מומלץ לאסוף ליקוציטטים של לפחות 4 עכברים, תווית עם פלואורסצין 1% נתרן, ולהזריק לעכבר אחד. אמנם יש כמה צבעים חלופיים עבור פלואורסצין נתרן (Calcein, FITC, DIO, FDA ו CFDA עם קליטה / פליטה מקסימום דומה או ליד נתרן פלואורסצין), שיעור שימור צבע ורעילות לרקמות העין יש להעריך 9 , 12 , 13 , 14 , 17 .
המגבלה של הטכניקה המדווחת היאדהייה של האות ניאון במחזור לאחר 60 דקות. לכן, זרימת הדינמיקה של התאים שכותרתו חייב להיות מנותח בתוך 60 דקות. כאן, כדי ליקוי leukocytes, הדם היה נסוג מעכבר אחד, תאים היו מבודדים, שכותרתו, הזריקו לעכבר אחר, ו דמיינו על ידי SLO. עם זאת, ב SLO, רק 0 - 1 תא לכל מסגרת נצפתה כלי הדם ברשתית. זה יכול להיות בגלל מספר תא ליקוציט מספיק ולכן אנו ממליצים לאסוף דם לפחות 3 - 4 עכברים לדמיין מספר תא גבוה יותר לכל מסגרת. מהירות המצלמה של 8.8 מסגרות / s שימשה במחקר, אבל זה יכול להיות מוגברת כדי להשיג יותר תמונות וסרטונים עוקבים של התאים שכותרתו.
מחקרים קודמים דיווחו על שינויים בזרימת הדם במחזור הרשתית של חולי סוכרת עם שלבים שונים של DR. Clermont et al. דיווחה על ירידה של 33% בזרימת הדם בחולים עם שלב מוקדם של DR 47 , ו Nguyen etאל. דיווחו על עלייה בזרימת הדם ברשתית בחולי סוכרת עם DR DR 48 . ירידה בזרימת הדם דווחה גם כקשורה בגלאוקומה מתקדמת. במחקרים הנ"ל, החוקרים חקרו את כל זרימת הדם במהירויות הרשתית. לימוד מהירות הזרימה של כל סוג תא יכול לספק מידע על אינטראקציות הסלולר במחלות שונות בשלבים שונים של המחלה ועשוי לסייע ב פרוגנוזה. כאן אנו מדווחים שיטה לתווית את אריתרוציטים ו leukocytes עם ICG ו פלואורסצין הנתרן, בהתאמה הדמיה שלהם במחזור הרשתית; שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מודל המחלה עבור vivo הלימודים.
מחקר עתידי יכול לנצל את טכניקות תיוג באמצעות SLO ללמוד את וריאציה דינמיקה הזרימה של אריתרוציטים שכותרתו ו leukocytes תחת קונדייטים שונים לטיפול תרופתיבשלבים שונים של המחלה. יתר על כן, השיטות שלנו יכול לעזור להבין את התפקיד של אריתרוציטים ו leukocytes ב פנוטיפים המחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות. ללא ניגוד עניינים.
Acknowledgments
פרויקט המחקר מומן על-ידי מענק מחקר חדש מטעם המועצה הלאומית למחקר רפואי (NMRC), סינגפור. הצוות יאהה להכיר את ההכשרה המחקרית שניתנה לד"ר אגרוול במכון לרפואת עיניים (IoO), אוניברסיטת קולג 'בלונדון (UCL), במסגרת המחקר הלאומי של המועצה למחקר רפואי (NMRC), מחודש נובמבר 2012 ועד אוקטובר 2014, בהנחיית פרופ' דוד שימה. ד"ר אגרואל רכש את הקונספט ואת הכישורים לתיוג התאים והדמיה חיה במעבדה של ד"ר שימא. לכן, הצוות יכיר בהדרכה ובהדרכה במהלך הדרכתו של פרופ 'דוד שימה, פרופ' קית 'מייסנר, ד"ר פיטר לונד וד"ר דאיו איוואטה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Shaker incubator | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10 G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |
References
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23 (5), 975-987 (2013).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
- Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58 (3), 353-363 (2006).
- Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366 (13), 1227-1239 (2012).
- Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
- Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, Blackwell Scientific Pubs. Oxford. (1978).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
- Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
- Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
- DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
- Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
- Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
- Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
- Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
- Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
- Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
- Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
- Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
- Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
- Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
- Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47 (6), 572-577 (2003).
- Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
- Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
- Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14 (7), 579-584 (1995).
- Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
- Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (10), 1879-1887 (1998).
- Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235 (1), 27-31 (1997).
- Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29 (6), 374-380 (1997).
- Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
- Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104 (10), 1670-1676 (1997).
- Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151 (5), 745-751 (2011).
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34 (34), 11504-11513 (2014).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (11), 2228-2233 (1996).
- Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93 (5), 634-637 (2009).
- Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17 (5), 4061-4073 (2009).
- Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1569-1574 (2015).
- Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88 (7), 723-729 (2010).
- Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11 (7), 0159650 (2016).
- Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93 (6), 439-445 (2015).
- Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49 (7), 1085-1096 (2004).
- Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124 (4), 433-446 (1997).
- Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25 (2016).
- Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129 (6), 728-733 (2000).
