Summary
G4 Resolvase1 liga-se a (G4) estruturas G-quadruplex com mais apertados afinidade reportada para uma proteína de ligação e G4 representa a maior parte da actividade de desenrolamento-G4 ADN em células HeLa. Nós descrevemos um protocolo romance que aproveita a afinidade e atividade desenrolamento dependente de ATP G4-Resolvase1 para purificar especificamente G4R1 recombinante cataliticamente ativo.
Abstract
estruturas de ácidos nucleicos de ordem superior chamado G-quadruplexes (G4S, estruturas G4) podem formar em regiões ricas em guanina de ADN e ARN e são altamente termicamente estável. Existem> 375.000 sequências formando-G4 putativos no genoma humano, e são enriquecidos em regiões promotoras, regiões não traduzidas (UTRs), e dentro da repetição telomérica. Devido ao potencial para estas estruturas de afectar os processos celulares, tais como a replicação e transcrição, a célula tem evoluído enzimas para geri-los. Uma tal enzima é uma resolvase G4 (G4R1), que foi co-bioquimicamente caracterizado pelo nosso laboratório e Nagamine et al. e verificou-se ligam-se muito bem para ambas G4-ADN-ARN e G4 (K d no intervalo de baixo pM). G4R1 é a fonte da maioria da actividade de resolução de G4 em lisados de células HeLa, e desde então sido implicada como desempenhando um papel no metabolismo dos telómeros, linfa desenvolvimento, a transcrição do gene, a hematopoiese, e vigilância imunitária. A capacidade de eftemente expressar e purificar cataliticamente activa G4R1 é de importância para os laboratórios interessados em ganhar mais conhecimento sobre a interação cinética das estruturas G4 e enzimas resolver G4. Aqui, nós descrevemos um método detalhado para a purificação de G4R1 recombinante (rG4R1). O procedimento descrito incorpora a purificação baseada em afinidade tradicional de uma enzima de histidina marcada com C-terminal expressa em bactérias com codões optimizados humanos com a utilização da capacidade de se ligar e rG4R1 relaxar G4-ADN para purificar a enzima altamente activo numa ATP etapa de eluição dependente. O protocolo também inclui um passo de controlo de qualidade em que a actividade enzimática da rG4R1 é medida examinando a capacidade da enzima purificada para relaxar G4-ADN. Um método é também descrito que permite a quantificação de rG4R1 purificado. adaptações alternativas deste protocolo são discutidos.
Introduction
estruturas G4 são estruturas secundárias de ácido nucleico altamente estáveis que se formam dentro de regiões ricas em guanina de ADN e ARN. Estruturas G4 são estabilizadas através de interacções de ligação de Hoogsteen-e coordenadas de ligação dentro da cavidade central com catiões monovalentes (isto é. De K + e Na +), que contribuem de forma significativa para a estabilidade térmica notável de estruturas G4 1, 2. Bioinformática estudos anteriores sugeriram que o genoma humano contém> 375.000 "potencial de formação de motivos G4" 3, 4. Estimativas mais recentes sugerem que o número de motivos G4 é maior por um factor de 2-5 5, enquanto outro estudo prevê 716,310 potenciais sequências formando-G4 distintos no genoma humano 6. G4-forming sequências são evolutivamente conservados e não disperso aleatoriamente emdo genoma. Motivos G4 são enriquecidos em regiões codificantes dos genes, e para cima de 40% de todos os promotores de genes contêm G4 motivos 7. Interessantemente, o grau de enriquecimento de motivos G4 em um gene tem sido demonstrada para sugerir a função do gene. Por exemplo, os proto-oncogenes e genes envolvidos no desenvolvimento têm significativamente maior enriquecimento de estruturas G4 do que os genes supressores de tumor 8, 9.
Com altas estabilidades térmicas, uma presença quase onipresente em todo o genoma, e o potencial de afetar significativamente principais processos celulares, não é surpreendente descobrir que a célula evoluiu enzimas para gerir essas estruturas. Uma tal enzima é G4 Resolvase1 (G4R1; também chamado RHAU e DHX36), o que foi caracterizado como a fonte da maioria da actividade resolver G4-ADN em tetramolecular (HeLa) 10 células humanas. Desde então, tem sido demonstrado THAt G4R1 liga firmemente e cataliticamente desenrola G4-DNA tetramolecular e unimolecular e G4-RNA com as mais apertadas KDs relatada para uma proteína de ligação G4 11, 12, 13. Além disso, a actividade de resolução de G4 do G4R1 tem sido implicada numa ampla gama de processos bioquímicos e celulares, incluindo a dos telómeros / telomerase Biology 11, 14, 15, 16, transcrição e de emenda 17, 18, 19, 20, de desenvolvimento 21, hematopoiese 21 e imune regulação 22, 23. Com uma preponderância de sequências G4 especificamente situado ao longo do genoma e a diversidade p celularrocesses que G4R1 recentemente foi implicado por estar envolvido com, a capacidade de expressar e eficiente purificar altamente ativa rG4R1 será da maior importância para a elucidação dos mecanismos bioquímicos e comportamentos desta proteína.
Aqui, nós demonstramos uma expressão nova e esquema de purificação (Figura 1) que tira proveito da, atividade de resolução de G4 dependente de ATP rG4R1 para isolar eficiente enzima ativa. Este esquema pode ser adaptado para purificar outras enzimas de ácidos nucleicos dependentes de ATP para o qual o produto da reacção enzimática não é mais um substrato para a ligação, como é o caso para G4R1.
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Protocol
1. Preparação de estruturas de ADN G4 a ser utilizado para a purificação de rG4R1 (Formação de ADN biotinilado G4-G-Quadruplex)
- Encomendar o seguinte oligômero DNA, chamado Z33-Bio, em uma escala �ole 1: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotina 3'. Assegure-se que a porção de biotina está na extremidade 3 'do oligómero.
- Preparar tampão 10x G4: Tris-HCl a 450, pH 8, EDTA 25 mM, e NaCl 2500 mM.
- Ressuspender o oligómero Z33 em 250 mL de água (de modo que a concentração oligómero é ~ 2,5 mM). Adicionar 25 ul de tampão 10X G4 e misturar. Incubar o oligómero a 50 ° C durante ~ 48 h.
- Resumidamente girar o tubo para recolher a condensação (~ 1.000 xg, 10 s). Adicionar ~ 50 ul de uma massa de alta, polissacárido hidrófilo (30% de Ficoll em H 2 O) e misturar. Pour um gel de 10% acrilamida / 1x TBE / 10% de glicerol (dimensões de gel: 16 cm x 16 cm x 1 mm). Uma vez que o gel é polimerizado, lave os poços com TBE 1x e cargao formado Z33-Bio oligômero uniformemente em toda a maior parte do gel (pista carregamento de amostras podem ser visualizados com linhas Schlieren).
- Em uma pista no final do gel, carregar uma pequena fracção do oligómero que foi aquecida a 98 ° C durante 10 minutos (isto irá servir como um controle não estruturados), bem como uma pequena quantidade de corante de carregamento de gel noutro pista para monitorar o quão longe o gel foi executado.
- Use TBE 1x como o tampão de gel de correr e rodar o gel a 120 V até a frente do corante tenha atravessado pelo menos 1/3 do gel.
- Coloque uma placa de cromatografia em camada fina com a sua face para cima lado áspero em um protetor da folha (ou cubra com filme plástico). Retirar uma das placas de vidro e transferência do gel para a superfície do protector de folha. Desligue as luzes e sombra UV gel (de longo comprimento de onda: 365 nm). Usar uma lâmina de barbear fresco e cortar a faixa G-quadruplex-Z33-Bio, que irá ser visto como sendo executado na parte superior do gel (que tem mobilidade mais lenta) em relação à massa fundidacontrole ed.
- Coloque a fatia de gel contendo o ADN G4-formada num tubo de 50 mL e adicionar tampão de imersão apenas o suficiente para cobrir a fatia de gel (tampão de imersão consiste em 1/3 do volume de 10x TBE, 1/3 do volume de acetato de sódio saturada, e 1/3 volume de H2O). Colocar o tubo num banho a 37 ° C incubadora (nonhumidified) e incubar O / N.
- Transferir a solução para um tubo de 15 mL e adicionar 1/10 do volume de glicogénio (glicogénio estoque a 20 mg / mL em Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 2,5 mM, pH 8, e 0,05% de azida de sódio) e ~ isopropanol 1,2x .
NOTA: A azida sódica é altamente tóxico, assim use com cuidado!- Misturar e colocar o tubo à temperatura de -20 ° C durante pelo menos 2 h. Girar o tubo em 2.700 xg numa centrífuga de mesa arrefecida a 4 ° C durante 12 min. Suavemente decantar a solução do G4-ADN sedimentado. Lava-se a pelete 3 vezes com EtOH a 70% + 50 mM de NaCl (o sal na lavagem é crítica para a estabilidade G4). Wick o excesso de líquido com papel de tecido que não solte fiapos.
- Lugar, colocaro sedimento lavado no frigorífico durante pelo menos 2 horas para hidratar o sedimento e permitem a ressuspensão fácil. Ressuspender o sedimento em 50 mL de tampão TNE (10 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 50 mM, e 0,05 mM de EDTA, pH 8).
- Coloque 5 mL deste ADN G-quadruplex formado em 495 mL de H 2 O e quantificar, usando um espectrofotómetro, que permite que o coeficiente de extinção a ser determinada introduzindo a composição de nucleótidos do oligómero (o coeficiente de extinção do oligómero de ADN Z33 com um composição de base de A = 8, C = 3, G = 15, e T = 7 é 341.946 L / mol / cm). Digite o fator de diluição como 25 (não 100), como o formado G-quadruplex consiste em 4 fitas de DNA.
- Alíquota o volume equivalente de 3 ODS (OD 260 unidades) por tubo e armazenar a -20 ° C; Por exemplo, se as 5 mL, que foram adicionados a 495 mL de H2O dá uma OD 260 de leitura 3, em seguida, preparar aliquotas de 5 uL.
2. Preparação de estruturas de ADN G4 para ser utilizado num ensaio Actividade Enzimática de rG4R1 (Formação de TAMRA-rotulados G4-ADN)
- Encomendar o seguinte oligômero DNA, chamado Z33-TAM, em uma escala �ole 1: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Assegure-se que a porção TAMRA está na extremidade 5 'do oligómero.
- Seguir o mesmo processo como descrito na Secção 1 para a formação do G-quadruplex, excepto que a luz ultravioleta (UV) sombreamento não é necessário porque o tetrametilrodamina (TAMRA) marcado com G-quadruplex será facilmente visível a olho nu. Mais uma vez, certifique-se de incluir um controle derretida no gel.
- Depois de tomar uma leitura do espectrofotómetro ADN G-quadruplex TAMRA-marcado, tal como no passo 1, dilui-se a G-quadruplex formada para 0,2 pmol / uL com tampão TNE. Finalmente, adicionar glicerol a uma concentração final de 10% e armazenar a -20 ° C.
3. Transformar (DE3) pLysS competentes com PTRiEx4-DHX36 (plasmídeo G4R1 Humano) e crescer / Induzir grandes culturas bacterianas
- Obter o plasmídeo TriEx4-DHX36.
- Alíquota as bactérias em alíquotas de 20 ul e armazená-las a -80 ° C. Alíquota o meio SOC (2% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM e glucose 20 mM) em 80 mL alíquotas e armazenar a -80 ° C.
- Prepare carbenicilina (CARB) / cloranfenicol (CAM) placas de LB-agar. As concentrações de Stock de carb e CAM são de 50 mg / ml em H 2 O e 35 mg / mL em EtOH a 70%, respectivamente, e estes são 1.000x concentrada; Assim, as concentrações finais nas placas de selecção de agar LB 50 ug / mL e 35 ug / ml, respectivamente.
- Colocar uma alíquota de bactérias em gelo e coloque uma alíquota de meio SOC à TA. Adicionar 1 ug de plasmídeo pTriEx4-DHX36 para as bactérias e agite suavemente com a ponta da pipeta para misturar. Incubar em gelo durante mais 5 min e em seguida choque térmico a 42 & #176; C durante 30 s. Colocar em gelo durante 2 min e adicionar o meio SOC.
- Placa as bactérias transformadas sobre placas de selecção pré-aquecida (tipicamente, placa um pequeno volume, tal como 5 - 10 mL, para garantir a baixa densidade de colónia de modo que as colónias individuais podem ser facilmente em grandes culturas inoculadas) e incubar a 37 ° CO / N.
- Prepare Terrific Broth de acordo com as instruções do fabricante 24. Faça 500 ml por frasco grande (certifique-se de adicionar glicerol) e autoclave em um ciclo líquida curta.
- Adicionar CARB / CAM (50 ug / mL / 35 ng / mL) para o caldo e depois inocular as culturas de agar, tendo tampões (usando uma pipeta P1000) contendo uma única colónia bacteriana e pipetando para o caldo. Agitar as culturas vigorosamente para arejar-los e, em seguida, incubar as culturas a 37 ° CO / N sem agitação.
- No dia seguinte, coloque as culturas em um agitador C 37 ° e agitar a ~ 225 rpm. Crescem as culturas até o OD 600 é cerca de 0,4 -0,6, que irá tipicamente ter cerca de 4-6 horas, dependendo da densidade celular inicial.
NOTA: Isto irá exigir um acompanhamento densidade periódica através de leituras espectrofotométricas, e isso é fundamental para não crescem as culturas a muito acima de 0,5 ods. Como um branco para leituras espectrofotométricas, girar para baixo 1 ml de bactérias e utilizar o caldo clarificado como a solução de apagamento. - Uma vez que a OD 600 adequada é obtida, colocar imediatamente as culturas em gelo e rapidamente arrefecer os a 10 ° C. Monitorar a temperatura usando um termômetro limpo com etanol 70%. Acelerar o resfriamento girando rapidamente os frascos, enquanto no gelo, pois isso irá limitar ainda mais o crescimento bacteriano antes da indução de proteínas recombinantes.
- Adicionar IPTG até uma concentração final de 1 mM (~ 120 mg / 500 mL de cultura) e em seguida, agitar a 80 rpm a 14 ° C durante ~ 17-18 h. A temperatura ideal para a indução da proteína foi encontrada para ser 14 ° C; para melhor atingir isso, use um agitador loc banho de água arrefecidaado numa sala fria convencional e verificar manualmente a temperatura do banho de água com um termómetro.
NOTA: Como alternativa, usar um refrigerado a ar agitador / incubadora, embora seja necessário testar o digitalmente-set ajuste de temperatura irá produzir a temperatura do líquido desejada (teste esta por incubação num balão de água com um termómetro nele e agitação a 80 rpm por algumas horas, ajustando a temperatura digital de definição de acordo até 14 ° C é atingida). - Coloque as culturas no gelo e resfriá-los rapidamente, como no passo 3.9. Dê uma pequena alíquota de bactérias e tomar um OD 600 leitura; idealmente, as culturas terá dobrado durante a indução até cerca de 0,8-1,2 OD 600.
- Transferir as bactérias para 500 tubos mL de centrífuga e equilibrá-los manualmente usando cultura bacteriana para equilibrar o peso entre os tubos. Uma vez equilibrado, centrifugar-los em 3840 xg durante 20 min a 4 ° C. Deitar fora o caldo clarificado e congelar a pel bacterianadeixa-se a -80 ° C até ao momento da purificação de proteínas.
4. Purificação de rG4R1 Humana
- Descongelar e lisar peletes bacterianas.
- Descongelar o sedimento bacteriano em 3 ml de tampão TN à TA (tampão TN consiste em Tris 100 mM, pH 7,5 e NaCl 50 mM). Manter as garrafas na mão e agite para descongelar / colocar o agregado bacteriano. Uma vez descongeladas e de modo relativamente uniforme suspenso, levar o volume até 5 ml com tampão TN (nova suspensão pode ser realizado através pipetando para cima e para baixo com uma pipeta 5).
NOTA: É típico para descongelar / prep 2 ou 4 garrafas no dia da preparação, dependendo do nível do usuário de conforto com o procedimento de purificação. - Dissolve-se 20 mg de lisozima em 250 mL de H 2 O (por cultura) e para adicionar as bactérias em suspensão. Permitir que a lisozima de digerir as bactérias para ~ 5 - 10 min enquanto agita as garrafas na mão.
NOTA: A cor do SUSpensão começará a clarear um pouco como a digestão prossegue, e a suspensão será relativamente não-viscoso. Se as culturas forem demasiado cheio (isto é, muito maior do que 1,2 OD 600), em seguida, ADN cromossómico bacteriano pode causar viscosidade indesejável nesta fase. - Adicionar 250 uL de mistura de inibidores de protease (PIC) e uma alíquota de 10 uL de leupeptina. Homogeneizar.
- Coloque no gelo e adicione 10 ml de tampão TN fria e 22 mL de BME. Transferir para um tubo de 50 mL.
- Sonicate as bactérias no gelo com um sonicador digitais definido para 30% da amplitude. Pulso em 2 s ON e 2 s OFF durante 1 min. Repetir a sonicação 3 vezes, permitindo que as amostras a arrefecer em gelo durante pelo menos 2 minutos entre as etapas de sonicação.
NOTA: Com múltiplas culturas, sonicate um de cada vez antes de repetir as iterações de sonicação. Durante sonicação, ter o cuidado de manter a ponta sonicação suficientemente submerso no lisado bacteriano, mas não tocar the os lados do tubo, como isso vai gerar calor em excesso. - Adicionar um volume igual (15 ml) frio de SSC 4x + 20 ul de BME + 50 uL de uma aliquota + PIC de leupeptina e misturar.
- Em uma centrífuga de mesa pré-arrefecida a 4 ° C, centrifugar os lisados a 2.300 xg durante 20 min. Transferir o sobrenadante para tubos frescos 50, pré-arrefecida ml (um tubo por grande cultura a ser preparado).
- Descongelar o sedimento bacteriano em 3 ml de tampão TN à TA (tampão TN consiste em Tris 100 mM, pH 7,5 e NaCl 50 mM). Manter as garrafas na mão e agite para descongelar / colocar o agregado bacteriano. Uma vez descongeladas e de modo relativamente uniforme suspenso, levar o volume até 5 ml com tampão TN (nova suspensão pode ser realizado através pipetando para cima e para baixo com uma pipeta 5).
- Prepare esferas G4-magnético.
- Tome 1 mL de talão estreptavidina paramagnética (SPB) suspensão (por 1 L de cultura) e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. SPB sedimentar as com um magneto e lavar 2x com SSC 2x + EDTA 5 mM, pH 8. Ressuspender o SPB lavados em 200 mL da mesma solução usada para a lavagem das pérolas.
- Adicionar um 3 OD alíquota de-DNA G4 (Z33-Bio G4 preparada no ponto 1) para a suspensão SPB e misture rapidamente pipetando cima e para baixo várias vezes. Colocar os tubos num rotor gire e à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos (e até 60 minutos).
- à réer esse período de rotação, bloquear o SPB-bound G4, adicionando 1 ml de 0,4% de lactalbumina, e manter em gelo até ser necessária. Dilui-se a lactalbumina a 0,4% a partir do estoque de lactalbumina 4% usando 1x Tris-glicina.
NOTA: O% lactalbumina estoque 4 (w / v) é inicialmente preparado por dissolução em 2 M de glicina, pH 7,5, com a adição posterior de 1x PIC e 0,05% de azida de sódio.
- Bind histidina marcada com rG4R1 a contas de cobalto (CB) (continuação da etapa 4.1).
- Adicionar 1 mL de lama de CB (equivalente a um volume de cordão 0,5 mL) a cada tubo de 50 ml contendo lisado clarificado bacteriana. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo.
NOTA: o volume do grânulo de 0,5 mL é utilizado por 1 L de lisado clarificado; por exemplo, se dois 500 culturas bacterianas mL são preparadas, só adicionar CB para o tubo de 50 mL contendo lisado clarificado a partir de uma das culturas a este ponto, como o lisado a partir da segunda cultura vai ser ligado em série com a mesma 0,5 ml de CB em rep 4.3.3). - Girar CB a 110 xg durante 5 min num 4 ° C mesa centrífuga. Aspirar o líquido cuidadosamente, e deixar um par mL de líquido de modo a não perturbar a CB sedimentadas. Lavar com 10-15 mL de frio 4x SSC + BME (0,5 mL de BME / mL de 4x SSC).
NOTA: Para as lavagens, verter a 10-15 ml directamente sobre as pérolas peletizadas de cobalto em vez de pipetagem, aquando da pipetagem fará com que os grânulos para ficar preso para o interior da pipeta e a proteína irá ser perdida. - Agregar a CB novamente através de centrifugação e em seguida despeje a próxima ligado clarificado (30 mL, representando a 2ª grande cultura bacteriana induzida) na CB peletizada. Incubar durante mais 20 min a RT no rotor e, em seguida, lavar duas vezes com 10-15 mL de 4x SSC + BME. Pelete a 110 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Após a segunda lavagem, aspirar o líquido e deixar cerca de 2 mL de grânulos / líquido na parte inferior do tubo. Transferir a CB ligado às proteínas para um tubo pré-arrefecida de 2 ml pelausando um 1 mL "wide-bore" ponta da pipeta.
NOTA: Usar uma lâmina de barbear para cortar fresco a fim de a ponta antes da transferência, tal como o uso desta "grande calibre" ponta de pipeta irá reduzir a perda de pérolas de cobalto ligado a proteína. - Resumidamente centrifugar as esferas no tubo de 2 mL em alta velocidade (~ 18.000 xg) numa microcentrífuga a 4 ° C (~ 5 - 10 s é tudo o que é necessário para a granulação rápida). Remova cuidadosamente e descartar o sobrenadante por pipetagem, tomando cuidado para não perder o CB ligado às proteínas.
- Adicionar 1 mL de lama de CB (equivalente a um volume de cordão 0,5 mL) a cada tubo de 50 ml contendo lisado clarificado bacteriana. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo.
- Eluir rG4R1 de CB.
- Incubar a CB em 0,5 ml de tampão de eluição histidina (Hb) num agitador rotativo durante 5 minutos numa sala fria. Mais uma vez, quando se adiciona HEB, apenas os 0,5 ml pipeta sobre as esferas (para eliminar a perda de CB) e ressuspender as esferas invertendo o tubo. HB é de 0,7 M de L-histidina pH 6 (o pH é ajustado com ácido acético).
- Centrifuga-se a 18000 xg numa microcentrífuga a 4 ° C durante 1 min. Transferir o sobrenadantea um pré-arrefecida tubo de 15 ml. Suavemente remover e transferir o sobrenadante que continha a proteína por pipetagem cuidadosa, deixando uma pequena quantidade de líquido na parte superior do CB.
- Repita os passos 4.4.1 e 4.4.2 para um total de 3 eluições HEB.
- Elui-se uma vez com 0,2 M de EDTA, pH 6,0; a cor do CB irá mudar de cor de rosa para branco como o EDTA quela o cobalto.
- Depois desta quarta e última eluição foi transferido para o tubo de 15 ml, pipetar o tampão de eluição a partir do CB residual utilizando uma ponta de gel de carga na extremidade de uma pipeta de 1 mL de ponta; mergulhando a ponta para a parte inferior do tubo, de tampão de eluição contendo a proteína residual pode ser recolhido.
- Ligam-se a rG4R1 SPB-bound G4 e eluir a enzima recombinante de uma forma dependente de ATP.
- Prepare Res 5x Tampão: 250 mM de Tris-acetato, pH 7,8, NaCl 250 mM, MgCl 2 2,5 mM e glicerol a 50%. Preparar tampão de 3x Res: 0,915 mL de H2O, 2 mL de 5x Tampão Res, 0,33 mL de 0,4% de lactalbumina (diluted de 4% de lactalbumina com 1x Tris-glicina), 0,010 mL de BME, 0,015 mL de 1 M de MgCl2, 0,050 mL de PIC, e 0,010 mL de leupeptina. Manter em gelo.
NOTA: O% lactalbumina estoque 4 (w / v) é inicialmente preparado por dissolução em 2 M de glicina, pH 7,5, com a adição posterior de 1x PIC e 0,05% de azida de sódio. - Pellet G4-SPB para o lado do tubo com um magnete e desprezar o sobrenadante (G4-SPB, tal como preparado no passo 4.2). Adicionar 1 ml de 3x Tampão Res ao G4-SPB e pipeta para misturar.
- Pipetar este 1 mL de G4-SPB suspensas em tampão 3x Res para dentro do tubo 15 mL contendo ~ 2 mL de HB / EDTA contendo proteína (eluato a partir do passo 4.4). Incubar por 15 min em um 37 ° C banho de água com agitação ocasional para que as esferas não se contentar.
- Em gelo, sedimentar a proteína ligada a G4-SPB para o lado do tubo com um íman. Para lavar, adicionar 1 mL de 4x SSC +% lactalbumina 0,4 (+ 0,5 mL / mL BME) e pipeta para voltar a suspender as esferas. grânulos de pellets com tele ímã em gelo. Repita esta lavagem para um total de 2 lavagens.
NOTA: A paciência é necessária durante o processo de lavagem para assegurar que todas as pérolas magnéticas foram sedimentadas entre lavagens. Isto é especialmente verdadeiro tendo em conta o aumento da viscosidade da solução, devido ao glicerol contido nos buffers Res. - Lava-se a G4-SPB 1x com 1 ml de tampão de 3x Res.
- Preparar tampão de eluição (EB): 0,5 mL de Tampão de 3x Res, 0,1 mL de 0,1 M de ATP e 0,4 mL de H 2 O.
- Pré-aquecido 1 ml de EB para 37 ° C em tubos de PCR distribuídos em todo o bloco de aquecimento de um termociclador ajustado para 37 ° C.
- Pellet G4-SPB com o íman em gelo e voltar a suspender as pérolas em 100 mL de EB pré-aquecido. Imediatamente transferir os grânulos a um tubo de PCR pré-aquecido e incubar durante 30 s a 37 ° C.
- Prontamente adicionar 12 mL de NaCl 5 M e pipeta cima e para baixo vigorosamente 20 - 30 vezes. A combinação da elevada de sal e ATP contido no EBserve para eluir rG4R1 das G4-grânulos.
NOTA: É muito importante para minimizar o número de bolhas formadas durante o processo de pipetagem, como as bolhas podem desnaturar a proteína. - sedimentar imediatamente o G4-SPB com um ímã e transferir o eluato contendo proteína para um tubo de PCR fresco no gelo (rotulados com a data).
- Repetir a eluição e transferência descrito nos passos 4.5.8-4.5.10; o produto final deste processo é, portanto, ~ 200 mL de EB contendo purificados rG4R1. Separe duas 7 mL alíquotas (em tubos de PCR marcados com a data adequada) para uso no ensaio de actividade enzimática de controle de qualidade que irá testar se rG4R1 altamente ativa, de fato foi purificado.
- Armazenar o rG4R1 purificado a -80 ° C até ao momento do ensaio de actividade.
- Prepare Res 5x Tampão: 250 mM de Tris-acetato, pH 7,8, NaCl 250 mM, MgCl 2 2,5 mM e glicerol a 50%. Preparar tampão de 3x Res: 0,915 mL de H2O, 2 mL de 5x Tampão Res, 0,33 mL de 0,4% de lactalbumina (diluted de 4% de lactalbumina com 1x Tris-glicina), 0,010 mL de BME, 0,015 mL de 1 M de MgCl2, 0,050 mL de PIC, e 0,010 mL de leupeptina. Manter em gelo.
5. Controle de Qualidade enzimática Ensaio de Actividade de Purificada rG4R1
- Para cada preparação de rG4R1 a ser ensaiada, preparar 300 uLde tampão de ensaio resolvase (RAB), onde cada um contém 30 mL de 0,2 pmol de ADN G4-Z33 TAMRA-rotulado (preparada na etapa 2); a composição do RAB é como se segue: 0,1 ml de Tampão 3x Res, 0,01 mL de 0,2 pmol / uL G4-Z33-TAM, 0,03 mL de ATP 0,1 M e 0,16 mL de H 2 O. Em uma faixa de 6 de PCR tubos de pipetas, 40 mL de RAB para dentro do primeiro tubo e 30 ul de RAB para os restantes tubos (manter os tubos em gelo, neste ponto).
- Recuperar uma das alíquotas de 7 mL rG4R1 (do passo 4.5.11) e colocá-lo em gelo. Com uma pipeta de p20 ajustado para 5 uL, gentilmente pipeta cima e para baixo algumas vezes para misturar o rG4R1 na alíquota e de transferência 5 uL ao primeiro tubo da tira de 6 tubos de PCR (aquele que contém 40 mL de RAB). Em seguida, defina a pipeta de 10 mL e transferir serialmente 10 mL para os tubos de PCR restantes contendo RAB.
- Incubar imediatamente esta tira de tubos de PCR a 37 ° C durante 30 minutos num termociclador, seguidos por uma espera 4 ° C.Abrir os tubos, enquanto eles estão a ser realizadas a 4 ° C e adiciona-2 ul de EDTA 0,5 M pH 8 para cada tubo (para parar a reacção enzimática).
- Pour um gel de TBE / 10% de glicerol a 10% de acrilamida / 1x. Depois de retirar o pente, lave os poços com TBE 1x. Adicionar 5 uL de uma massa de alta, polissacárido hidrófilo (30% de Ficoll em H 2 O) a cada tubo e da carga 15 ul de cada tubo (a carga de poços pode ser novamente observada com linhas Schlieren).
- Como um controlo para a mobilidade de ADN G4, adicionar 4 mL de uma massa elevada, polissacárido hidrofílico para 20 mL de RAB, e carga de 15 ul; como um controlo para desenrolada Z33 monomérica, de calor 20 mL de RAB a 98 ° C durante 10 min, adicionar 4 mL de uma massa elevada, polissacárido hidrófilo, e carga de 15 ul.
- Submeter o gel a 120 V durante 2 horas com TBE 1x como o tampão de corrida. Imagem do gel em um imager multimodal com capacidade de fluorescência de geração de imagens usando filtros TAMRA-específico (excitar com um laser verde nm 532 e usar um 58banda 0 nm passar 30 filtro (580 BP 30)).
NOTA: Uma preparação altamente activa de rG4R1 irá produzir a resolução completa de Z33 TAMRA-marcado nas 3 primeiras pistas que foram carregados sobre o gel, como se mostra na Figura 2.
6. Agrupamento de Highly Active rG4R1 Preps, alíquotas, e Armazenamento
NOTA: Este passo requer 2 pessoas. O número e requisitos enzimáticas dos ensaios a jusante que o rG4R1 purificado serão utilizados em vai determinar quantos preparações são necessários antes de alíquotas. Uma preparação típica grande consiste no agrupamento de 8 preparações altamente activa (utilizando, portanto, um total de 16 culturas bacterianas induzidas 500 ml), mas este é um número arbitrário e é específico do laboratório.
- Calcular o volume total de rG4R1 altamente activos, purificada que é para ser aliquotado. Tipicamente, 7 mL alíquotas são utilizados em ensaios de jusante. Encha o bloco de um CYCL térmicaer definido para 4 ° C com os tubos de PCR tira (estes serão divididas em alíquotas para, como a natureza sólida do bloco irá acelerar o fechamento rápido das tiras de PCR).
- Recuperar os tubos de PCR contendo rG4R1 altamente ativa de -80 ° C e rapidamente descongelar os tubos na mão; quando uma pequena quantidade de gelo é deixado no tubo, colocar os tubos em gelo. Combinar todos os preparativos rapidamente descongelado em um, 15 tubo prechilled mL e misture bem, certificando-se de minimizar bolhas.
- Usando uma pipeta de repetição automática, dispensar o volume da alíquota desejado no pré-refrigerada tira tubos de PCR no ciclizador térmico. Assim que 1 - 2 tiras são concluídas, tem a segunda pessoa feche as tampas e transferi-los para wafers de 96 poços que estão flutuando em nitrogênio líquido (flash congelamento é necessário para preservar a atividade enzimática).
NOTA: Não tome mais do que cerca de 200 mL de rG4R1 para a ponta da pipeta automática numa altura para reduzir o tempo que a enzima não é de 4° C. - Uma vez que os tubos previamente arrefecido de tira de PCR no ciclizador térmico ter sido preenchido com alíquotas e congelada adequadamente, transferir rapidamente os tubos de PCR mais tiras pré-refrigerada de gelo para o termociclador e continuar alíquotas. Continuar desta forma até que o restante da enzima foi aliquotada, rapidamente congelados em azoto líquido, e transferido para gelo seco. Finalmente, transferir as aliquotas a -80 ° C para armazenamento a longo prazo.
7. Quantificação de Purificada Concentração rG4R1
- Despeje um padrão de 5% de empilhamento / 12% resolver acrilamida gel / SDS para a separação de proteínas.
- Thaw cerca de 50 mL de rG4R1 alíquotas, combinam em um tubo, e misture bem. Medir o volume exacto com uma pipeta e adicionar uma quantidade igual de tampão de amostra 2x Laemmli (Tris-HCl 65,8 pH 6,8, 26,3% (w v) de glicerol /, 2,1% SDS, e 0,02% de azul de bromofenol) + BME (50 uL / 950 uL de tampão de Laemmli 2x). Desnaturar a proteína a 98 ° C durante 10 min.
- Remover o pente do gel e lave os poços com tampão de corrida / glicina SDS 1x padrão. Carregar o equivalente de 25 e 12,5 mL de rG4R1 (que é de 50 e 25 uL de proteína desnaturada), embora o volume óptimo da enzima a carga deve ser determinada pelo utilizador, como a concentração das preparações enzimáticas irá variar (por exemplo, 35 mL foi carregado no gel na Figura 3). Carregar os padrões proteicos preparados na etapa 7.3. Certifique-se de que as pipetas estão devidamente calibrado, e certifique-se de ser tão precisa quanto possible com técnica de pipetagem para assegurar a quantificação exacta.
- Submeter o gel a 120 V até a frente do corante tiver percorrido cerca de 2/3 do gel (para assegurar uma separação adequada das proteínas que constituem os marcadores de largo espectro MW).
- Remover o gel e dispor da porção do gel que não contêm proteína, cortando-a com uma lâmina de barbear. Coloque o gel em uma caçarola de vidro ou um recipiente equivalente. Corar o gel com corante Coomassie (50 mg de Coomassie R-250 por 100 mL de 50:10:40 v / v de metanol: ácido acético: H2O que foi filtrada através de um funil de filtro de papel) O / N à TA num conjunto agitador orbital de assegurar agitação adequada do gel.
- De-manchar o gel com 30:10:60 v / v metanol: ácido acético: H2O usando balled-up, papel de tecido que não solte fiapos para agilizar descoloração. Alterar a solução de descoloração, conforme necessário. Continue descoloração até que o fundo é suficientemente baixo para visualizar padrões rG4R1 e proteína; um gel típico nestefase é mostrado na Figura 3.
- Coloque o gel descorados entre um protetor da folha e digitalizar o gel a resolução ≥300 dpi. Abra a imagem digitalizada em um programa de imagem de software de análise (como Fuji Multiguage ou equivalente) e preparar curvas padrão a partir dos padrões de proteínas que correspondem a 75, 100 e 150 kDa (as curvas representam os valores gram contra leituras densitométricos). Certifique-se de subtrair o fundo de cada pista a ser quantificados durante o processo de obtenção de valores densitométricos.
- Supondo que a quantidade de volume de rG4R1 que foi carregada sobre o gel contém uma quantidade de proteína que está dentro da gama linear das curvas padrão, a quantidade de proteína por grama de microlitro rG4R1 carregados podem ser extrapolados.
- Converter a quantidade de gramas extrapolada rG4R1 em uma quantidade molar com o peso molecular de G4R1, que é de 120.000 g / mol.
NOTA: Para cada gel, três valores extrapolados serágerado (um para cada um dos três marcadores proteicos utilizados para gerar as curvas padrão: 75, 100, e 150 kDa). Executar mais dois géis e mancha e quantificá-los, repetindo os passos 7,1-7,10. Com os resultados de quantificação para o primeiro gel, o utilizador irá ser capaz de medir quanto rG4R1 precisa de ser carregado em géis mais para se obter um valor que se encontra dentro do intervalo linear de os padrões de proteína. No total, nove extrapolar os valores que representam a concentração de altamente activo, rG4R1 purificada. Calcular a média destes valores para dar a concentração rG4R1 específica do lote final, que é tipicamente na gama de 20-100 nM. Calcular o desvio padrão a partir destes valores (n = 9).
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Representative Results
Este protocolo (Figura 1) rotineiramente produz quase puro, rG4R1 cataliticamente ativo. Como uma medida da actividade enzimática, que é tipicamente observado que 50% de 0,2 pmol de G4-ADN tetramolecular TAMRA-marcado é convertido em monómeros dentro do 0,2 - gama uL 0,013 de rG4R1, como ensaiado pelo ensaio de actividade G4 acima referido (Figura 2). Coloração com Coomassie de rG4R1 purificada indica uma única banda no 120 tamanho esperado kDa, com uma banda contaminante menor a ~ 75 kDa, o que pode representar truncado rG4R1 que manteve a sua capacidade para se ligarem grânulos-ADN G4 e para eluir num dependente de ATP modo (Figura 3). A banda de interesse foi quantificado contra uma curva padrão de proteína, e este protocolo obtém tipicamente de 200 uL de 20-100 nM de enzima purificada por 1 L de cultura de bactérias.
Figura 1: Representação esquemática de uma purificação em dois passos de G4R1. A rG4R1 6xHis-marcado é maior purificada a partir de lisados de E. coli pela primeira ligação e eluição de Co 2+ -conjugated esferas. Um passo de ligação a esferas magnéticas-G4-ADN conjugado segue. Finalmente, um passo de eluição dependente de ATP é necessário para obter e relativamente puro rG4R1 enzimaticamente activa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: controle de qualidade G4-DNA desenrolamento de Ensaio. Pistas 1-6: uma concentração constante de G4-ADN tetramolecular TAMRA-marcado foi incubado a 37 ° C durante 30 minutos na presença de diluições em série de 4x de rG4R1 purificados representando 3,9 mL, 0,83 mL, 0,2 mL, 0,05 mL, 0,013 mL , e 0 0,003 mL, respectivamente. Pista 7: G4-ADN tetramolecular na ausência de rG4R1. Pista 8: G4-ADN tetramolecular fervida para reduzir a estrutura G4 em monómeros na ausência de rG4R1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação de Purificada Concentração rG4R1. De gama alargada marcadores de proteína de PM foram carregadas nas quantidades seguintes: 500, 250, 125, 62,5, 31,3, e 15,7 ng nas pistas 1 - 6, respectivamente, e foram usadas para gerar uma curva padrão de concentrações de proteína. Pista 7 representa 35 ul de rG4R1. Este gel foi quantificado em particular, como parte de um conjunto em triplicado de géis, resultando numa concentração de proteína média de 62 ± 22 nM desvio padrão (SD; N = 9)..com / files / ftp_upload / 55496 / 55496fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo representa uma expressão, purificação e quantificação regime altamente eficiente para o isolamento do produto do gene DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, também chamado RHAU e DHX36) (Figura 1). Este protocolo utiliza dois passos de purificação: His-tag de purificação por afinidade em esferas de afinidade de cobalto e purificação enzimática em grânulos-G4-ADN conjugado. O último passo é o único que aproveita a afinidade apertado, alta especificidade e atividade catalítica desenrolamento que rG4R1 tem para estruturas G4. A afinidade apertado para estruturas G4 (K d no intervalo de baixo pM) permite uma lavagem altamente salina (próximo do limite de solubilidade de NaCl) antes da eluição a partir das pérolas G4, reduzindo grandemente a presença de proteínas não-específicos. A actividade catalítica de G4R1 em estruturas G4 permite a eluição específica de rG4R1 activa mediante a adição de ATP e MgCl2. Este esquema de purificação de dois passos de forma consistente produz altamente pura, Cataliticamente activa rG4R1 13 em quantidades adequadas para a maioria das análises bioquímicas.
Vários passos-chave irá garantir um bom rendimento de elevada pureza, rG4R1 cataliticamente ativo. A primeira é a de assegurar as condições de indução adequadas de His-rG4R1 na estirpe de expressão bacteriana. Verificou-se que o melhor rendimento de proteína recombinante ocorre quando as células são crescidas até uma DO600 de não mais do que 0,4-0,6 imediatamente antes da indução. Crescer as células para além deste ponto pode resultar numa perda global de recuperação de proteína, possivelmente devido à incorporação de rG4R1 em corpos de inclusão. Por outro lado, obteve-se uma concentração mais elevada de proteína purificada por "serialmente-binding" os lisados para os grânulos de cobalto de afinidade. Por exemplo, nós ligado o lisado proveniente de 0,5 L de culturas induzidas para os grânulos de afinidade de cobalto e, em seguida, realizada uma segunda ligação de outro lisado proveniente de um adicional 0,5 L de cultura para os mesmos grânulos cobalto afinidade. estepasso garante uma preparação mais concentrada de proteína através do aumento do número de moléculas ligadas rG4R1 para um dado volume de grânulos, utilizando, assim, a capacidade total dos grânulos de cobalto de afinidade. Em terceiro lugar, a lavagem altamente salina após a ligação das eluições cobalto afinidade para os grânulos G4 garante que quase toda a proteína de ligação não específica aos grânulos é removido. Em quarto lugar, o passo de eluição ATP / MgCl 2 permite rG4R1 ligada às pérolas G4 para relaxar cataliticamente a estrutura tetramolecular em cadeias simples, causando rG4R1 para ser liberado a partir das esferas. Não podemos descartar por completo a possibilidade de que ATP elui rG4R1 em um competitivo ao invés de uma maneira catalítica; No entanto, este é menos provável de ser o caso, uma vez que demonstrámos anteriormente que um análogo de ATP não hidrolisáveis, não é suficiente para a ligação competitiva 13, 18. A afinidade de rG4R1 para o desenrolado, o DNA de cadeia simples é uma ordem de grandeza menor do que o tele começando G4-DNA tetramolecular, e, assim, rG4R1 não deve re-ligar às esferas. De modo a reduzir esta possibilidade, no entanto, este passo deve ser feito a 37 ° C, e o volume de eluição deve ser separado das pérolas tão rapidamente quanto possível. O passo de eluição é repetido duas vezes para assegurar a recuperação máxima. Se aplicações requerem a jusante da proteína para ser livre de contaminantes de DNA, é recomendável um passo adicional de limpeza em que a preparação purificada é re-ligado a esferas de estreptavidina, a fim de remover qualquer ADN biotinilados, se estiver presente.
Verificou-se que rG4R1 é susceptível de sofrer degradação, se as condições apropriadas não forem mantidas ao longo do protocolo. A fim de manter a integridade e actividade da enzima, que empregam as seguintes ressalvas críticos. Os inibidores de protease são mantidos presente durante todo o procedimento de purificação. O protocolo é realizada a 4 ° C, salvo indicação em contrário. A proteína é purificada na presença de lactalbumin e β-mercaptoetanol. O protocolo é realizada de uma forma atempada (em 1 dia para a purificação). Além disso, verificou-se que vários ciclos de congelamento-descongelamento impactar negativamente a actividade da proteína, de modo que a proteína alíquota em "uma única utilização", 7 mL alíquotas a seguir à purificação e armazená-las a -80 ° C.
Embora seja necessária a presença de lactalbumina na preparação para manter a integridade e actividade da proteína, como mencionado acima, verificou-se que este também pode impedir aplicações a jusante. Outros potenciais moléculas interferentes que estão presentes na preparação rG4R1 purificado incluem ATP, β-mercaptoetanol, e o ADN de cadeia simples escolhido. Por exemplo, verificou-se esta preparação de proteínas a ser incompatível com a análise de BIACORE devido ao sinal de fundo elevado a partir dos componentes do tampão. Além disso, a presença de lactalbumina na preparação de proteína impede a utilização de Bradford padrãoe ensaios de quantificação de proteína BCA. No entanto, temos desenvolvido um método de quantificação de gel à base de alternativa para contornar esta limitação.
Este procedimento de purificação, que aproveita a actividade enzimática de G4R1 como um meio para purificá-lo especificamente, faz com que este método distinto de outros métodos. Por exemplo, outros grupos expressaram marcado com FLAG em células humanas rG4R1 15, 25 ou rG4R1 marcado com GST em células de insecto 26 e purificou-se por isso FLAG- ou cromatografia de afinidade de GST-, respectivamente. Estes métodos têm a vantagem de ser feito num sistema de expressão eucariótico em comparação com um sistema de expressão bacteriano. Estimativa dos valores de Kd do resultante purificada GST-G4R1 para estruturas de G4 foram encontrados para ser de uma ordem de magnitude maior do que a nossa 14 K d relatados os valores de 12, 13. Atribuímos this discrepância nos valores de Kd a diferenças associadas a um GST-tag mais volumoso contra um 6xHis-tag, as diferenças nos graus de pureza obtidos a partir desses dois esquemas de purificação, e diferenças na extensão e tipo de modificações pós-traducionais adquirido em uma bacteriana contra um sistema de expressão de insecto. A nossa abordagem tem uma vantagem distinta sobre as alternativas acima referidas, porque a purificação desta proteína depende directamente a sua actividade enzimática. Por conseguinte, obtém-se principalmente uma enzima que foi dobrado e modificado de tal maneira que mantém as suas propriedades enzimáticas. Outras técnicas de afinidade-tag e / ou de exclusão de tamanho são incapazes de separar a enzima activa a partir de enzima enzimaticamente mortos. Seria útil para o desenvolvimento futuro protocolo para combinar os pontos fortes de protocolos de purificação de outros grupos 15, 25, 26 (ou seja, um expresso célula humana ou insetosistema de ião) com a força do nosso protocolo (isto é, catalítico à base de purificação) para melhorar ainda mais mediante este método.
Embora este protocolo é actualmente específico para G4R1, que poderia ser facilmente adaptado a qualquer, proteínas dependentes de ATP-resolver G4, incluindo, mas não se limitando a, BLM, WRN, FANCJ, proteínas PRNhn, hPif1, e / ou ChlR1 / DDX1. Ao alterar a sequência do ácido nucleico ligado às esferas de estreptavidina, este protocolo pode ser adaptado para purificar outras enzimas de ácidos nucleicos dependentes de ATP para o qual o produto da reacção enzimática não é um substrato para a enzima, incluindo helicases e ácidos nucleicos nucleases.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer aos nossos fontes de financiamento, incluindo uma oferta generosa da Fundação Ware (a JPV), Os Institutos Nacionais de HealthGrant T32-CA079448 (a PJS), e os fundos de arranque Ball State University (para PJS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/mL in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/mL in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or from standard source |
| 1 M Tris-HCl, pH 7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or from standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH 7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or from standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or from standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or from standard source |
| 0.2 M EDTA, pH 6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or from standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | From standard source | ||
| 500 mL centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
References
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