Summary
Live-cellavbildning av de märkta blodcellerna i okulär cirkulation kan ge information om inflammation och ischemi vid diabetisk retinopati och åldersrelaterad macular degenerering. Ett protokoll för att märka blodceller och bilda de märkta cellerna i retinala cirkulationen beskrivs.
Abstract
Den retinala och choroidala blodflödesdynamiken kan ge insikt i patofysiologin och följderna av olika okulära sjukdomar, såsom glaukom, diabetisk retinopati, åldersrelaterad maculadegenerering (AMD) och andra okulära inflammatoriska tillstånd. Det kan också bidra till att övervaka de terapeutiska svaren i ögat. Korrekt märkning av blodcellerna, i kombination med levande cellbildning av de märkta cellerna, möjliggör undersökning av flödesdynamiken i retinal och choroidal cirkulation. Här beskriver vi de standardiserade protokollen av 1,5% indocyaningrön (ICG) och 1% natriumfluoresceinmärkning av respektive mus-erytrocyter respektive leukocyter. Skanningslaser-oftalmoskopi (SLO) applicerades för att visualisera de märkta cellerna i retinalcirkulationen av C57BL / 6J möss (vild typ). Båda metoderna demonstrerade distinkta fluorescensmärkta celler i mus-retinalcirkulationen. Dessa märkningsmetoder kan ha bredare tillämpningar vid olika okulära sjukdomarmodeller.
Introduction
Att studera blodcellens flödesdynamik i retinala och koroidala cirkulationen är avgörande för att förstå patogenesen av potentiellt synhotande okulära sjukdomar och andra okulära inflammatoriska tillstånd. De konventionella angiografiteknikerna, som involverar bindning av fluorescerande färgämnen till plasmaproteiner, ger emellertid ingen information angående dynamiken hos erytrocyterna eller leukocyterna 1 . Den erytrocytiska retinala flödesdynamiken är viktig för att studera metaboliskt effektiv cirkulation i näthinnan och leukocytflödesdynamiken för förståelse av cellmigration, igenkänning, vidhäftning och förstöring vid olika inflammatoriska tillstånd 2 . Det finns flera fluorescerande molekyler som används vid identifiering och karakterisering av olika celltyper 3 . Blodcellens hemodynamik kan mätas genom att färga dem med lämpliga fluorerCentfärgämnen och tillämpa rätt bildteknik 4 .
Förekomsten av inflammatoriska reaktioner i intraokulära sjukdomar som åldersrelaterad macular degeneration (AMD) och diabetisk retinopati (DR) innefattar ackumulering av lymfocyter i det sjuka området 5 , 6 . Spårning av immuncellerna i vävnaderna kan hjälpa till att förstå de komplexa händelserna som är involverade i mekanismen för sjukdomspatogenes. Radioaktiva isotoper som 51 Cr och 125 I användes som cellspårare i tidiga studier. Dessa färgämnen är giftiga och påverkar cellens livskraft. Fastän de radioaktiva markörerna 3 H och 14 C är mindre giftiga för cellerna, är det svårt att detektera sina signaler i systemet 7 , 8 på grund av sina lägre utsläppsenergier. Ett antal fluorokromfärger infördes för att övervinna de potentiella problem som associeras med wMed radioaktiva markörer och spårlymfocytmigrering in vitro med användning av fluorescerande mikroskopi och flödescytometri 9 , 10 . Hoechst 33342 och tiazolorange är DNA-bindande fluorescerande färgämnen, vilka används för att spåra lymfocyter in vivo. Hoechst 33342 binds till AT-rika regioner i DNA, är membrangenomsläppligt, behåller fluorescerande signaler i 2-4 dagar och är resistent mot släckning 9 , 10 . Nackdelarna med Hoechst 33342 och tiazolorange är inhiberingen av lymfocytproliferation 11 och den korta halveringstiden, 9 respektive.
Calcein-AM, fluoresceindiacetat (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-karboxietyl) -5- (och -6) -karboxifluorescein, acetoximetylester (BCECF-AM), 5- (och -6) Karboxifluoresceindiacetat (CFDA) och 5- (och -6) -karboxifluoresceindiacetatacetoximetylester (CFDA-AM)Är de cytoplasmatiska fluorescerande färgämnena som används för lymfocytmigrationsstudier. FDA, CFDA och CFDA-AM har emellertid lägre retention i cellerna 9 . BCECF-AM reducerar det proliferativa svaret och påverkar kemotaxis- och superoxidproduktionen 9 , 12 . Calcein-AM är ett fluorescerande färgämne och användbart för kortvariga in vivo lymfocytmigrationsstudier. Det avger starka fluorescerande signaler, stör inte de flesta av de cellulära funktionerna och behåller fluorescerande signaler i upp till 3 dagar 12 , 13 . Fluoresceinisotiocyanat (FITC) och karboxifluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFDA-SE) är kovalenta kopplings fluorescerande färgämnen, vilka används för lymfocytmigrationsstudier. FITC uppvisar ingen effekt på cellens livskraft och har en starkare affinitet med B-lymfocyter än T-lymfocyter 14 , 15 in vivo i mer än 8 veckor och upp till 8 cellavdelningar 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyaninperklorat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 och PKH26 är membran- Införande av fluorescerande lipofila karbocyaninfärger användes för att märka leukocyter och erytrocyter. C18 Dil och DiO uppvisar högre signaler när de införlivas i cellmembranet och är relativt giftfria 12 , 17 . PKH2-, PKH3- och PKH26-märkta celler uppvisar en god retention av fluorescerande signaler med mindre toxicitet 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Emellertid reglerar PKH2 ner CD62L-uttrycket och reducerar ly Mfocytlivbarhet 23 .
De flesta av de ovan nämnda studierna har utförts för att spåra lymfocytmigrationen och proliferationen i lymfatika och studera de märkta erytrocyterna i den icke-okulära cirkulationen. Det finns mycket få studier som tillämpar märkningsteknikerna för att studera blodcellerna i okulär cirkulation. Tillämpning av skanningslaseroptalmoskopi (SLO) har en stor fördel vid studier av de märkta cellerna i retinala och choroidala cirkulationen in vivo genom fundusangiografi 24 . Det finns flera fluorescerande färgämnen, såsom ICG, akridinorange, FITC, natriumfluorescein och CFDA som används för att studera leukocyterna i retinalcirkulationen av SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . Fototoxiciteten och karcinogeniciteten hos akridinorange 26 , 27 , interferensen av FITC med den cellulära aktiviteten och kravet på ett intravaskulärt kontrastmedel för upplösningen av retinala och koroidala blodkärl begränsar deras tillämpning i in vivo djurförsök 29 . Natriumfluorescein och ICG är giftfria, godkända av Food and Drug Administration, och säkra för testning på människor 32 , 35 . De flesta av de dynamiska studierna i flödet är relaterade till märkningen av leukocyterna eller erytrocyterna och dess visualisering i retinala och koroidala blodkärl 36 , 37 , 38 , 39
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De djurprotokoll som användes i denna studie godkändes av Institutionen för djurhälsa och användning av SingHealth, Singapore, och överensstämmer med riktlinjerna för Association of Research for Vision and Ophthalmology (ARVO) för användning av djur i ögon och vision Forskning.
1. Märkning av erytrocyter och leukocyter med fluorescerande färgämnen
- Framställning av reagens
- Förbered ICG (1,5 mg / ml) genom att lösa 3 mg ICG i 1800 μL steriliserat destillerat vatten. Tillsätt 200 μl 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Förbered 40% 1x PBS genom att tillsätta 4 ml 1x PBS till 6 ml steriliserat destillerat vatten. Förbered 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS genom att tillsätta 100 mg BSA till 10 ml 1x PBS. Blanda väl tills BSA är upplöst.
- Isolering av erytrocyter och leukocyter med användning av densitetsgradientcentrifugering
- Bedöva mössen (wild tyPe C57BL / 6) med användning av en kombination av ketaminhydroklorid (50 mg / kg) och xylazinhydroklorid (0,5 mg / kg) (enligt schema 1, enligt ARVO-riktlinjer). Bekräfta anestesi med hjälp av pedaluttagsreflex ( dvs tånklämning).
- Sätt långsamt 29 gauge nålen (fäst i en 1 ml spruta) vid en vinkel vinkel riktad mot hjärtat. För att bekräfta att nålen är inuti hjärtat, dra ut kolven något och kontrollera om blodet tas tillbaka i sprutan. Utsug 0,8 - 1 ml blod direkt från hjärtat.
- Överför omedelbart blodet till en etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (1,8 mg / ml blod) som innehåller bloduppsamlingsrör och blanda försiktigt för att förhindra koagulering av blodet.
- Euthanize mössen genom att administrera pentobarbital (80 mg / kg) genom intraperitoneal injektion.
- Lag hela blodet ovanpå en polysukros och natriumdiatrizoatlösning (1: 1 förhållande, densitet 1,077 g / ml) i ett 2 ml mikrocentrifugrör och centriFuge (450 xg, 30 min) för att tillåta separation av leukocyterna och erytrocyterna från plasma.
- Ta bort och kassera supernatanten (plasma) med en pipett. Överför försiktigt buffy coat (leukocyter) och erytrocyter (röda blodkroppskikt) till nya och separata rör med hjälp av pipetter.
- ICG (1,5%) märkning av erytrocyter
- Tvätta erytrocyterna med 1x PBS för att avlägsna eventuella föroreningar. Resuspendera erytrocyterna i 1x PBS (1: 1) för att göra 50% hematokrit. Aliquot 0,5 ml 50% hematokrit (~ 250 μl packade erytrocyter) i mikrocentrifugrör. Centrifugera erytrocyterna (750 xg, 5 min) och kassera supernatanten.
- Tillsätt 200 μL 40% 1x PBS till de pelleterade erytrocyterna, blanda väl och inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Tillsätt 100 μL ICG (1,5 mg / ml) till erytrocyt-suspensionen, blanda försiktigt genom att invertera röret och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter. Tillsätt 300 μl 1x PBS och inkubera vid37 ° C i en shaker-inkubator under 60 min.
- Centrifugera bärarens erytrocyter (750 xg, 3 min) och resuspendera i 1 ml 1x PBS.
- Tvätta cellerna ~ 3 - 5 gånger med 1x PBS tills supernatanten är klar (steg 1.3.3). Efter den sista tvätten dekantera supernatanten och tillsätt 1% BSA PBS (1: 1) till de märkta försvällda erytrocyterna för att uppnå en 50% hematokrit (1,25 x 108 celler / ml) ICG-märkta erytrocyter.
- Natriumfluorescein (1%) märkning av leukocyter
- Efter separering av buffy coat från blodet med användning av densitetsgradientcentrifugering (från steg 1.2.6) tvättas cellerna en gång med 10 ml 1x PBS genom centrifugering vid 450 xg under 10 minuter för att avlägsna eventuella föroreningar. Resuspendera pelleten i 900 μl 1x PBS.
- Tillsätt 100 μl 10% natriumfluorescein till 900 | il av leukocyt-suspensionen och inkubera vid rumstemperatur i 2 min. Tvätta de märkta cellerna tre gånger med 10 ml 1X PBS genom centrifugiNg (450 xg, 10 min). Resuspendera cellerna i 100 μl 1x PBS.
2. Live Imaging av fluorescensmärkta celler
- Live-cellavbildning av ICG-märkta erytrocyter
- För att förbereda celler för injektion via svansvener eller retro-orbitalväg, späd 50% hematokrit av ICG-märkta erytrocyter med 10 gånger och 50 gånger med 1x PBS för att framställa 5% respektive 1% hematokritceller.
- Placera musen under infrarött ljus (250W intensitet) i 5 minuter för att låta svansvenen utvidga sig. Bedöv musen med ketaminhydroklorid (50 mg / kg) och xylazinhydroklorid (0,5 mg / kg) genom intraperitoneal injektion (här enligt schema 1 enligt ARVO-riktlinjer).
- Utsöndra varje elev av ögonen med en droppe av 0,5% tropicamid och 2,5% fenylefrinhydroklorid.
- Placera kontaktlinsen över ett öga för bildbehandling. Använd oftalmisk gel som ett medium för bildbehandling och förhindra torrhetS av hornhinnan. Fixera den förkoksala laserskanningens oftalmopopi (SLO) -kamera med +25 diopterlins för att kompensera för brytningen av musöglan.
- Placera musen på SLO-bildplattformen. Se till att hornhinnan på musen vetter rakt mot SLO-maskinens optiska huvud.
- Slå på bildmodulen. Använd den tillhörande bildhanteringsmodulprogrammet, klicka på knappen "Ny patient" och lägg till information om djuridentifiering som t.ex. öronmärkesnummer, födelsedatum, procent av fluorescerande färgämne och märkt celltyp.
- Placera djurets optiska nerv i mitten av bildskärmen genom manövrering av bildmodulen. Använd den tillhörande bildhanteringsmodulen, klicka på "Acquire" -knappen för att ta infraröd (IR) fundusbilderna med 30 ° eller 15 ° vinkelvisning. Se till att mitten av näthinnan, pupillen och den optiska vägen för lasern är anpassade för att uppnå bästa bild.
- Placera djurets optiska nerv i mitten av bildskärmen genom manövrering av bildmodulen. Använd den tillhörande bildhanteringsmodulen, klicka på "Acquire" -knappen för att ta infraröd (IR) fundusbilderna med 30 ° eller 15 ° vinkelvisning. Se till att mitten av näthinnan, pupillen och den optiska vägen för lasern är anpassade för att uppnå bästa bild.
- Ta ICG fundus video.
- Slå på ICG-filtret (790 nm), ställ in kameran i höghastighetsläge med 30 ° eller 15 ° vinkel och ställ in ICG-intensiteten vid 85 för alla läsningar för standardisering. På kontrollpanelen klickar du på "Acquire" knappen för att ta videon (baseline kontroll) vid 8,8 / 15 bilder / s under 1 min.
- Ladda 100 μL ICG-märkta erytrocyter i en insulinspruta ansluten till en 30 gauge nål.
- För injektionen via svansvenen, sätt in nålkanten uppåt i svansvenen. Bekräfta intravenös åtkomst genom att kontrollera blodets återflöde i sprutan och injicera de märkta cellerna i cirkulationen.
- För injektionen via den retro-orbitala vägen, sätt in nålen intill ögat i det retro-orbitala områdete. Bekräfta retro-orbitalåtkomsten genom att kontrollera blodets återflöde i sprutan och injicera de märkta cellerna i cirkulationen.
- Efter injektionen, placera om musen och ta IR fundus bilderna (se steg 2.1.6.1) och video med hjälp av ICG filtret (se steg 2.1.7.1). De märkta cellerna i retinalcirkulationen kan visualiseras omedelbart efter injektionen av cellerna.
- Efter att ha köpt videoramarna, extrahera .tiff-bilder av videosekvenserna genom att välja .tiff-formatet när du exporterar videon med hjälp av SLO-visningsmodulprogrammet. Spara filerna i en önskad mapp.
- Ta bort kontaktlinsen, placera den över det andra ögat och slutföra avbildningen enligt beskrivningen i steg 2.1.4 - 2.1.7.
- Efter bildbehandling placera det bedövade djuret under infraröd ljus (250W) för att bibehålla kroppstemperaturen tills den återhämtar sig från anestesi. När djuret är helt återställt, placera musen tillbaka i hållarburet.
- Live-cellavbildning av 1% natriumfluoresceinmärkta leukocyter
- Förbered musen och ställ in instrumentet enligt beskrivningen i avsnitt 2.1.
- Placera musen och ta IR fundus bilderna enligt beskrivningen i steg 2.1.4 - 2.1.6.
- Skaffa fluorescein-angiogrammet från musen med hjälp av fluoresceinfiltret (488 nm) med höghastighets kameramodus med 30 ° eller 15 ° vinkel och fluoresceinintensitet vid 85 för alla mätvärden för standardisering. Spela in videoklippet (baslinjekontroll) vid 8,8 / 15 bilder / s (se steg 2.1.7.1).
OBS! Här köpte flera spår av videoklipp (1 min video) med olika tidsintervaller.
- Skaffa fluorescein-angiogrammet från musen med hjälp av fluoresceinfiltret (488 nm) med höghastighets kameramodus med 30 ° eller 15 ° vinkel och fluoresceinintensitet vid 85 för alla mätvärden för standardisering. Spela in videoklippet (baslinjekontroll) vid 8,8 / 15 bilder / s (se steg 2.1.7.1).
- Injicera 100 μl märkta leukocyter i musen genom svansvenen eller den retro-orbitala injektionen som beskrivs i avsnitt 2.1.8.
- Omedelbart efter injektionen, placera musen och ta IR fundus bilderna (se steg 2.1.5 och 2.1.6) och fluoRescein angiogram av musen (se avsnitt 2.2.2).
- Observera de märkta cellerna i näthinnan eller choroidala blodkärl genom att justera scanninglaserns fokuspunkt genom att vrida fokusratten på bildmodulen.
- Skaffa videoramar och bilder med hjälp av SLO-visningsmodulprogrammet (se steg 2.1.10) och spara det i en önskad mapp.
- Efter proceduren, följ steg 2.1.12 för vård av djur.
- Bildanalys av MtrackJ-programvara
- Öppna bildsekvensen i ImageJ genom att klicka på "File". Välj "Importera" och välj "Bildsekvens", välj önskad bildmapp och klicka på "Öppna". Ett popup-fönster som heter "Sequence Options" visas på skärmen. Klicka på "Ok"; Bildsekvensen öppnas.
- Ställ in bildintervallets ramintervall genom att klicka på "Bild" och välj "Egenskaper" för hastighetsmätningar. Här är det 8,8 frames / s.
- Öppna MTrackJ-pluginet genom att välja "Plugins". Välj "Spårning" och välj sedan "MtrackJ". En meny ska visas.
- För att justera spårningsinställningarna väljer du "Spårning" (under menyn) och markerar rutan "Flytta till nästa tidsramsindex efter tilläggspunkt".
- Spåra den första cellen.
- Leta upp en cell och spåra samma cell i efterföljande ramar. På menyn klickar du på "Lägg till" för att lägga till ett nytt spår.
- Håll markören över bilden (+ tecken) och klicka på lämplig cell.
OBS: MTrackJ hoppar automatiskt till nästa tidsram och lägger till en liten cirkel som markerar positionen för den första punkten i banan. - Fortsätt klicka på den aktuella positionen för cellen medan du rör dig genom bildrutans ramar.
OBS! Ibland stör cirklarna som markerar de tidigare punkterna i banan möjligheten att visa den aktuella platsen. Om detta inträffar,Fortsätt till steg 2.3.5.3.1.- Ändra visningsalternativet för banan genom att klicka på "Visar" i menyn och välj alternativet "visa endast spårpunkter vid aktuell tid". För att se alla banor, avmarkera det här alternativet.
- Fortsätt klicka tills banans första cell syns. Spara sedan spåret genom att klicka på "Spara".
- Spåra den andra cellen.
- Klicka på "Lägg till" i menyn för att starta ett nytt spår. Upprepa steg 2.3.5.1 - 2.3.5.4 för att spåra den nya cellen. Klicka på "Spara" för att spara det andra spåret.
- Fortsätt med dessa steg för att observera alla spårbara celler. Efter att ha spårat cellerna klickar du på "Mät" och "OK" i menyfliken för att få resultaten.
OBS! Ett resultatfönster öppnas automatiskt, vilket kan sparas och öppnas i ett kalkylblad för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erytrocyter märkta med 1,5% ICG visualiserades i retinalcirkulationen av C57BL / 6J möss (vild typ). Både 1% och 5% hematokrit av 1,5% ICG-märkta erytrocyter kunde särskiljas vid retinalcirkulationen. De enskilda märkta cellerna visualiserades emellertid tydligare med 1% hematokrit av 1,5% ICG-märkta erytrocyter ( Figur 1 ). I 5% hematokrit, på grund av det stora antalet märkta celler i retinalkärlen, var det inte möjligt att markera den individuella cellen. Vissa erytrostaser observerades i peripapillärområdet under båda betingelserna, men det var mer framträdande i 5% hematokrit av märkta erytrocyter ( Figur 2 ).
Leukocyter märktes framgångsrikt med 1% natriumfluorescein enligt ovanstående protokoll och visualiserades som gröna märkta celler med användning av fluorescerande mikroskopi (
95 / 55495fig1.jpg "/>
Figur 1 : 1% hematokrit av 1,5% ICG-märkta erytrocyter i retinalcirkulationen. ICG-märket individuella erytrocyter som uppvisar ljusa signaler i retinalkärlen. En del erythrostas observerades i peripapillärregionen. Skala = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : 5% hematokrit av 1,5% ICG-märkta erytrocyter vid retinalcirkulation. Många ICG-märkta erytrocyter visar ljusa signaler i retinalkärlen; En stor mängd erytrostas observerades i peripapillärområdet. Skala = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 : Fluorescensmikroskopi av 1% natriumfluoresceinmärkta leukocyter. Natriumfluoresceinmärkta leukocyter som visar gröna fluorescerande signaler med små klumpar (20X förstoring, skala = 50 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : 1% natriumfluoresceinmärkta leukocyter vid retinalcirkulation. Natriumfluoresceinmärkt leukocyt (pil) som visar ljus signal i retinalkärlen. Skala = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5 : Spårning av märkta individuella celler i retinalcirkulation med hjälp av bildanalysprogramvara. Olika spår (färgade cirklar och linjer som representerade på bilden) uppmättes för att beräkna medelhastigheten hos de märkta cellerna i retinalcirkulationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studier av hemodynamiken i retinal och choroidal cirkulation är avgörande för att förstå patofysiologin hos många okulära sjukdomar. Blodflödesdynamiken i näthinnans cirkulation kan studeras genom Fourier-domän optisk koherens tomografi (FD-OCT), laserspegelflödesgrafik (LSFG) och retinaltoximetri. Även om dessa metoder använder olika metoder för att studera det totala blodflödet i retinalcirkulationen 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 , delar de begränsningen av oförmågan att studera flödesdynamiken hos enskilda celltyper. Näringsämnena och syreförrådet till retinala och koroidala vävnader, liksom migrering av immunceller i okulär inflammatoriska sjukdomar och deras roll i sjukdomspatogenesen, kan studeras genom att undersöka flödesdynamiken hos erYtrocyter och leukocyter i retinal och choroidal cirkulation. Märkningstekniker i kombination med bildmetoder hjälper till att spåra de märkta cellerna i cirkulationen och studera flödesdynamiken hos de märkta cellerna. Flera fluorescerande färgämnen användes framgångsrikt för att märka leukocyterna och erytrocyterna för undersökning av deras flödesdynamik i cirkulationen 3 , 17 , 18 , 19 .
Här rapporterar vi tillämpningen av godkända icke-toxiska fluorescerande färgämnen, indocyaningrön och natriumfluorescein, för märkning och visualisering av erytrocyterna och leukocyterna i retinala cirkulationen. Även om natriumfluorescein är det vanligaste färgen för spårning av leukocyterna 31 , 32 , 33
För att uppnå kvalitetsbilder i SLO måste eleverna vara fullständigt dilaterade och kontaktlinsen måste användas med oftalmisk gel för att upprätthålla en fuktig hornhinna och förhindra bildning av katarakt. Ögonens position och den optiska vägen för kameran måste vara raka för att uppnå kvalitets fundus och angiogrambilder. Djuren bör vara djupt sedated för att minimera rörligheten under avbildningen. Även om både 1% och 5% hematokrit av 1,5% ICGMärkta erytrocyter visade visualisering av fluorescensmärkta celler i retinalcirkulationen, 1% hematokrit var bättre lämpad för övervakning av de enskilda cellerna. Fluorescensmärkta celler kan inte visualiseras om antalet injicerade leukocyter är för lågt. För att uppnå bättre resultat vid övervakning av de märkta cellerna i retinalcirkulationen rekommenderas därför att samla leukocyter från minst 4 möss, märka med 1% natriumfluorescein och injicera i en enda mus. Även om det finns några alternativa färgämnen för natriumfluorescein (Calcein, FITC, DIO, FDA och CFDA med absorptions- / utsläppsmaxima som liknar eller nära natriumfluorescein), måste färghalten och toxiciteten för ögonvävnader utvärderas 9 , 12 , 13 , 14 , 17 .
Begränsningen av den rapporterade tekniken är denBlekning av den fluorescerande signalen i cirkulation efter 60 min. Därför måste flödesdynamiken hos de märkta cellerna analyseras inom 60 minuter. För att märka leukocyter togs blod ut från en mus, celler isolerades, märktes, injicerades i en annan mus och visualiserades av SLO. I SLO observerades emellertid endast 0-1 cell per ram i retinala blodkärl. Detta kan bero på otillräckligt leukocytcellnummer och så rekommenderar vi att samla blod från minst 3 - 4 möss för att visualisera ett högre cellnummer per ram. Kamerans hastighet på 8,8 bilder / s användes i studien, men detta kunde ökas för att uppnå fler sekventiella bilder och videoklipp av de märkta cellerna.
Tidigare studier rapporterade förändringar i blodflödeshastigheten i retinalcirkulationen av diabetespatienter med olika steg i DR. Clermont et al. Rapporterade en 33% minskning av retinalt blodflöde hos patienter med tidigt stadium av DR 47 och Nguyen etal. Rapporterade en ökning av retinalt blodflöde hos diabetespatienter med proliferativ DR 48 . En minskad blodflödeshastighet rapporterades också vara associerad med progressiv glaukom 49 . I de ovannämnda studierna undersökte författarna hela blodflödeshastigheterna i retinalcirkulationen. Att studera flödeshastigheterna för varje celltyp kan ge information om de cellulära interaktionerna i olika sjukdomar och vid olika sjukdomsstadier och kan hjälpa till i prognosen. Här redovisar vi en metod för att märka erytrocyterna och leukocyterna med respektive ICG respektive natriumfluorescein och deras visualisering i retinalcirkulationen; Denna metod kan tillämpas på vilken sjukdomsmodell som helst för in vivo studier.
Framtida forskning kan utnyttja våra märkningstekniker genom att använda SLO för att studera variationen i flödesdynamiken hos de märkta erytrocyterna och leukocyterna under olika läkemedelsbehandlingstillståndPå olika stadier av sjukdomen. Vidare kan våra metoder hjälpa till att förstå rollen av erytrocyter och leukocyter i sjukdomsfenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja. Ingen ekonomisk eller intressekonflikt.
Acknowledgments
Forskningsprojektet finansierades under New Investigator grant från National Medical Research Council (NMRC), Singapore. Teamet vill bekräfta forskarutbildningen till Dr Agrawal vid Institute of Ophthalmology (IoO), University College London (UCL) under National Medical Research Councils (NMRC) utomeuropeiska forskningsutbildningssamfund från november 2012 till oktober 2014 under mentorskap av prof. David Shima. Dr. Agrawal förvärvade konceptet och färdigheter för att märka cellerna och levande avbildning i Dr. Shimas laboratorium. Teamet kommer därför att bekräfta övervakning och vägledning under träningsförbundet från prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh och Dr. Daiju Iwata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Shaker incubator | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10 G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |
References
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23 (5), 975-987 (2013).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
- Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58 (3), 353-363 (2006).
- Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366 (13), 1227-1239 (2012).
- Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
- Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, Blackwell Scientific Pubs. Oxford. (1978).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
- Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
- Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
- DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
- Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
- Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
- Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
- Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
- Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
- Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
- Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
- Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
- Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
- Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
- Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47 (6), 572-577 (2003).
- Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
- Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
- Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14 (7), 579-584 (1995).
- Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
- Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (10), 1879-1887 (1998).
- Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235 (1), 27-31 (1997).
- Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29 (6), 374-380 (1997).
- Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
- Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104 (10), 1670-1676 (1997).
- Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151 (5), 745-751 (2011).
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34 (34), 11504-11513 (2014).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (11), 2228-2233 (1996).
- Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93 (5), 634-637 (2009).
- Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17 (5), 4061-4073 (2009).
- Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1569-1574 (2015).
- Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88 (7), 723-729 (2010).
- Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11 (7), 0159650 (2016).
- Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93 (6), 439-445 (2015).
- Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49 (7), 1085-1096 (2004).
- Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124 (4), 433-446 (1997).
- Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25 (2016).
- Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129 (6), 728-733 (2000).
