Summary
G4 Resolvase1 bindet an G-Quadruplex (G4) Strukturen mit dem engsten berichteten Affinität für ein G4-Bindungsprotein und stellt die Mehrheit der G4-DNA Abwickeln Aktivität in HeLa-Zellen. Wir beschreiben ein neuartiges Protokoll, das die Affinität und ATP-abhängige Abwickeln Aktivität von G4-Resolvase1 nutzt gezielt katalytisch aktive rekombinante G4R1 reinigen.
Abstract
Höherwertige Nukleinsäurestrukturen G-Quadruplexe (G4S, G4 Strukturen) in guaninreichen Regionen sowohl DNA als auch RNA und sind thermisch hochstabile Form genannt. Es gibt> 375.000 putative G4 bildenden Sequenzen im menschlichen Genom, und sie sind in Promotorregionen, untranslatierten Regionen (UTRs) angereichert, und innerhalb der telomeren Wiederholungs. Aufgrund des Potenzials für diese Strukturen zellulärer Prozesse zu beeinflussen, wie beispielsweise Replikation und Transkription wurde die Zellenzyme entwickelt sie zu verwalten. Ein solches Enzym ist G4 Resolvase 1 (G4R1), die biochemisch wurde zusammen gekennzeichnet durch unser Labor und Nagamine et al. und zu binden , extrem eng sowohl G4-DNA und RNA-G4 (K d im Nieder pM - Bereich) gefunden. G4R1 ist die Quelle der Mehrzahl der G4-Auflösungsaktivität in Lysaten HeLa-Zelle und hat eine Rolle, da eine Rolle bei telomere Stoffwechsel, Lymphe Entwicklung, Gentranskription, Hämatopoese und Immunüberwachung spielen. Die Fähigkeit, efzient Expression und Aufreinigung katalytisch aktive G4R1 von Bedeutung ist für die Laboratorien an weiteren Einblick in die kinetische Interaktion von G4 Strukturen und G4-Lösung Enzyme zu gewinnen. Hier beschreiben wir eine detaillierte Verfahren zur Reinigung von rekombinantem G4R1 (rG4R1). Das beschriebene Verfahren beinhaltet die herkömmliche affinitätsbasierte Reinigung eines C-terminalen Histidin-markiertes Enzym in menschlichen Codon-optimierten ausgedrückt Bakterien mit der Ausnutzung der Fähigkeit von rG4R1 zu binden und G4-DNA Entspannen hochaktive Enzym in einer ATP- zu reinigen abhängige Elutionsschritt. Das Protokoll enthält außerdem ein Qualitätskontrollschritt, bei dem die enzymatische Aktivität von rG4R1 durch Untersuchung der Fähigkeit des gereinigten Enzyms gemessen wird G4-DNA zu entspannen. Außerdem wird ein Verfahren beschrieben, das für die Quantifizierung von gereinigtem rG4R1 ermöglicht. Alternative Anpassungen dieses Protokolls werden diskutiert.
Introduction
G4 Strukturen sind hochstabile Nukleinsäuresekundärstrukturen, die innerhalb Guanin-reichen Regionen von DNA und RNA bilden. G4 Strukturen werden über Hoogsteen-Bindungswechselwirkungen stabilisiert und koordinative Bindung innerhalb des zentralen Hohlraums mit einwertigen Kationen (d. K + und Na +), die zu der bemerkenswerten thermischen Stabilität von G4 Strukturen 1, 2 wesentlich beitragen. Frühe Bioinformatik Studien vorgeschlagen , dass das menschliche Genom enthält> 375.000 "potential G4 bildenden Motive" 3, 4. Neuere Studie Schätzungen deuten darauf hin , dass die Anzahl der G4 - Motive höher ist um einen Faktor von 2-5 5, während eine andere Studie 716.310 unterschiedliche Potential G4 bildenden prognostiziert 6 Sequenzen im menschlichen Genom. G4-bildende Sequenzen sind evolutionär konserviert und nicht willkürlich verteilt indas Genom. G4 - Motive sind in Gen kodierenden Regionen angereichert und nach oben von 40% der Gen - Promotoren enthalten G4 Motive 7. Interessanterweise hat der Grad der Anreicherung von G4-Motive in einem Gen demonstriert worden, um die Funktion des Gens zu suggerieren. Zum Beispiel haben proto-Onkogenen und Gene in Entwicklung beteiligt signifikant größere Anreicherung von G4 Strukturen als Tumorsuppressorgene 8, 9.
Mit hoher thermischer Stabilität, eine fast allgegenwärtige Präsenz im gesamten Genom, und das Potenzial, deutlich größeren zellulären Prozesse beeinflussen, ist es wenig überraschend zu finden, dass die Zelle Enzyme zu verwalten, diese Strukturen entwickelt hat. Ein solches Enzym ist G4 Resolvase1 (G4R1; auch Rhau und DHX36 genannt), die wir als die Quelle der meisten tetra G4-DNA Auflösungs Aktivität charakterisiert in menschlichen (HeLa) Zellen 10. Seitdem hat es sich gezeigt, That G4R1 fest bindet und abwickelt katalytisch tetra und unimolekularer G4-DNA und G4-RNA mit den engsten berichteten KDs für einen G4-bindendes Protein 11, 12, 13. Zusätzlich hat die G4-Auflösungs Aktivität von G4R1 wurde in einer Vielzahl von biochemischen und zellulären Prozessen beteiligt, einschließlich telomere / Telomerase biology 11, 14, 15, 16, Transkription und Splicing 17, 18, 19, 20, Entwicklung 21, Hämatopoese 21, und der Immunregulation 22, 23. Mit einem Übergewicht der G4-Sequenzen spezifisch im gesamten Genom und die diverse zelluläre p gelegenrozesse dass G4R1 die Fähigkeit hat zu verwickelt beteiligt mit kurzem wurde, zu exprimieren und zu reinigen, effizient hochaktiven rG4R1 von äußerster Wichtigkeit ist, die biochemischen Mechanismen, und das Verhalten dieses Proteins für die Aufklärung.
Hier zeigen wir eine neuartige Expression und Reinigungsschema (Figur 1) , die die Vorteile der ATP-abhängige, G4-Auflösungs Aktivität von rG4R1 effizient isolieren aktiven Enzyms führt. Dieses Schema könnte angepasst werden, um andere ATP-abhängigen, für die Nukleinsäure-Enzyme zu reinigen das Produkt der enzymatischen Reaktion ist nicht länger ein Substrat für die Bindung, wie es der Fall für G4R1.
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Protocol
1. Herstellung von G4-DNA-Strukturen, die für die Reinigung von rG4R1 Used (Bildung von biotinylierter DNA-G4 G-Quadruplex)
- Bestellen Sie folgende DNA-Oligomer, genannt Z33-Bio, bei einer 1 & mgr; mol-Maßstab: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-Biotin-3'. Sicherzustellen, dass die Biotin-Einheit am 3'-Ende des Oligomers ist.
- Bereiten 10x G4-Puffer: 450 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA und 2,500 mM NaCl.
- Resuspendieren Z33 Oligomers in 250 ul Wasser (so dass die Oligomer-Konzentration von ~ 2,5 mM). In 25 ul 10x G4-Puffer und mischen. Inkubieren des Oligomers bei 50 ° C für ~ 48 h.
- Kurz das Rohr drehen, um die Kondensation (~ 1000 · g, 10 s) zu sammeln. Hinzufügen ~ 50 & mgr; l eines hoher Masse, hydrophiles Polysaccharid (30% Ficoll in H 2 O) und mischen. Gießen Sie eine 10% Acrylamid / 1x TBE / 10% Glycerin-Gel (Gel Maße: 16 cm x 16 cm x 1 mm). Sobald das Gel polymerisiert wird, waschen Sie die Vertiefungen mit 1x TBE und Lastdas gebildete Z33-Bio-Oligomer gleichmäßig über den größten Teil des Gels (Spur Laden Probe mit Schlieren Linien sichtbar gemacht werden).
- In einer Spur am Ende des Gels geladen einen kleinen Anteil des Oligomers, das für 10 min (dies dient als unstrukturierte Steuerung) sowie eine kleine Menge an Gel-Beladungsfarbstoff in eine andere bei 98 ° C erhitzt wurde, Spur zu überwachen, wie weit das Gel laufen.
- Verwenden Sie 1x TBE als Gel-Laufpuffer und führen Sie das Gel bei 120 V, bis die Farbstofffront mindestens 1/3 des Gels durchlaufen hat.
- Legen Sie eine Dünnschicht-Chromatographie-Platte mit seiner rauen Seite nach oben in einer Klarsichthülle (oder mit Plastikfolie abdecken). Entfernen Sie eine der Glasplatten und übertragen Sie das Gel auf die Oberfläche des Blattschutz. Schalten Sie die Deckenbeleuchtung und UV-Schatten das Gel (lange Wellenlänge: 365 nm). Verwenden Sie eine frische Rasierklinge und schneiden Sie die G-Quadruplex-Z33-Bio-Band, die als Lauf höher im Gel zu sehen sein wird (mit langsamer Mobilität) bezogen auf die Schmelzeed Kontrolle.
- Legen Sie die Gelschnitte das gebildete G4-DNA in einem 50 ml-Röhrchen und fügen Sie einfach genug Einweichen Puffer, der die Gelschnitte zu bedecken (Einweichen Puffer besteht aus 1/3 Volumen 10x TBE, 1/3 Volumen gesättigter Natriumacetat und 1/3 Volumen H 2 O). Das Röhrchen wird in einem 37 ° C-Inkubator (nonhumidified) und Inkubation O / N.
- Die Lösung wird in einem 15 ml-Röhrchen und fügen 1/10 Volumen Glykogen (Glykogen Lager bei 20 mg / ml in 10 mM Tris-HCl pH 8, 2,5 mM EDTA pH 8 und 0,05% Natriumazid) und ~ 1.2x Volumen Isopropanol .
HINWEIS: Natriumazid ist akut toxisch, so mit Vorsicht verwenden!- Mischen Sie und legen Sie den Schlauch bei -20 ° C für mindestens 2 h. Drehe das Röhrchen bei 2.700 xg in einer Tischzentrifuge, gekühlt auf 4 ° C für 12 min. Vorsichtig dekantiert die Lösung von der G4-DNA pelletiert. Waschen Sie das Pellet 3 mal mit 70% EtOH + 50 mM NaCl (das Salz in der Wasch ist entscheidend für die Stabilität G4). Wick entfernt überschüssige Flüssigkeit mit einem fusselfreien Tuch Papier.
- OrtDas gewaschene Pellet im Kühlschrank das Pellet mindestens 2 h hydratisieren und zum leichteren Resuspension ermöglichen. Resuspendieren des Pellets in 50 ul TNE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl und 0,05 mM EDTA pH 8).
- Place 5 ul dieser gebildeten DNA G-Quadruplex in 495 & mgr; l H 2 O und zu quantifizieren , indem unter Verwendung eines Spektrophotometers , das der Extinktionskoeffizient ermöglicht durch Eingabe der Nukleotidzusammensetzung des Oligomers bestimmt werden (der Extinktionskoeffizient des Z33 DNA - Oligomer mit einer Basiszusammensetzung A = 8, C = 3, G = 15 und T = 7 341.946 l / mol / cm). Geben Sie den Verdünnungsfaktor 25 (nicht 100), da das gebildete G-Quadruplex von 4 Stränge der DNA besteht.
- Aliquot der Volumenäquivalent von 3 ODs (OD 260 Einheiten) pro Röhrchen und bei -20 ° C; wenn die 5 & mgr; l zum Beispiel, die mit dem 495 & mgr; l H 2 O ergibt eine OD 260 Lesen von 3 hinzugefügt wurde, bereiten dann 5 & mgr; l Aliquots.
2. Herstellung von G4-DNA-Strukturen in eine enzymatische Aktivität Assay von rG4R1 verwendet zu werden (Bildung von TAMRA-markierten G4-DNA)
- Bestellen Sie folgende DNA-Oligomer, genannt Z33-TAM bei einer 1 & mgr; mol-Maßstab: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Sicherzustellen, dass die TAMRA-Rest am 5'-Ende des Oligomers ist.
- Nach dem gleichen Verfahren wie in Abschnitt 1 für die Bildung der G-Quadruplex umrissen, mit der Ausnahme, dass ultraviolette (UV) shadowing ist nicht notwendig, da die Tetramethylrhodamin (TAMRA) -markierten G-Quadruplex wird mit dem bloßen Auge leicht sichtbar sein. Wieder stellen Sie sicher, dass eine geschmolzene Kontrolle auf dem Gel enthalten.
- ein Spektrophotometer Lesen des TAMRA-markierte DNA G-Quadruplex, wie in Schritt 1, verdünne das gebildete G-Quadruplex bis 0,2 pmol / & mgr; l mit TNE-Puffer nach der Einnahme. Schließlich Glycerin zu einer 10% igen Endkonzentration und bei -20 ° C hinzufügen.
3. Transformation (DE3) pLysS Competent Cells mit ptriEx4-DHX36 (Plasmid Encoding Menschen G4R1) und wachsen / Induce Große Bakterienkulturen
- Beziehen Sie die TriEx4-DHX36 Plasmid.
- Aliquot der Bakterien in 20 & mgr; l-Aliquots und lagern Sie sie bei -80 ° C. Aliquot der SOC - Medium (2% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 10 mM MgSO 4 und 20 mM Glucose) in 80 ul Aliquots und bei -80 ° C.
- Bereiten Sie Carbenicillin (CARB) / Chloramphenicol (CAM) LB-Agar-Platten. Stock Konzentrationen von CARB und CAM sind 50 mg / ml in H 2 O und 35 mg / ml in 70% EtOH, bzw., und diese sind 1,000x konzentriert; Somit sind die Endkonzentrationen in der LB-Agar-Selektionsplatten 50 ug / ml und 35 ug / ml.
- Platz 1 aliquote Menge von Bakterien auf Eis und legen 1 aliquoten SOC-Medium bei RT. 1 ug pTriEx4-DHX36 Plasmid zu den Bakterien und vorsichtig schwenken mit der Pipettenspitze zu mischen. Inkubieren auf Eis für weitere 5 min und dann Hitzeschock bei 42 & #176; C für 30 s. Auf Eis für 2 Minuten und fügen Sie das SOC-Medium.
- Platte, die die transformierten Bakterien auf vorgewärmten Selektionsplatten (typischerweise Platte mit einem kleinen Volumen, wie von 5 bis 10 & mgr; l, zu niedrige Kolonie Dichte gewährleisten, sodass einzelne Kolonien lassen sich leicht in großen Kulturen geimpft werden) und Inkubation bei 37 ° CO / N.
- Bereiten Terrific Broth gemäß den Anweisungen des Herstellers 24. Machen Sie 500 ml pro großen Kolben (stellen Sie sicher, Glycerin hinzufügen) und Autoklaven auf einem kurzen Flüssigkeitskreislauf.
- Hinzufügen CARB / CAM (50 ug / ml / 35 & mgr; g / ml) zu der Brühe und dann die Kulturen inokulieren durch Agarpfropfen wobei (unter Verwendung einer Pipette p1000) eine einzelne Bakterienkolonie und Pipettieren in die Brühe enthält. Swirl, die Kulturen kräftig sie zu belüften und dann brüten die Kulturen bei 37 ° CO / N ohne Schütteln.
- Am nächsten Tag, legen Sie die Kulturen in einem 37 ° C Schüttler und schütteln bei ~ 225 Umdrehungen pro Minute. Wachsen die Kulturen , bis die OD 600 etwa 0,4 -0,6, die etwa 4 typischerweise nehmen - 6 h, abhängig von der anfänglichen Zelldichte.
Hinweis: Dies wird durch spektrophotometrische Messungen periodische Dichteüberwachung erfordern, und es ist wichtig , die Kulturen zu viel über 0,5 ODs nicht wachsen. Als Rohling für spektrophotometrische Messungen, Spin-down 1 ml Bakterien und die geklärte Brühe als Blanking-Lösung verwenden. - Sobald die richtige OD 600 erhalten wird, legen Sie sofort die Kulturen auf Eis und sie schnell auf 10 ° C abkühlen lassen . Überwachen Sie die Temperatur mit einem Thermometer sauber gewischt mit 70% EtOH. Expedite die Kühlung durch schnelles Drehen der Kolben während auf Eis, da dies zu weiteren Bakterienwachstum vor der rekombinanten Proteininduktion begrenzen.
- Hinzufügen IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM (~ 120 mg / 500 ml Kultur) und dann Schütteln bei 80 rpm bei 14 ° C für ~ 17 bis 18 h. Die ideale Temperatur für die Proteininduktion wurde gefunden, 14 ° C sein; am besten dies zu erreichen, verwenden Sie ein loc Wasserbad gekühlt Schüttlerin einem herkömmlichen Kühlraum ATED und manuell die Temperatur des Wasserbades mit einem Thermometer überprüfen.
HINWEIS: Alternativ können Sie auch einen luftgekühlten Schüttler / Inkubator, obwohl es notwendig ist , was zu testen digital eingestellten Temperatureinstellung die gewünschte Flüssigkeitstemperatur ergeben wird (Test dies durch eine Flasche Wasser mit einem Thermometer in ihm Inkubation und Schütteln bei 80 Umdrehungen pro Minute für ein paar Stunden wird die digitale Temperatureinstellung entsprechend, bis 14 ° C Einstellung erreicht). - Legen Sie die Kulturen auf Eis und kühlen sie schnell, wie in Schritt 3.9. Nehmen Sie eine kleine aliquote Menge von Bakterien und nehmen Sie eine OD 600 Lesung; 1.2 OD 600 - im Idealfall werden sich die Kulturen während der Induktion auf etwa 0,8 verdoppelt.
- Übertragen Sie die Bakterien zu 500 ml Zentrifugenröhrchen und manuell ausgleichen Bakterienkultur unter Verwendung des Gewichts zwischen den Rohren zu glätten. Einmal ausgeglichen, sie für 20 min bei 4 ° C bei 3.840 xg zentrifugiert. Gießen Sie die geklärte Brühe ab und frieren die bakterielle pelkönnen bei -80 ° C bis zum Zeitpunkt der Proteinreinigung.
4. Reinigung von humanen rG4R1
- Tauen und Bakterienpellets lysieren.
- Auftauen das Bakterienpellet in 3 ml TN-Puffer bei RT (TN-Puffer besteht aus 100 mM Tris pH 7,5 und 50 mM NaCl). Halten Sie die Flaschen in der Hand und wirbeln auftauen / resuspendieren Bakterienpellet. Nach dem Auftauen und relativ gleichmäßig suspendiert, bringen das Volumen bis zu 5 ml mit TN-Puffer (weitere Suspension kann über Auf- und Abpipettieren mit einer 5-ml-Pipette erreicht werden).
HINWEIS: Es ist typisch auftauen / prep entweder 2 oder 4 Flaschen am Tag der Vorbereitung, in Abhängigkeit von dem Niveau des Benutzers an Komfort mit dem Reinigungsverfahren. - Man löst 20 mg Lysozym in 250 & mgr; l H 2 O (pro Kultur) , und fügen zu den resuspendierten Bakterien. Lassen Sie das Lysozym die Bakterien für ~ 5 zu verdauen - 10 min, während die Flaschen in der Hand wirbeln.
HINWEIS: Die Farbe des susRente beginnt etwas wie die Verdauung weiter zu erleichtern, und die Suspension wird relativ nicht-viskos sein. Wenn die Kulturen zu überwachsen sind (dh viel größer als 1,2 OD 600), dann wird die chromosomale bakterielle DNA unerwünschte Viskosität in diesem Stadium verursachen können. - In 250 ul Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC) und ein 10-ul-Aliquot von Leupeptin. Gut mischen.
- Auf Eis und 10 ml kaltem TN-Puffer und 22 & mgr; l von BME. Transfer in ein 50 ml Röhrchen.
- Beschallen die Bakterien auf Eis mit einem digitalen Beschallungsgerät auf 30% Amplitude eingestellt. Impuls bei 2 s ON und 2 s AUS für 1 min. Wiederholen Sie die Beschallung 3 mal, so dass die Proben für mindestens 2 min zwischen Beschallungsschritte auf Eis zu kühlen.
HINWEIS: Bei mehreren Kulturen, jede wiederum beschallen , bevor die Beschallung Iterationen wiederholen. Während der Beschallung, seien Sie vorsichtig die Beschallungsspitze zu halten ausreichend im Bakterienlysats untergetaucht, aber nicht berühren the Seiten des Rohres, da dies überschüssige Wärme erzeugen. - In das gleiche Volumen (15 ml) kaltem 4x SSC + 20 & mgr; l von BME + 50 & mgr; l von PIC + 1 aliquote Menge von Leupeptin und mischen.
- In einer Tischzentrifuge auf 4 ° C vorgekühlt Zentrifugation der Lysate bei 2.300 xg für 20 min. Den Überstand auf frische, vorgekühlte 50 ml-Röhrchen (1 Röhrchen pro große Kultur vorbereitet wird).
- Auftauen das Bakterienpellet in 3 ml TN-Puffer bei RT (TN-Puffer besteht aus 100 mM Tris pH 7,5 und 50 mM NaCl). Halten Sie die Flaschen in der Hand und wirbeln auftauen / resuspendieren Bakterienpellet. Nach dem Auftauen und relativ gleichmäßig suspendiert, bringen das Volumen bis zu 5 ml mit TN-Puffer (weitere Suspension kann über Auf- und Abpipettieren mit einer 5-ml-Pipette erreicht werden).
- Bereiten Sie G4-magnetischen Kügelchen.
- Nehmen Sie 1 ml Streptavidin paramagnetische Perle (SPB) Suspension (je 1 Liter Kultur), und überträgt es auf einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pellet die SPB mit einem Magneten und waschen Sie 2x mit 2x SSC + 5 mM EDTA pH 8 Resuspendieren des gewaschenen SPB in 200 & mgr; l der gleichen Lösung zum Waschen der Kügelchen verwendet.
- In einem 3 OD aliquote Menge von G4-DNA (Z33-Bio G4 hergestellt in Abschnitt 1) an die SPB Suspension und mischen schnell durch Auf- und Abpipettieren mehrmals. Die Röhrchen auf einem Rotator und rotieren bei RT für mindestens 30 min (und bis zu 60 min).
- Achterner diese Periode der Rotation, blockieren die G4-gebundenen SPB von 1 ml 0,4% Lactalbumin Zugabe, und auf Eis halten, bis sie benötigt. Verdünnen Sie die 0,4% Lactalbumin aus der 4% Lactalbumin Lager mit 1x Tris-Glycin.
HINWEIS: Das Lager 4% Lactalbumin (w / v) zunächst durch Auflösen in 2 M Glycin pH 7,5, mit der weiteren Zugabe von 1x PIC und 0,05% Natriumazid hergestellt wird.
- Bind Histidin-markierten rG4R1 zu Kobaltkügelchen (CB) (Fortsetzung von Schritt 4.1).
- 1 mL CB Aufschlämmung (äquivalent zu einem 0,5 ml Volumen bead) zu jeder 50 ml-Röhrchen geklärte Bakterienlysat enthält. Inkubieren für 20 min bei RT auf einem Rotator.
HINWEIS: 0,5 mL bead Volumen pro 1 l geklärtes Lysat verwendet wird; beispielsweise , wenn zwei 500 ml - Bakterienkulturen hergestellt, nur CB auf die 50 ml - Röhrchen hinzu geklärte Lysat aus einer der Kulturen an diesem Punkt, wie Lysat aus der zweiten Kultur , die in Reihe mit dem gleichen 0,5 ml CB in st gebunden sindep 4.3.3). - Spin-Down CB bei 110 xg für 5 min in einem 4 ° C Tischzentrifuge. Saugen Sie das sorgfältig Flüssigkeit und lassen ein paar ml Flüssigkeit, um nicht die pelle CB zu stören. Waschen mit 10 bis 15 ml kaltem 4x SSC + BME (0,5 ul BME / ml 4x SSC).
HINWEIS: Für Waschungen, gießen Sie die 10-15 ml direkt auf die pelleKobaltKügelchen anstelle von Pipettieren, wie Pipettieren führt dazu , dass die Perlen in das Innere der Pipette und Protein verloren gehen stecken. - Pellet die CB wieder durch Zentrifugation und dann die nächste geklärte Lysat (30 ml, was die 2. große induzierte Bakterienkultur) gießen auf den pelletiert CB. Inkubieren für weitere 20 min bei RT auf den Rotator und dann waschen zweimal mit 10-15 ml 4x SSC + BME. Pellet bei 110 xg für 5 min bei 4 ° C.
- Nach dem zweiten Waschen, aspirieren die Flüssigkeit und etwa 2 ml Perlen / Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu verlassen. Übertragung der proteingebundenen CB an einen vorgekühlten 2-ml-Röhrchen durchunter Verwendung einer 1 ml "wide-bore" Pipettenspitze.
HINWEIS: eine frische Rasierklinge Verwenden Sie das Ende der Spitze vor der Übertragung, da die Verwendung dieser "wide-bore" Pipettenspitze zu schneiden den Verlust von proteingebundenen Kobaltkügelchen reduzieren. - Zentrifuge kurz die Kügelchen in der 2 ml-Röhrchen mit hoher Geschwindigkeit (~ 18.000 · g) in einer Mikro bei 4 ° C (~ 5-10 s ist alles, was für eine schnelle Pelletierung erforderlich ist). Entfernen Sie vorsichtig und den Überstand durch Pipettieren verwerfen, man aufpassen, nicht die proteingebundenen CB zu verlieren.
- 1 mL CB Aufschlämmung (äquivalent zu einem 0,5 ml Volumen bead) zu jeder 50 ml-Röhrchen geklärte Bakterienlysat enthält. Inkubieren für 20 min bei RT auf einem Rotator.
- Eluieren rG4R1 von CB.
- Inkubieren der CB in 0,5 ml Histidin Elutionspuffer (HEB) auf einem Rotator für 5 min in einem kalten Raum. Auch wenn HEB Zugabe pipettieren nur die 0,5 ml auf die Kügelchen und resuspendieren die Perlen durch das Rohr Umkehren (CB Verlust zu beseitigen). HEB 0,7 M L-Histidin pH 6 (der pH-Wert eingestellt wird unter Verwendung von Essigsäure).
- Zentrifuge bei 18.000 xg in einer Mikrozentrifuge 4 ° C für 1 min. Den Überstandauf ein vorgekühltes 15 ml-Röhrchen. Sanft zu entfernen und das Protein enthaltende Überstand durch sorgfältiges Pipettieren zu übertragen, eine kleine Menge Flüssigkeit auf der Oberseite des CB zu verlassen.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.4.1 und 4.4.2 für insgesamt 3 HEB Eluierungen.
- Eluieren, einmal mit 0,2 M EDTA pH 6,0; die Farbe des CB wird von rosa bis weiß ändern, wenn die EDTA die Kobaltchelate.
- Nach dieser vierten und letzten Elution wurde mit dem 15 ml Röhrchen überführt wurde, pipettiert den Rest Elutionspuffer vom CB durch ein Gel-Ladespitze am Ende einer 1 ml-Pipettenspitze verwendet wird; indem die Spitze zum Boden des Röhrchens zu stürzen, Restproteinhaltigen Elutionspuffer gesammelt werden können.
- Binden Sie rG4R1 an G4-gebundenen SPB und rekombinante Enzym in einer ATP-abhängigen Weise eluieren.
- Bereiten 5x Res Puffer: 250 mM Tris-Acetat pH 7,8, 250 mM NaCl, 2,5 mM MgCl 2, und 50% Glycerol. Bereiten 3x Res Puffer: 0,915 ml H 2 O, 2 ml 5x Res Puffer, 0,33 ml 0,4% Lactalbumin (diluted von 4% Lactalbumin mit 1x Tris-Glycin), 0,010 ml BME, 0,015 ml 1 M MgCl 2, 0,050 ml PIC und 0,010 ml Leupeptin. Halten Sie sich auf dem Eis.
HINWEIS: Das Lager 4% Lactalbumin (w / v) zunächst durch Auflösen in 2 M Glycin pH 7,5, mit der weiteren Zugabe von 1x PIC und 0,05% Natriumazid hergestellt wird. - Pellet G4-SPB an der Seite des Rohres mit einem Magneten und den Überstand verwerfen (G4-SPB, wie in Schritt 4.2) hergestellt. 1 mL 3x Res Buffer zur G4-SPB und Pipette zu mischen.
- Pipette dieses 1 ml G4-SPB suspendiert in 3x Res Puffer in das 15 ml-Röhrchen mit ~ 2 ml proteinhaltigen HEB / EDTA (Eluat aus Schritt 4.4). Inkubieren für 15 min in einem 37 ° C warmen Wasserbad unter gelegentlichem Rühren, so dass die Perlen nicht absetzen.
- Auf Eis, pelletieren Sie die proteingebundenen G4-SPB an der Seite des Rohres mit einem Magneten. Zum Waschen 1 mL 4x SSC + 0,4% Lactalbumin (+ 0,5 ul / ml BME) und Pipette die Perlen zu resuspendieren. Pellet-Perlen mit ter Magnet auf Eis. Wiederholen Sie diese Wäsche für insgesamt 2 Wäschen.
HINWEIS: Geduld wird während des Waschvorgangs erforderlich zwischen Waschungen alle magnetischen Perlen wurden pelletiert wurden , um sicherzustellen , dass. Dies gilt insbesondere für die erhöhte Viskosität der Lösung, die infolge der Glycerin in den Res Puffer enthalten sind. - Waschen Sie die G4-SPB 1x mit 1 ml 3x Res puffern.
- Vorbereitung Elutionspuffer (EB): 0,5 ml 3x Res Puffer, 0,1 ml 0,1 M ATP, und 0,4 ml H 2 O.
- Vorwärmen 1 ml EB bis 37 ° C in PCR-Röhrchen über den Heizblock eines Thermocyclers auf 37 ° C eingestellt verteilt.
- Pellet G4-SPB mit dem Magneten auf Eis und resuspendieren die Perlen in 100 ul vorgewärmtes EB. Unmittelbar übertragen Sie die Perlen auf einer vorgewärmten PCR-Röhrchen und bei 37 ° C für 30 s inkubiert.
- 12 & mgr; l 5 M NaCl Unverzüglich hinzufügen und Pipette nach oben und unten kräftig 20 - 30 mal. Die Kombination der hohen Salz und ATP in der EB enthaltenendient rG4R1 von den G4-Perlen zu eluieren.
HINWEIS: Es ist sehr wichtig , die Anzahl von Blasen während des Pipettierprozeß gebildet zu minimieren, wie Blasen , die das Protein denaturieren können. - Unmittelbar Pellet die G4-SPB mit einem Magneten und übertragen das Protein enthaltenden Eluats in ein frisches PCR-Röhrchen auf Eis (mit dem Datum beschriftet).
- Wiederholen Sie die Elution und die Übertragung in den Schritten 4.5.8-4.5.10; Das Endprodukt dieses Verfahrens ist somit ~ 200 & mgr; l, enthaltend EB rG4R1 gereinigt. Nehmen Sie sich zwei 7 & mgr; l-Aliquots (in PCR-Röhrchen mit dem entsprechenden Datum beschriftet) für den Einsatz in der Qualitätskontrolle enzymatische Aktivität Test, testen, ob hochaktive rG4R1 hat in der Tat gereinigt worden.
- Speichern das gereinigte rG4R1 bei -80 ° C bis zum Zeitpunkt der Aktivitätstest.
- Bereiten 5x Res Puffer: 250 mM Tris-Acetat pH 7,8, 250 mM NaCl, 2,5 mM MgCl 2, und 50% Glycerol. Bereiten 3x Res Puffer: 0,915 ml H 2 O, 2 ml 5x Res Puffer, 0,33 ml 0,4% Lactalbumin (diluted von 4% Lactalbumin mit 1x Tris-Glycin), 0,010 ml BME, 0,015 ml 1 M MgCl 2, 0,050 ml PIC und 0,010 ml Leupeptin. Halten Sie sich auf dem Eis.
5. Qualitätskontrolle enzymatischen Aktivität Assay von gereinigtem rG4R1
- Für jede Zubereitung von rG4R1 getestet werden, bereiten 300 & mgr; lvon Resolvase Testpuffer (RAB), wobei jeweils 30 & mgr; l 0,2 pmol von TAMRA-markierten Z33 G4-DNA enthält (in Schritt 2) hergestellt; Die Zusammensetzung der RAB ist wie folgt: 0,1 ml 3x Res Puffer, 0,01 ml 0,2 pmol / & mgr; l G4-Z33-TAM, 0,03 ml 0,1 M ATP und 0,16 ml H 2 O. In einem Streifen von 6 PCR Rohre, Pipette 40 ul RAB in das erste Rohr und 30 ul RAB in die verbleibenden Rohre (halten an dieser Stelle die Röhrchen auf Eis).
- Rufen Sie eine der 7 ul rG4R1 Aliquots (aus Schritt 4.5.11) und legen Sie es auf Eis. Mit einer p20 Pipette auf 5 & mgr; l, Pipette vorsichtig nach oben und unten ein paar Mal in der aliquoten und Transfer 5 ul mit dem ersten Rohr des Streifens von 6 PCR-Röhrchen, die rG4R1 zu mischen (die, die 40 & mgr; l von RAB enthält). Danach können Sie die Pipette auf 10 & mgr; l und übertragen seriell 10 & mgr; l auf die verbleibenden Röhrchen PCR RAB enthält.
- Unmittelbar inkubieren diesen Streifen von PCR-Röhrchen bei 37 ° C für 30 min in einem thermischen Cycler von einem 4 ° C gehalten, gefolgt.Öffnen der Rohre, während sie bei 4 ° C gehalten werden und mit 2 ul 0,5 M EDTA pH 8 zu jedem Röhrchen (zum Anhalten der enzymatischen Reaktion).
- Gießen Sie eine 10% Acrylamid / 1x TBE / 10% Glycerin-Gel. Nach Entfernung des Kamms, waschen Sie die Vertiefungen mit 1x TBE. Werden 5 ul einer hoher Masse, hydrophiles Polysaccharid (30% Ficoll in H 2 O) in jedes Röhrchen und Last 15 ul aus jedem Röhrchen (die Beladung von Vertiefungen kann wieder beobachtet werden , unter Verwendung von Schlieren Linien).
- Als Kontrolle für G4-DNA Mobilität, fügen 4 ul einer hohen Masse aus hydrophilen Polysacchariden auf 20 & mgr; l RAB und Last 15 ul; als Kontrolle für die abgewickelte monomeren Z33, Wärme 20 ul RAB bei 98 ° C für 10 min, 4 hinzufügen ul einer hohen Masse aus hydrophilen Polysacchariden und Last 15 & mgr; l.
- Führen Sie das Gel bei 120 V für 2 h mit 1x TBE als Laufpuffer. Bild das Gel auf einem multimodalen Imager mit Fluoreszenz-Imaging-Fähigkeit TAMRA-spezifische Filter verwendet werden (erregen mit einem 532 nm grünen Laser und verwenden Sie einen 580 nm Bandpass-Filter 30 (580 BP 30)).
ANMERKUNG: Eine sehr aktive Vorbereitung von rG4R1 nachgeben vollständige Auflösung von TAMRA-markierten Z33 in den ersten drei Spuren , die auf das Gel geladen wurden, wie in Abbildung 2 dargestellt.
6. Pooling von Highly Active rG4R1 Preps, Aliquotierung und Lagerung
Hinweis: Dieser Schritt 2 Personen erfordert. Die Anzahl und die enzymatische Anforderungen der nachgeschalteten Assays, die das gereinigte rG4R1 verwendet wird, in die bestimmen, wie viele Präparate vor erforderlich sind, um Aliquotieren. Eine typische große Vorbereitung besteht aus der Zusammenlegung von 8 hochaktiven Zubereitungen (also insgesamt 16 induziert 500 ml Bakterienkulturen verwendet wird), aber dies ist eine willkürliche Zahl und Laborspezifisch.
- Berechnen des Gesamtvolumens der hochaktiven, gereinigt rG4R1, die zu aliquotiert ist. Typischerweise werden 7 & mgr; l Aliquots in Downstream-Assays verwendet. Füllen Sie den Block eines thermischen zykler auf 4 ° C mit PCR-Röhrchen Streifen (diese portioniert in sein wird, da die feste Natur des Blocks wird die rasche Schließung der PCR-Streifen beschleunigen).
- Rufen Sie die PCR-Röhrchen hochaktiven rG4R1 von -80 ° C enthält, und schnell die Röhrchen in der Hand auftauen; wenn eine kleine Menge an Eis in dem Rohr belassen wird, legen die Röhrchen auf Eis. Kombinieren Sie alle die schnell aufgetauten Präparate in eine vorgekühlte, 15 ml-Röhrchen und gut mischen, um sicherzustellen, Blasen zu minimieren.
- Unter Verwendung eines automatischen Repetierpipette, verzichtet die gewünschte aliquoten Volumen in die vorgekühlte PCR Streifen Rohre in den Thermocycler. Sobald 1-2 Streifen abgeschlossen sind, haben die zweite Person den Deckel schließen und sie auf 96-Well-Wafer, die in flüssigem Stickstoff schweben (Flash Einfrieren notwendig ist, die enzymatische Aktivität zu erhalten).
HINWEIS: Nehmen Sie nicht mehr als etwa 200 & mgr; l rG4R1 in die Spitze des automatischen Pipette in einer Zeit , die Zeit zu reduzieren , dass das Enzym nicht bei 4° C. - Sobald die vorgekühlten PCR-Streifen Röhrchen in den Thermocycler wurden mit Aliquots und richtig gefroren, schnell übertragen mehr vorgekühlte PCR-Streifen Rohre aus Eis zu den Thermocycler und weiterhin Aliquotierung gefüllt worden. Weiter auf diese Weise, bis der Rest des Enzyms wurde aliquotiert wurde, in flüssigem Stickstoff eingefroren, und an Trockeneis. Schließlich übertragen die Aliquoten bis -80 ° C zur Langzeitlagerung.
7. Die Quantifizierung von gereinigtem rG4R1 Konzentration
- Gießen Sie eine Standard-5% Stapeln / 12% Lösung Acrylamid / SDS-Gel zur Proteintrennung.
- Thaw etwa 50 & mgr; l aliquotiert rG4R1, verbinden sich zu einem Rohr, und gut mischen. Messen Sie die exakte Volumen mit einer Pipette und füge eine gleiche Menge von 2 x Laemmli-Probenpuffer (65,8 mM Tris-HCl pH 6,8, 26,3% (w / v) Glycerol, 2,1% SDS und 0,02% Bromphenolblau) + BME (50 ul / 950 & mgr; l 2x Laemmli-Puffer). Denaturiert das Protein bei 98 ° C für 10 min.
- Nehmen Sie den Kamm aus dem Gel und waschen Sie die Vertiefungen mit Standard 1x SDS / Glycin-Laufpuffer. Legen Sie das Äquivalent von 25 und 12,5 & mgr; l rG4R1 (die 50 und 25 & mgr; l des denaturierten Protein ist), obwohl das optimale Volumen von Enzym sollte zum Laden durch den Benutzer bestimmt werden, da die Konzentration der enzymatischen Zubereitungen variieren (beispielsweise 35 ul wurden auf dem Gel in Figur 3 geladen). Legen Sie die Protein-Standards, hergestellt in Schritt 7.3. Stellen Sie sicher, dass die Pipetten richtig kalibriert sind, und stellen Sie sicher, so präzise wie possib seinle mit Pipettiertechnik, um eine genaue Quantifizierung zu gewährleisten.
- Führen Sie das Gel bei 120 V, bis die Farbstofffront etwa 2/3 des Gels durchlaufen hat (um eine ordnungsgemäße Trennung der Proteine, die die breite Palette MW Marker bilden).
- Entfernen Sie das Gel und entsorgen Sie den Teil des Gels, das Protein nicht mit einem durch Schneiden sie weg Rasierklinge enthalten wird. Legen Sie das Gel in einem Glas Auflaufform oder eine Steckdose. Fleck des Gels mit Coomassie - Farbstoff (50 mg Coomassie R-250 pro 100 ml 50:10:40 v / v Methanol: Essigsäure: H 2 O , das durch ein Filterpapiertrichter filtriert wurde) O / N bei RT auf einem Orbitalschüttler Satz ausreichende Bewegung des Gels zu gewährleisten.
- De-Fleck das Gel mit 30:10:60 v / v Methanol: Essigsäure: H 2 O geballt-up, fusselfreies Seidenpapier mit Entfärben zu beschleunigen. Ändern Sie die Entfärbelösung nach Bedarf. Weiter Entfärben, bis der Hintergrund ausreichend niedrig ist rG4R1 und Proteinstandards zu visualisieren; ein typisches Gel bei dieserStufe ist in Abbildung 3 dargestellt.
- Legen Sie das entfärbt Gel zwischen einem Blattschutz und scannen Sie das Gel bei ≥300 dpi Auflösung. Öffnen Sie das gescannte Bild in einer Bildanalyse-Software-Programm (wie Fuji Multiguage oder gleichwertig) und bereiten Standardkurven aus den Protein-Standards, die 75, 100 entsprechen, und 150 kDa (die Kurven repräsentieren Gramm Mengen im Vergleich zu densitometrischen Messwerte). Stellen Sie sicher, dass der Hintergrund von jeder Spur zu subtrahieren während des Prozesses der Gewinnung densitometrischen Werte quantifiziert werden.
- Unter der Annahme, dass die Volumenmenge der rG4R1, die auf dem Gel enthält eine Menge von Protein geladen wurde, die im linearen Bereich dieser Standardkurven ist, geladen, um die Gramm Menge an Protein pro Mikroliter rG4R1 kann hochgerechnet werden.
- Wandeln die Extrapolation gram Menge rG4R1 in einer molaren Menge das Molekulargewicht des G4R1 Verwendung, was 120.000 g / mol.
HINWEIS: Für jedes Gel werden drei hochgerechneten Werte seinerzeugt (eine für jede der drei Protein-Marker verwendet, um die Standardkurven zu erzeugen: 75, 100 und 150 kDa). Führen Sie zwei weitere Gele und Fleck und zu quantifizieren, sie durch Schritte 7.1 Wiederholung - 7.10. Mit den Ergebnissen der Quantifizierung des ersten Gel, wird der Benutzer in der Lage sein, zu beurteilen, wie viel rG4R1 weiter Gele geladen werden muss, eine Menge zu ergeben, die innerhalb des linearen Bereichs der Proteinstandards ist. Insgesamt extrapolieren neun Werte, um die Konzentration von hochaktiven, gereinigt rG4R1 darstellt. Durchschnitt dieser Werte die endgültige chargenspezifische rG4R1 Konzentration zu ergeben, die typischerweise im Bereich von 20-100 nm liegt. Berechnen der Standardabweichung aus diesen Werten (n = 9).
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Representative Results
Dieses Protokoll (Abbildung 1) ergibt routinemäßig fast rein, katalytisch aktive rG4R1. Als Maß der enzymatischen Aktivität wird typischerweise beobachtet , dass 50% von 0,2 pmol von TAMRA-markierten tetra G4-DNA in Monomere innerhalb der 0,2 umgewandelt wird - 0,013 uL Bereich von rG4R1 durch die G4 - Aktivitätstest getestet , wie oben (Abbildung dargelegt 2). Coomassiefärbung von gereinigtem rG4R1 zeigt eine einzelne Bande bei der erwarteten 120 kDa Größe, mit einem kleinen verunreinigende Bande bei ~ 75 kDa, die rG4R1 abgeschnitten darstellen kann, dass seine Fähigkeit, G4-DNA Perlen beibehalten hat zu binden und in einem ATP-abhängigen zu eluieren Weise (Figur 3). Die Bande von Interesse ist gegen ein Protein Standardkurve quantifiziert, und dieses Protokoll erhält typischerweise 200 & mgr; l von 20-100 nM gereinigtem Enzym pro 1 l Bakterienkultur.
Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Zwei-Stufen - Reinigung von G4R1. Ein 6xHis-markierte rG4R1 ist bulk-gereinigt aus E. coli - Lysaten durch erste Bindung an und Eluieren von Co 2+ Perlen konjugierter. Ein Bindungsschritt zu G4-DNA-konjugierten magnetischen Kügelchen folgt. Schließlich wird eine ATP-abhängige Elutionsschritt notwendig, relativ rein und enzymatisch aktiven rG4R1 zu erhalten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Qualitätskontrolle G4-DNA Abwickeln Assay. Spuren 1 - 6: eine konstante Konzentration an TAMRA-markiertes tetra G4-DNA wurde für 30 min in Gegenwart von 4-fach serielle Verdünnungen von gereinigtem rG4R1 bei 37 ° C inkubiert repräsentiert 3,9 & mgr; l, 0,83 & mgr; l, 0,2 & mgr; l, 0,05 & mgr; l, 0,013 & mgr; l und 0 0,003 & mgr; l, respectively. Spur 7: tetra G4-DNA in Abwesenheit von rG4R1. Spur 8: tetra G4-DNA, die die G4-Struktur in Monomere in Abwesenheit von rG4R1 zu reduzieren gekocht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Die Quantifizierung von gereinigtem rG4R1 Konzentration. eine Standardkurve von Proteinkonzentrationen zu erzeugen bzw. 6, und wurden verwendet, - 500, 250, 125, 62,5, 31,3 und 15,7 ng in Bahnen 1: Breit-Bereich MW Proteinmarker wurden in den folgenden Mengen geladen. Lane 7 für 35 & mgr; l rG4R1. Dies wurde insbesondere Gel quantifiziert, im Rahmen eines dreifachen Satz von Gelen, in einer durchschnittlichen Proteinkonzentration von 62 ± 22 nM Standardabweichung resultierende (SD; N = 9)..com / files / ftp_upload / 55496 / 55496fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll stellt eine hocheffiziente Expression, Reinigung und Quantifizierung Schema für die Isolierung des DHX36 Genprodukts, G4-Resolvase1 (G4R1, auch Rhau und DHX36 genannt) (Abbildung 1). Dieses Protokoll verwendet zwei Reinigungsschritte: His-Tag Affinitätsreinigung an Kobalt Affinitätsbeads und enzymatische Reinigung auf G4-DNA-konjugierten Perlen. Der letzte Schritt ist einzigartig, da es die Vorteile der engen Affinität nimmt, hohe Spezifität und katalytische Aktivität, die Abwickeln rG4R1 für G4 Strukturen hat. Die enge Affinität für G4 Strukturen (K d im Nieder pM - Bereich) ermöglicht eine hohe Salzwäsche (nahe der Löslichkeitsgrenze von NaCl) vor der Elution von der G4 - Perlen, stark die Anwesenheit von unspezifischen Proteinen zu reduzieren. Die katalytische Aktivität von G4R1 auf G4 Strukturen ermöglicht die spezifische Elution des aktiven rG4R1 bei der Zugabe von ATP und MgCl 2. Dieses zweistufige Reinigungsschema konsequent produziert hochreine, Katalytisch aktive rG4R1 13 in Mengen geeignet für die meisten biochemischen Analysen.
Mehrere wichtige Schritte werden eine gute Ausbeute an hochreinem, katalytisch aktiven rG4R1 gewährleisten. Die erste ist, die richtigen Induktionsbedingungen von His-rG4R1 in dem bakteriellen Expressionsstamm zu gewährleisten. Wir haben gefunden, dass die beste Ausbeute an rekombinantem Protein tritt auf, wenn Zellen auf eine OD 600 von nicht mehr als 0,4 bis 0,6 vor der Induktion gerade gewachsen sind. die Zellen über diesen Punkt hinaus zu wachsen den Einbau von rG4R1 in inclusion bodies durch in einem Verlust von Proteingewinnung, möglicherweise führen kann. Zweitens erhält man eine höhere Konzentration an gereinigtem Protein, das durch "seriell-binding" den Lysaten der Kobalt Affinitätsbeads. Zum Beispiel gebunden wir das Lysat von 0,5 l induzierten Kulturen zu den Kobalt Affinitätsbeads und dann durchgeführt, eine zweite Bindung eines anderen Lysat von einer zusätzlichen 0,5 l der Kultur zu den gleichen Kobalt Affinitätsbeads. DiesSchritt sorgt für eine konzentriertere Herstellung von Protein, das durch die Anzahl der Moleküle rG4R1 zuzunehmen einem gegebenen Volumen von Perlen gebunden, wodurch die volle Kapazität der Kobalt Affinitätsbeads verwendet. Drittens gewährleistet die hohe Salzwäsche nach der Kobalt Affinität Elutionen an die G4 beads Bindungs dass nahezu alle nicht-spezifischen Protein an die Kügelchen Bindung entfernt wird. Viertens kann der ATP / MgCl 2 Elutionsschritt für rG4R1 an die G4 Kügelchen gebunden an katalytisch die tetra Struktur in Einzelstränge entspannen, rG4R1 verursacht von den Kügelchen freigesetzt werden. Wir können die Möglichkeit nicht ganz ausschließen, dass ATP rG4R1 in einem kompetitiven und nicht als katalytische Weise eluieren; Dies ist jedoch weniger wahrscheinlich , dass der Fall zu sein, da wir früher gezeigt haben , dass eine nicht-hydrolysierbare ATP - Analogon nicht ausreichend , um konkurrierend 13 Bindung 18. Die Affinität von rG4R1 für die abgewickelte, einzelsträngige DNA ist eine Größenordnung kleiner als ter beginnt tetra G4-DNA und damit rG4R1 sollte nicht erneut binden an die Kügelchen. Um diese Möglichkeit zu reduzieren, jedoch sollte dieser Schritt bei 37 ° C, und das Elutionsvolumen durchgeführt werden sollte so schnell wie möglich von den Perlen abgetrennt werden. Der Elutionsschritt wird zweimal wiederholt maximale Erholung zu gewährleisten. Wenn Downstream-Anwendungen, die das Protein benötigen frei von DNA-Verunreinigungen zu sein, empfehlen wir eine zusätzliche Bereinigungsschritt, bei dem das gereinigte Präparat wird neu gebunden an Streptavidin-Perlen, um alle biotinylierten DNAs zu entfernen, falls vorhanden.
Wir haben gefunden, daß rG4R1 anfällig für Abbau ist, wenn die richtigen Bedingungen nicht gesamten Protokoll gehalten. Um die Integrität und Aktivität des Enzyms zu erhalten, setzen wir die folgenden kritischen Garantien. Proteaseinhibitoren sind vorhanden während des Reinigungsverfahrens gehalten. Das Protokoll wird bei 4 ° C durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Das Protein wird in Gegenwart von la gereinigtctalbumin und β-Mercaptoethanol. Das Protokoll wird in einer angemessenen Frist (in 1 Tag für die Reinigung) durchgeführt. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen negativ auf die Aktivität des Proteins beeinflussen, so dass wir Aliquotierung das Protein in "den einmaligen Gebrauch," 7 & mgr; l-Aliquots nach der Reinigung und lagern Sie sie bei -80 ° C.
Obwohl die Anwesenheit von Lactalbumin in der Herstellung erforderlich ist, um die Integrität und Aktivität des Proteins aufrecht zu erhalten, wie oben erwähnt, haben wir festgestellt, dass dies auch Downstream-Anwendungen behindern. Andere potentielle störende Moleküle, die in der gereinigten rG4R1 Zubereitung enthalten sind, schließen ATP, β-Mercaptoethanol, und vereinzelt DNA. Zum Beispiel haben wir diese Proteinpräparat als unvereinbar mit BIAcore-Analyse aufgrund des hohen Hintergrundsignal von den Pufferkomponenten gefunden. Auch die Anwesenheit von Lactalbumin in der Proteinzubereitung schließt die Verwendung von Standard Bradfordund BCA Proteinquantifizierungsassays. Wir haben jedoch eine alternative Gelbasis Quantifizierungsverfahren zu umgehen diese Beschränkung entwickelt.
Dieses Reinigungsverfahren, welches die enzymatische Aktivität von G4R1 als Mittel nutzt, um es insbesondere zu reinigen, macht dieses Verfahren unterscheidet sich von anderen Verfahren. Zum Beispiel haben andere Gruppen FLAG-markiertes rG4R1 in menschlichen Zellen exprimierten 15, 25 oder GST-tagged rG4R1 in Insektenzellen 26 und gereinigt durch FLAG- oder GST-Affinitätschromatographie, respectively. Diese Verfahren haben den Vorteil, in einem eukaryontischen Expressionssystem durchgeführt wird, im Vergleich zu einem bakteriellen Expressionssystem. Geschätzte K d -Werte der resultierenden gereinigten GST-G4R1 für G4 Strukturen gefunden wurden eine Größenordnung höher sein 14 als unsere berichtete K d 12 Werte, 13. Wir schreiben this Diskrepanz in K d -Werte von Unterschieden , die mit einem voluminöseren GST-tag im Vergleich zu einem 6 × His-tag, Unterschiede in den Reinheiten aus diesen beiden Reinigungsschemata erhalten werden , und Unterschiede im Ausmaß und der Art der post-translationalen in einem bakteriellen erworbenen Modifikationen gegenüber einem Insekten-Expressionssystem. Unsere Vorgehensweise hat einen entscheidenden Vorteil gegenüber den zuvor genannten Alternativen, da die Reinigung dieses Proteins direkt auf seine enzymatische Aktivität Scharnieren. Daher erhält man in erster Linie ein Enzym, das in der Weise gefaltet und modifiziert wurde, die ihre enzymatischen Eigenschaften beibehält. Andere Affinität-tag und / oder Größenausschluss-Techniken können keine aktive Enzym aus enzymatisch toten Enzym zu trennen. Es wäre für zukünftige Protokollentwicklung nützlich sein , um die Stärken der anderen Gruppen "Reinigungsprotokolle kombinieren 15, 25, 26 (dh ein Mensch oder Insektenzelle expressIonen - System) mit der Stärke des Protokolls (dh Verbesserung katalytischer basierte Reinigung) weiter auf diese Methode.
Obwohl dieses Protokoll derzeit spezifisch für G4R1 ist, könnte es leicht zu allen ATP-abhängige, G4-Auflösungs Proteinen angepaßt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, BLM, WRN, FANCJ, hnRNP Proteine, hPif1 und / oder ChlR1 / DDX1. Durch Veränderung gebunden die Sequenz der Nukleinsäure an die Streptavidin-Kügelchen, könnte dieses Protokoll angepasst werden zu reinigen anderen ATP-abhängigen Nukleinsäure-Enzyme, für die das Produkt der enzymatischen Reaktion ist nicht länger ein Substrat für das Enzym, einschließlich Nukleinsäure-Helikasen und Nukleasen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten unsere Finanzierungsquellen zu danken, darunter ein großzügiges Geschenk von der Ware Foundation (auf JPV) Die National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (zu PJS), und der Ball State University Startfonds (zu PJS). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zu veröffentlichen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/mL in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/mL in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or from standard source |
| 1 M Tris-HCl, pH 7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or from standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH 7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or from standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or from standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or from standard source |
| 0.2 M EDTA, pH 6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or from standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | From standard source | ||
| 500 mL centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
References
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