Summary
G4 Resolvase1 binder till G-quadruplex (G4) strukturer med de snävaste rapporterade affinitet för en G4-bindande protein och representerar majoriteten av G4-DNA avlindning aktivitet i HeLa-celler. Vi beskriver en ny protokoll som utnyttjar affinitet och ATP-beroende avveckling aktivitet av G4-Resolvase1 att specifikt rena katalytiskt aktivt rekombinant G4R1.
Abstract
Högre ordningens nukleinsyrastrukturer kallas G-quadruplexes (G4S G4 strukturer) kan bildas i guanin-rika regioner av både DNA och RNA och är mycket termiskt stabil. Det finns> 375.000 förmodade G4 bildande sekvenser i det mänskliga genomet, och de anrikas i promotorregioner, oöversatta regioner (UTR), och inom telomer upprepa. På grund av risken för dessa strukturer att påverka cellulära processer, såsom replikation och transkription, har cellen utvecklats enzymer för att hantera dem. Ett sådant enzym är G4 resolvas 1 (G4R1), som biokemiskt samarkännetecknas av vårt laboratorium och Nagamine et al. och fann att binda mycket tätt till båda G4-DNA och G4-RNA (Kd i låga pM range). G4R1 är källan till de flesta av G4-lösa aktivitet i HeLa-cellysat och har sedan dess varit inblandad för att spela en roll i telomer metabolism, lymfa utveckling, gentranskription, blodbildningen och immunövervakning. Förmågan att EFligt uttrycka och rena katalytiskt aktiv G4R1 är av betydelse för laboratorier som är intresserade av att få ytterligare insikt i den kinetiska interaktionen mellan G4 strukturer och G4-lösa enzymer. Här beskriver vi en detaljerad metod för rening av rekombinant G4R1 (rG4R1). Det beskrivna förfarandet omfattar den traditionella affinitetsbaserad rening av en C-terminal histidin-märkta enzym uttryckt i humana kodonoptimerade bakterier med utnyttjande av förmågan hos rG4R1 att binda och koppla G4-DNA för att rena starkt aktivt enzym i en ATP- beroende elueringssteg. Protokollet innefattar även en kvalitetskontrollsteg där den enzymatiska aktiviteten hos rG4R1 mäts genom att undersöka förmågan hos det renade enzymet för att koppla G4-DNA. En metod beskrivs också som möjliggör för kvantifiering av renat rG4R1. Alternativa anpassningar av detta protokoll diskuteras.
Introduction
G4 strukturer är mycket stabila nukleinsyra-sekundärstrukturer som bildar inom guanin-rika regioner av DNA och RNA. G4 strukturer stabiliserade via Hoogsteen-bindningsinteraktioner och samordna bindning inom det centrala hålrummet med monovalenta katjoner (dvs. K + och Na +) som väsentligt bidrar till den anmärkningsvärda termiska stabiliteten hos G4 strukturer 1, 2. Tidiga bioinformatik studier tyder på att det humana genomet innehåller> 375.000 "potentiella G4 bildande motiv" 3, 4. Nyare studie uppskattningar tyder på att antalet G4 motiv är högre med en faktor av 2-5 Maj, medan en annan studie förutspår 716,310 distinkta potentiella G4 bildande sekvenser i det mänskliga genomet 6. G4 bildande sekvenser är evolutionärt konserverade och inte slumpmässigt dispergerade igenomet. G4 motiv anrikas i genen kodande regioner, och uppemot 40% av alla genpromotorer innehåller G4 motiv 7. Intressant nog har graden av anrikning av G4 motiv i en gen som visats för att föreslå den funktionen av genen. Till exempel, proto-onkogener och gener som är involverade i utveckling har betydligt större anrikning av G4 strukturer än tumörsuppressorgener 8, 9.
Med hög termisk stabilitet, ett nästan allmänt förekommande inom genomet, och potentialen att signifikant påverka viktiga cellulära processer, är det förvånande att finna att cellen har utvecklats enzymer för att hantera dessa strukturer. Ett sådant enzym är G4 Resolvase1 (G4R1; även kallad RHAU och DHX36), som vi kännetecknas som källa för huvuddelen av tetramolecular G4-DNA lösa aktivitet i humana (HeLa) celler 10. Sedan dess har det visats that G4R1 tätt binder och katalytiskt unwinds tetramolecular och unimolekylär G4-DNA och G4-RNA med de trängsta rapporterade KDer för en G4-bindande protein 11, 12, 13. Dessutom har G4-lösa aktiviteten av G4R1 implicerats i ett brett spektrum av biokemiska och cellulära processer, inklusive telomer / telomeras biologi 11, 14, 15, 16, transkription och splitsning 17, 18, 19, 20, utveckling 21, hematopoes 21, och immunreglering 22, 23. Med en övervikt av G4 sekvenser specifikt belägen i hela genomet och de olika cellulära processes att G4R1 har nyligen varit inblandad för att vara med, förmågan att uttrycka och effektivt rena högaktiv rG4R1 kommer att vara av yttersta vikt för att klargöra de biokemiska mekanismer och beteenden hos detta protein.
Här visar vi en ny uttryck och reningsschema (Figur 1) som utnyttjar ATP-beroende, G4-lösa aktivitet rG4R1 att effektivt isolera aktivt enzym. Detta system skulle kunna anpassas för att rena andra ATP-beroende nukleinsyra-enzymer för vilka produkten av den enzymatiska reaktionen är inte längre ett substrat för bindning, vilket är fallet för G4R1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av G4-DNA-strukturer som ska användas för rening av rG4R1 (Bildning av biotinylerat G4-DNA G-quadruplex)
- Beställ följande DNA-oligomer, som kallas Z33-Bio, vid en 1 umol-skala: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3'. Säkerställa att biotindelen är vid 3'-änden av oligomeren.
- Förbereda 10x G4-buffert: 450 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA och 2500 mM NaCl.
- Resuspendera Z33 oligomeren i 250 mikroliter vatten (så att oligomeren koncentrationen är ~ 2,5 mM). Tillsätt 25 mikroliter av 10x G4 buffert och blanda. Inkubera oligomeren vid 50 ° C under ~ 48 timmar.
- snurra kort ner röret för att samla kondensationen (~ 1000 xg, 10 s). Lägg ~ 50 mikroliter av en hög massa, hydrofila polysackarid (30% Ficoll i H2O) och blanda. Häll en 10% akrylamid / 1x TBE / 10% glycerol gel (gel dimensioner: 16 cm x 16 cm x 1 mm). När gelen polymeriseras, tvätta brunnarna med 1x TBE och lastden bildade Z33-Bio oligomer jämnt över större delen av gelén (prov körfält belastning kan visualiseras med Schlieren linjer).
- I ett körfält vid slutet av gelén, ladda en liten fraktion av oligomeren som har upphettats vid 98 ° C under 10 min (denna kommer att fungera som en ostrukturerad kontroll), samt en liten mängd av gelpåföringsfärgämne i en annan körfält för att övervaka hur långt gelen har körts.
- Använd 1x TBE som gelen kör buffert och köra gelen vid 120 V tills färgfronten har passerat minst 1/3 av gelén.
- Placera en tunnskiktskromatografisk platta med sin grova sidan uppåt i en ark skydd (eller täck med plastfolie). Ta bort en av glasplattorna och överföra gelén till ytan av arket skyddet. Släck lampor och UV skugga gelen (lång våglängd: 365 nm). Använda ett färskt rakblad och klipp ut G-quadruplex-Z33-Bio bandet, som kommer att ses som att köra högre upp i gelén (som har långsammare mobilitet) i förhållande till smältaned kontroll.
- Placera gelskivan innehållande den bildade G4-DNA i en 50 ml rör och tillsätt bara tillräckligt soaking buffert för att täcka gelskivan (blötläggning buffert består av 1/3 volym 10x TBE, mättad 1/3 volym natriumacetat, och 1/3 volym H2O). Placera röret i en 37 ° C inkubator (nonhumidified) och inkubera O / N.
- Överför lösningen till en 15 ml rör och tillsätt 1/10 volym glykogen (glykogen lager på 20 mg / ml i 10 mM Tris-HCl pH 8, 2,5 mM EDTA pH 8 och 0,05% natriumazid) och ~ 1,2x volym isopropanol .
OBS: Natriumazid är akut giftig, så använd med försiktighet!- Blanda och placera röret vid -20 ° C under minst 2 h. Snurra röret vid 2700 xg i en bordscentrifug kyldes till 4 ° C under 12 min. Häll försiktigt lösningen från pelleterat G4-DNA. Tvätta pelleten 3 gånger med 70% EtOH + 50 mM NaCl (saltet i tvätt är kritisk för G4 stabilitet). Veke bort överflödig vätska med luddfritt mjukpapper.
- Platsden tvättade pelleten i kylskåp i minst två timmar för att återfukta pelleten och möjliggöra enklare blandning. Återsuspendera pelleten i 50 mikroliter av TNE-buffert (10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl och 0,05 mM EDTA pH 8).
- Placera 5 mikroliter av denna bildade DNA G-quadruplex i 495 | il H2O och kvantifiera genom användning av en spektrofotometer som gör att extinktionskoefficienten som skall bestämmas genom att ange nukleotidsammansättning av oligomeren (extinktionskoefficienten för den Z33 DNA-oligomer med en baskomposition av A = 8, C = 3, G = 15, och T = 7 är 341946 L / mol / cm). Komma in i utspädningsfaktor 25 (ej 100), som den bildade G-quadruplex består av 4 strängar av DNA.
- Alikvotera volymekvivalent av 3 OD (OD 260 enheter) per rör och förvara vid -20 ° C; till exempel om de 5 mikroliter som sattes till 495 mikroliter av H2O ger en OD 260 läsning av 3, sedan förbereda 5 | il alikvoter.
2. Framställning av G4-DNA-strukturer som ska användas i en enzymatisk aktivitet Analys av rG4R1 (Bildning av TAMRA-märkt G4-DNA)
- Beställ följande DNA-oligomer, som kallas Z33-TAM, vid en 1 umol-skala: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Säkerställa att TAMRA-delen är vid 5'-änden av oligomeren.
- Följ samma procedur som beskrivs i avsnitt 1 för bildandet av G-quadruplex, förutom att ultraviolett (UV) skuggning är inte nödvändigt eftersom tetrametylrodamin (TAMRA) -märkt G-quadruplex kommer att vara lätt synlig med blotta ögat. Återigen, se till att inkludera en smält kontroll på gelén.
- Efter att ha tagit en spektrofotometer läsning av TAMRA-märkta DNA G-quadruplex, såsom i steg 1, späd bildade G-quadruplex till 0,2 pmol / | il med TNE-buffert. Slutligen, tillsätt glycerol till en 10% slutlig koncentration och förvara vid -20 ° C.
3. Transform (DE3) pLysS Competent Cells med PTRiEx4-DHX36 (plasmid som kodar för humant G4R1) och växa / Framkalla Stora bakteriekulturer
- Skaffa TriEx4-DHX36 plasmid.
- Alikvot bakterierna i 20 pl alikvoter och lagra dem vid -80 ° C. Alikvotera SOC-medium (2% trypton, 0,5% jästextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO 4, och 20 mM glukos) i 80 ul alikvoter och förvara vid -80 ° C.
- Förbered karbenicillin (CARB) / kloramfenikol (CAM) LB-agarplattor. Förrådskoncentrationer av CARB och CAM är 50 mg / ml i H2O och 35 mg / ml i 70% EtOH, respektive, och dessa är 1,000x koncentrerade; Sålunda är de slutliga koncentrationerna i LB-agar selektionsplattor är 50 | ig / ml och 35 mikrogram / ml, respektive.
- Placera en alikvot av bakterier på is och placera en portion av SOC-medium vid RT. Lägg 1 pg av pTriEx4-DHX36 plasmid till bakterierna och snurra försiktigt med pipettspetsen för att blanda. Inkubera på is under ytterligare fem minuter och sedan värmechock vid 42 & #176; C under 30 s. Placera på is under 2 minuter och tillsätt SOC-mediet.
- Plätera de transformerade bakterierna på förvärmda selektionsplattor (typiskt, plattan en liten volym, såsom från 5 till 10 | il, för att säkerställa låg kolonidensitet, så att enstaka kolonier lätt kan inokuleras i stora kulturer) och inkubera vid 37 ° CO / N.
- Förbered Terrific Broth enligt tillverkarens anvisningar 24. Gör 500 ml per stor flaska (se till att lägga glycerol) och autoklav på en kort flytande cykel.
- Lägg CARB / CAM (50 | ig / ml / 35 ^ g / ml) till buljongen och sedan ympa odlingarna genom att ta agarpluggar (med användning av en P1000 pipett) innehållande en enda bakteriekoloni och pipettering in i buljongen. Snurra kulturerna kraftfullt för att lufta dem och sedan inkubera kulturer vid 37 ° CO / N utan skakning.
- Nästa dag, placera kulturerna i en 37 ° C skakapparat och skaka vid ~ 225 rpm. Växer kulturerna tills OD 600 är ca 0,4 -0,6, vilket typiskt tar ca 4-6 h, beroende på den ursprungliga celltätheten.
OBS: Detta kommer att kräva regelbunden övervakning densitet via spektrofotometriska avläsningar, och det är viktigt att inte odla kulturer mycket över 0,5 OD. Som en blank för spektrofotometriska avläsningar, spinn ner en ml av bakterier och använda den klargjorda buljongen som släcklösning. - När väl den korrekta OD 600 erhålles, omedelbart placera kulturerna på is och snabbt kyla dem till 10 ° C. Övervaka temperaturen med en termometer torkas med 70% EtOH. Påskynda kylning genom att snabbt vrida kolvarna medan på is, eftersom detta kommer att begränsa ytterligare bakterietillväxt före rekombinant protein induktion.
- Lägga IPTG till en 1 mM slutkoncentration (~ 120 mg / 500 ml kultur) och sedan skaka vid 80 rpm vid 14 ° C under ~ 17-18 timmar. Den idealiska temperaturen för proteininduktion har visat sig vara 14 ° C; att bäst uppnå detta använder en kyld vattenbad shaker located i en konventionell kylrum och kontrollera temperaturen på vattenbadet med en termometer manuellt.
OBS: Du kan också använda en luftkyld shaker / inkubator, även om det är nödvändigt att testa vad digitalt inställd temperaturinställningen kommer att ge den önskade vätsketemperaturen (test detta genom att inkubera en kolv med vatten med en termometer i den och skakning vid 80 varv per minut under några timmar, justerar den digitala temperaturinställningen i enlighet med den 14 ° C uppnåtts). - Placera kulturerna på is och svalka dem snabbt, såsom i steg 3,9. Ta en liten portion av bakterier och ta en OD 600 läsning; Helst ska kulturerna har fördubblats under induktion till omkring 0,8-1,2 OD 600.
- Överför bakterierna till 500 ml centrifugrör och manuellt balansera dem med bakteriekultur att jämna vikten mellan rören. När balanserad, centrifugera dem vid 3840 xg under 20 minuter vid 4 ° C. Häll av klar buljong och frysa bakterie pellåter vid -80 ° C fram till tidpunkten för proteinrening.
4. Rening av humant rG4R1
- Tina och lysera bakteriepellets.
- Tina den bakteriella pelleten i 3 ml TN-buffert vid RT (TN-buffert består av 100 mM Tris pH 7,5 och 50 mM NaCl). Håll flaskorna i handen och snurra för att tina / suspendera bakteriella pelleten. När tinats och relativt jämnt svävande, bringa volymen upp till 5 ml med TN-buffert (ytterligare fjädring kan åstadkommas via pipettera upp och ned med en 5 ml pipett).
OBS: Det är typiskt att tina / prep antingen 2 eller 4 flaskor på dagen för beredning, beroende på användarens nivå av komfort med reningsförfarandet. - Lös 20 mg lysozym i 250 mikroliter av H2O (per kultur) och lägg till resuspenderade bakterierna. Låt lysozym att smälta bakterierna för ~ 5-10 minuter medan virvlande flaskorna i handen.
OBS: Färgen på suspension kommer att börja lätta något som matsmältningen fortskrider, och suspensionen kommer att vara relativt icke-viskös. Om kulturerna är alltför stora, (dvs mycket större än 1,2 OD 600), sedan kromosomala bakteriellt DNA kan orsaka oönskad viskositet i detta skede. - Tillsätt 250 mikroliter av proteashämmare cocktail (PIC) och en 10 mikroliter alikvot av leupeptin. Blanda omsorgsfullt.
- Placera på is och tillsätt 10 ml kall TN-buffert och 22 pl BME. Överföring till en 50 ml rör.
- Sonikera bakterierna på is med en digital sonikator inställd på 30% amplitud. Puls vid 2 s PÅ och 2 s AV under 1 min. Upprepa sonikering 3 gånger, vilket gör att proverna svalna på is under åtminstone 2 min mellan sonication steg.
OBS: Med flera kulturer, sonikera var och en i tur och ordning innan upprepa sonication iterationer. Under ultraljudsbehandling, vara noga med att hålla ultraljudsspetsen tillräckligt nedsänkt i det bakteriella lysatet, men inte röra the sidorna av röret, eftersom detta kommer att generera överskottsvärme. - Tillsätt en lika volym (15 ml) av kall 4x SSC + 20 mikroliter av BME + 50 mikroliter av PIC + 1 alikvot av leupeptin och blanda.
- I en bordscentrifug för-kyldes till 4 ° C, centrifugera lysaten vid 2300 xg under 20 min. Överför supernatanten till nya, förkyld 50 ml rör (1 tub per stor kultur som prepped).
- Tina den bakteriella pelleten i 3 ml TN-buffert vid RT (TN-buffert består av 100 mM Tris pH 7,5 och 50 mM NaCl). Håll flaskorna i handen och snurra för att tina / suspendera bakteriella pelleten. När tinats och relativt jämnt svävande, bringa volymen upp till 5 ml med TN-buffert (ytterligare fjädring kan åstadkommas via pipettera upp och ned med en 5 ml pipett).
- Förbereda G4-magnetiska pärlor.
- Ta 1 ml streptavidin paramagnetisk pärla (SPB) suspension (per 1 L kultur) och överföra den till en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Pelletera SPB med en magnet och tvätta 2x med 2 x SSC + 5 mM EDTA pH 8. Resuspendera den tvättade SPB i 200 mikroliter av samma lösning som används för tvättning av pärlorna.
- Tillsätt en 3 OD delmängd av G4-DNA (Z33-Bio G4 framställd i avsnitt 1) till SPB fjädring och blanda snabbt genom att pipettera upp och ned flera gånger. Placera rören på en rotator och rotera vid RT under minst 30 min (och upp till 60 min).
- Akterer denna period av rotation, blockera G4 bundna SPB genom att tillsätta 1 ml 0,4% laktalbumin, och hålla på is tills det behövs. Späd 0,4% laktalbumin från 4% laktalbumin lager med hjälp av 1x Tris-glycin.
OBS: lager 4% laktalbumin (vikt / vol) initialt framställas genom upplösning i 2 M glycin pH 7,5, med ytterligare tillsats av 1x PIC och 0,05% natriumazid.
- Bind histidin-taggade rG4R1 till kobolt pärlor (CB) (fortsättning från steg 4,1).
- Tillsätt 1 mL CB uppslamning (ekvivalent med en 0,5 ml vulst volym) till varje 50 ml rör innehållande klar bakterielysat. Inkubera under 20 min vid RT på en rotator.
OBS: 0,5 ml bead volym används per 1 L av klarnat lysat; t.ex. om två 500 ml bakteriekulturer framställs, bara lägga CB till 50 ml rör innehållande klarnat lysat från en av odlingarna vid denna punkt, som lysat från andra kulturen kommer att vara i serie bundna med samma 0,5 ml CB i step 4.3.3). - Spinn ner CB vid 110 xg under 5 min i en 4 ° C bordscentrifug. Aspirera vätska noggrant, och lämna ett par ml vätska för att inte störa det pelleterade CB. Tvätta med 10-15 ml kall 4x SSC + BME (0,5 pl BME / ml 4x SSC).
OBS: För tvättar, häll 10-15 ml direkt på pelletkobolt pärlor i stället för pipettering, som pipettering kommer att orsaka pärlorna att fastna på insidan av pipetten och protein kommer att gå förlorade. - Pellets CB igen genom centrifugering och häll sedan nästa klarnade lysatet (30 ml, vilket motsvarar 2: a stora inducerade bakteriekultur) på pellet CB. Inkubera i ytterligare 20 minuter vid RT på rotatorn och sedan tvätta två gånger med 10-15 ml 4x SSC + BME. Pellet vid 110 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Efter den andra tvättningen, aspirera vätska och lämna ca 2 ml pärlor / vätska i botten av röret. Överföra erhållna proteinbundna CB till en i förväg kyld 2-ml tub genommed hjälp av en 1 ml "wide-bore" pipettspetsen.
OBS: Använd en ny rakblad för att skära av änden av spetsen före överföring, eftersom användningen av denna "breda hålet" pipettspetsen kommer att minska förlusten av proteinbundna kobolt pärlor. - centrifugera kort pärlorna i 2 ml rör med hög hastighet (~ 18.000 xg) i en mikrocentrifug vid 4 ° C (~ 5 - 10 s är allt som är nödvändigt för snabb pellete). Ta försiktigt bort och kasta supernatanten genom pipettering, var noga med att inte förlora proteinbundna CB.
- Tillsätt 1 mL CB uppslamning (ekvivalent med en 0,5 ml vulst volym) till varje 50 ml rör innehållande klar bakterielysat. Inkubera under 20 min vid RT på en rotator.
- Eluera rG4R1 från CB.
- Inkubera CB i 0,5 ml histidin elueringsbuffert (HEB) på en rotator under 5 min i ett kallt rum. Återigen, när man lägger till HEB, bara pipettera upp 0,5 ml på kornen (för att eliminera CB förlust) och återsuspendera pärlorna genom att vända röret. HEB är 0,7 M L-histidin pH 6 (pH-värdet justeras med ättiksyra).
- Centrifugera vid 18000 xg i en 4 ° C mikrocentrifug under 1 min. Överför supernatantentill en förkyld 15 ml rör. Ta försiktigt bort och överföra den proteininnehållande supernatanten genom försiktig pipettering, vilket lämnar en liten mängd vätska på toppen av CB.
- Upprepa steg 4.4.1 och 4.4.2 för totalt 3 HEB elueringar.
- Eluera en gång med 0,2 M EDTA pH 6,0; färgen på CB ändras från rosa till vit som EDTA kela kobolten.
- Efter denna fjärde och sista eluering har överförts till den 15 ml rör, pipettera den resterande elueringsbuffert från CB med hjälp av en gel-laddning spets på änden av en 1 ml pipettspets; genom att kasta sig spetsen till botten av röret, kan den resterande proteininnehållande elueringsbuffert insamlas.
- Binda rG4R1 till G4 bundna SPB och eluera rekombinant enzym i en ATP-beroende sätt.
- Förbereda 5x Res buffert: 250 mM Tris-acetat pH 7,8, 250 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, och 50% glycerol. Förbereda 3x Res Buffert: 0,915 ml H2O, 2 ml 5x Res buffert, 0,33 ml 0,4% laktalbumin (diluted från 4% laktalbumin med 1x Tris-glycin), 0,010 ml BME, 0,015 ml 1 M MgCl2, 0,050 ml PIC, och 0,010 ml leupeptin. Håll på is.
OBS: lager 4% laktalbumin (vikt / vol) initialt framställas genom upplösning i 2 M glycin pH 7,5, med ytterligare tillsats av 1x PIC och 0,05% natriumazid. - Pellet G4-SPB till sidan av röret med en magnet och kassera supernatanten (G4-SPB, som framställts i steg 4,2). Tillsätt 1 ml av 3x Res buffert till G4-SPB och pipett för att blanda.
- Pipett detta en ml G4-SPB upphängd i 3x Res buffert i 15 ml rör innehållande ~ 2 ml proteininnehållande HEB / EDTA (eluat från steg 4,4). Inkubera i 15 min i en 37 ° C vattenbad med tillfällig omrörning så pärlorna inte sedimentera.
- På is, pelletering av proteinbundna G4-SPB till sidan av röret med en magnet. Att tvätta, tillsätt 1 ml 4x SSC + 0,4% laktalbumin (+ 0,5 pl / ml BME) och pipetten för att resuspendera kulorna. Pellets pärlor med than magnet på is. Upprepa denna tvätt för totalt 2 tvättar.
OBS: Tålamod krävs under tvättförfarandet för att säkerställa att alla de magnetiska pärlorna har pelleterat mellan tvättar. Detta gäller särskilt med tanke på den ökade viskositeten hos lösningen på grund av den glycerol som finns i de Res buffertar. - Tvätta G4-SPB 1x med 1 ml 3x Res buffert.
- Förbereda elueringsbuffert (EB): 0,5 ml 3x Res buffert, 0,1 ml 0,1 M ATP och 0,4 ml H2O
- Pre-warm 1 ml EB till 37 ° C i PCR-rör fördelade över värmeblocket i en termocykelapparat inställd på 37 ° C.
- Pellet G4-SPB med magneten på is och suspendera pärlorna i 100 mikroliter av förvärmda EB. Överför omedelbart pärlorna till en förvärmda PCR-rör och inkubera under 30 s vid 37 ° C.
- Omgående lägga 12 mikroliter av 5 M NaCl och pipettera upp och ner kraftigt 20 - 30 gånger. Kombinationen av den höga salt- och ATP som finns i EBtjänar till att eluera rG4R1 från G4-pärlor.
OBS: Det är mycket viktigt att minimera antalet bubblor som bildas under pipetteringsprocessen, eftersom bubblor kan denaturera proteinet. - Omedelbart pelle G4-SPB med en magnet och överföra proteininnehållande eluatet till en ny PCR-rör på is (märkt med datum).
- Upprepa elueringen och överföring som beskrivs i steg 4.5.8-4.5.10; slutprodukten av detta förfarande är således ~ 200 mikroliter av EB innehållande renade rG4R1. Avsätt två 7 il alikvoter (i PCR-rör märkta med lämpligt datum) för användning i kvalitetskontroll enzymatisk aktivitet analys som kommer att testa om högaktiv rG4R1 har verkligen renats.
- Lagra den renade rG4R1 vid -80 ° C fram till tidpunkten för aktivitetsanalysen.
- Förbereda 5x Res buffert: 250 mM Tris-acetat pH 7,8, 250 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, och 50% glycerol. Förbereda 3x Res Buffert: 0,915 ml H2O, 2 ml 5x Res buffert, 0,33 ml 0,4% laktalbumin (diluted från 4% laktalbumin med 1x Tris-glycin), 0,010 ml BME, 0,015 ml 1 M MgCl2, 0,050 ml PIC, och 0,010 ml leupeptin. Håll på is.
5. Kvalitetskontroll enzymatiska aktiviteten Analys av renat rG4R1
- För varje beredning av rG4R1 som skall analyseras, förbereda 300 mikroliterav resolvas analysbuffert (RAB), där varje 30 mikroliter innehåller 0,2 pmol av TAMRA-märkt Z33 G4-DNA (framställd i steg 2); makeup av RAB är som följer: 0,1 ml 3x Res buffert, 0,01 ml 0,2 pmol / l G4-Z33-TAM, 0,03 ml 0,1 M ATP och 0,16 ml H2O i en remsa av sex PCR rör, pipettspetsar 40 pl RAB till det första röret och 30 mikroliter av RAB in i de återstående rören (hålla rören på is vid denna punkt).
- Hämta en av de 7 mikroliter rG4R1 portioner (från steg 4.5.11) och placera den på is. Med en p20 pipett inställd på 5 mikroliter, försiktigt pipettera upp och ner några gånger för att blanda rG4R1 i portionen och överföra 5 mikroliter till det första röret av remsan 6 PCR-rör (den som innehåller 40 mikroliter av RAB). Ställ sedan pipetten till 10 mikroliter och seriellt överföra 10 mikroliter till de återstående PCR-rör som innehåller RAB.
- Omedelbart inkubera denna remsa av PCR-rör vid 37 ° C under 30 min i en termocykler, följt av en 4 ° C hold.Öppna rören medan de hålls vid 4 ° C och tillsätt 2 pl av 0,5 M EDTA pH 8 till varje rör (för att stoppa den enzymatiska reaktionen).
- Häll en 10% akrylamid / 1x TBE / 10% glycerol gel. Efter avlägsnande av kam, tvätta brunnarna med 1x TBE. Lägg 5 mikroliter av en hög-massa, hydrofil polysackarid (30% Ficoll i H2O) till varje rör och belastning 15 mikroliter från varje rör (kan återigen observeras lastning av brunnar med användning av Schlieren linjer).
- Som en kontroll för G4-DNA rörlighet, tillsätt 4 mikroliter av en stor massa, hydrofila polysackarid till 20 mikroliter RAB, och lasten 15 mikroliter; som en kontroll för lindas mono Z33, värme 20 mikroliter av RAB vid 98 ° C under 10 minuter, tillsätt 4 mikroliter av en stor massa, hydrofila polysackarid, och lasten 15 mikroliter.
- Kör gelen vid 120 V under 2 timmar med 1x TBE som löpbufferten. Bild gelen på en multimodal kameran med fluorescens-imaging kapacitet med hjälp av TAMRA-specifika filter (hetsas med en 532 nm grön laser och använda en 580 nm bandpass 30 filter (580 BP 30)).
OBS: En mycket aktiv beredning av rG4R1 kommer att ge fullständig upplösning av TAMRA-märkt Z33 i de 3 första körfält som laddades på gelén, som visas i figur 2.
6. Sammanslagning av högaktiv rG4R1 Preps, på delning och lagring
OBS: Detta steg kräver 2 personer. Antalet och enzymatiska kraven för de nedströms analyser som det renade rG4R1 kommer att användas i avgör hur många förberedelser behövs före alikvotering. En typisk stor förberedelse består av sammanslagning av 8 högaktiva preparat (alltså med hjälp av totalt 16 inducerade 500 ml bakteriekulturer), men detta är ett godtyckligt antal och är laboratoriespecifika.
- Beräkna den totala volymen av högaktiva, renade rG4R1 som skall alikvoteras. Normalt är 7 il alikvoter användas i analyser nedströms. Fyll blocket av en termisk cykler inställd på 4 ° C med remsor PCR-rör (dessa kommer att i lika delar i, som den fasta naturen av blocket kommer att påskynda den snabba stängningen av PCR-band).
- Hämta de PCR-rör innehållande högaktiv rG4R1 från -80 ° C och snabbt tina rören i handen; när en liten mängd is återstår i röret, placera rören på is. Kombinera alla snabbt-tinade preparat i en förkyld, 15 ml rör och blanda väl, och se till att minimera bubblor.
- Användning av en automatisk repeterande pipett dosera önskad alikvotens volym i pre-kylda PCR band rören i termocyklern. Så snart 1 - 2 remsor är avslutade, har den andra personen stänga locken och överföra dem till 96-brunnsskivor som är flytande i flytande kväve (flash frysning är nödvändigt för att bevara enzymatisk aktivitet).
OBS: Ta inte mer än ca 200 mikroliter av rG4R1 in i spetsen av den automatiska pipetten åt gången för att minska den tid som att enzymet inte är i 4° C. - När kyld PCR band rören i termocyklern har fyllts med portioner och korrekt frysta, snabbt överföra mer pre-kylda PCR band rör från is till termocyklern och fortsätta på delning. Fortsätt på detta sätt tills resten av enzymet har alikvoteras snabbfrystes i flytande kväve och överfördes till torris. Slutligen överföra alikvoter till -80 ° C för långtidsförvaring.
7. Kvantifiering av renat rG4R1 Koncentration
- Häll en standard 5% stapling / 12% lösa akrylamid / SDS-gel för proteinseparation.
- Tö ca 50 mikroliter av alikvoter rG4R1, kombinera till ett rör, och blanda väl. Mäta den exakta volymen med en pipett och tillsätt en lika stor mängd 2x Laemmli provbuffert (65,8 mM Tris-HCl pH 6,8, 26,3% (vikt / volym) glycerol, 2,1% SDS och 0,02% bromfenolblått) + BME (50 mikroliter / 950 mikroliter av 2x Laemmli-buffert). Denaturera proteinet vid 98 ° C under 10 min.
- Ta bort kammen från gelén och tvätta brunnarna med standard 1x SDS / glycin löpbufferten. Ladda motsvarande 25 och 12,5 mikroliter av rG4R1 (som är 50 och 25 mikroliter av denaturerat protein), även om den optimala volymen av enzym för att ladda bör bestämmas av användaren, som den koncentration av de enzymatiska beredningar kommer att variera (t.ex., 35 il laddades på gelén i figur 3). Ladda protein standarder som utarbetats i steg 7,3. Se till att pipetterna är väl kalibrerade, och se till att vara så exakt som possible med pipetteringsteknik för att säkerställa korrekt kvantifiering.
- Kör gelén vid 120 V tills färgfronten har passerat ca 2/3 av gelén (för att säkerställa korrekt separation av proteinerna som bygger upp de bred range MW-markörer).
- Bort gelen och göra sig av den del av gelén som inte kommer att innehålla protein genom att skära bort den med ett rakblad. Placera gelen i ett glas gryta eller motsvarande kärl. Fläcka gelén med Coomassie-färgämne (50 mg Coomassie R-250 per 100 ml av 50:10:40 volym / volym metanol: ättiksyra: H2O som har filtrerats genom ett filter-papperstratt) O / N vid RT på en orbital skakapparat för att säkerställa tillräcklig omröring av gelén.
- De-färga gelen med 30:10:60 volym / volym metanol: ättiksyra: H2O med hjälp av balled upp, luddfritt mjukpapper för att påskynda avfärgning. Ändra avfärgningslösningen behov. Fortsätta avfärgning tills bakgrunden är tillräckligt låg för att visualisera rG4R1 och proteinstandarder; en typisk gel vid dettasteg visas i Figur 3.
- Placera avfärgades gel mellan ett ark skydd och skanna gelen vid dpi upplösning ≥300. Öppna den skannade bilden i en bildanalysprogram (t.ex. Fuji Multiguage eller motsvarande) och förbereda standardkurvor från proteinstandarder som motsvarar 75, 100 och 150 kDa (kurvorna representerar gram mängder kontra densitometriska avläsningar). Se till att subtrahera bakgrunden från varje bana som kvantifieras under processen att få densitometriska värden.
- Om man antar att volym mängden rG4R1 som laddades på gelén innehåller en mängd av protein som ligger inom det linjära området av dessa standardkurvor, den gram mängd protein per mikroliter av rG4R1 lastade kan extrapoleras.
- Konvertera den extrapolerade gram mängden rG4R1 in i en molär mängd med användning av molekylvikten hos G4R1, som är 120.000 g / mol.
OBS: För varje gel, kommer tre extrapolerade värden varagenereras (en för vardera av de tre proteinmarkörer använts för att generera standardkurvor: 75, 100, och 150 kDa). Kör ytterligare två geler och fläcken och kvantifiera dem genom att upprepa steg från 7,1 till 7,10. Med resultaten av kvantifieringen för första gel, kommer användaren att kunna mäta hur mycket rG4R1 måste laddas om ytterligare geler för att ge en mängd som ligger inom det linjära området av proteinstandarder. Sammantaget, extrapolera nio värden som representerar koncentrationen av högaktivt, renat rG4R1. Genomsnitt dessa värden för att ge den slutliga satsen specifika rG4R1 koncentration, som typiskt är i intervallet från 20 till 100 nM. Beräkna standardavvikelsen från dessa värden (n = 9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll (Figur 1) rutinmässigt ger nästan ren, katalytiskt aktiv rG4R1. Som ett mått på enzymatisk aktivitet, är det typiskt observerat att 50% av 0,2 pmol av TAMRA-märkta tetramolecular G4-DNA omvandlas till monomerer inom 0,2-0,013 il intervallet rG4R1, enligt analys med G4 aktivitetsanalysen som beskrivits ovan (Figur 2). Coomassie-färgning av renat rG4R1 visar ett enda band vid den förväntade storleken 120 kDa, med en mindre förorenande band vid ~ 75 kDa, vilket kan bero på stympad rG4R1 som har behållit sin förmåga att binda G4-DNA pärlor och eluera i en ATP-beroende sätt (Figur 3). Bandet av intresse kvantifieras mot ett protein standardkurva, och detta protokoll erhåller typiskt 200 mikroliter av 20-100 nM renat enzym per 1 liter bakteriekultur.
Figur 1: Schematisk bild av en tvåstegs Rening av G4R1. En 6xHis-märkta rG4R1 är bulk renats från E. coli-lysat genom att först binda till och eluering från Co 2+ konjugerad pärlor. En bindningssteg till G4-DNA-konjugerad magnetiska pärlor följer. Slutligen är det nödvändigt med en ATP-beroende elueringssteg för att erhålla relativt ren och enzymatiskt aktiv rG4R1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kvalitetskontroll G4-DNA Unwinding analys. Lanes 1-6: En konstant koncentration av TAMRA-märkta tetramolecular G4-DNA inkuberades vid 37 ° C under 30 min i närvaro av 4x seriespädningar av renade rG4R1 representerande 3,9 | il, 0,83 | il, 0,2 | il, 0,05 | il, 0,013 mikroliter och 0 0,003 mikroliter, respektive. Lane 7: tetramolecular G4-DNA i frånvaro av rG4R1. Lane 8: tetramolecular G4-DNA kokas för att minska G4 strukturen till monomerer i frånvaro av rG4R1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvantifiering av renat rG4R1 koncentration. Bred räckvidd MW proteinmarkörer laddades i följande mängder: 500, 250, 125, 62,5, 31,3 och 15,7 ng i Lanes 1 - 6, respektive, och användes för att generera en standardkurva av proteinkoncentrationer. Bana 7 representerar 35 mikroliter av rG4R1. Denna speciella gel kvantifierades, som en del av en tre exemplar uppsättning geler, vilket resulterade i en genomsnittlig proteinkoncentration av 62 ± 22 nM standardavvikelse (SD; N = 9)..com / filer / ftp_upload / 55.496 / 55496fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll utgör en effektiv uttryck, rening och kvantifiering system för isolering av DHX36 genprodukten, G4-Resolvase1 (G4R1, även kallad RHAU och DHX36) (Figur 1). Detta protokoll använder två reningssteg: His-tag affinitetsrening på koboltaffinitetspärlor och enzymatisk rening på G4-DNA-konjugerade pärlor. Det senare steget är unik genom att den drar nytta av den snäva affinitet, hög specificitet och katalytisk avveckling aktivitet som rG4R1 har för G4 strukturer. Den snäva affinitet för G4 strukturer (Kd i låga pM intervall) möjliggör en hög salttvätt (nära löslighetsgränsen för NaCl) före eluering från G4 pärlor, vilket kraftigt minskar förekomsten av icke-specifika proteiner. Den katalytiska aktiviteten av G4R1 på G4 strukturer möjliggör den specifika eluering av aktiv rG4R1 vid tillsats av ATP och MgCl2. Denna två-stegs system rening genomgående producerar högren, Katalytiskt aktivt rG4R1 13 i mängder som är lämpliga för de flesta biokemiska analyser.
Flera viktiga steg kommer att garantera en god avkastning av mycket ren, katalytiskt aktiv rG4R1. Den första är att säkerställa en korrekt induktionsförhållanden His-rG4R1 i bakterieexpressionsstammen. Vi har funnit att det bästa utbytet av rekombinant protein inträffar när celler odlas till en OD 600 av ej mer än 0,4 till 0,6 precis före induktion. Odla cellerna bortom denna punkt kan resultera i en total förlust av protein återhämtning, möjligen på grund av införlivandet av rG4R1 i inklusionskroppar. För det andra, erhöll vi en högre koncentration av renat protein med "seriellt-bindande" lysaten till koboltaffinitetspärlor. Till exempel, bunden vi lysatet från 0,5 L av inducerade kulturer till koboltaffinitetspärlor och sedan utförde en andra bindning av en annan lysat från ytterligare 0,5 liter kultur till samma koboltaffinitetspärlor. Dettasteg säkerställer en mera koncentrerad beredning av protein genom att öka antalet rG4R1 molekyler bundna till en given volym av pärlor, på så sätt utnyttja den fulla kapaciteten hos de koboltaffinitetspärlor. För det tredje, den höga salttvätt efter bindning de koboltaffinitets elueringar till G4 pärlor säkerställer att nästan alla icke-specifik proteinbindning till kulorna avlägsnas. För det fjärde, tillåter ATP / MgCl2 elueringssteg för rG4R1 bundet till G4 pärlor att katalytiskt koppla den tetramolecular strukturen till enkelsträngar, vilket orsakar rG4R1 att avges från pärlorna. Vi kan inte helt utesluta möjligheten att ATP eluerar rG4R1 i en konkurrenskraftig i stället för ett katalytiskt sätt; Detta är dock mindre troligt att så är fallet, eftersom vi tidigare har visat att en icke-hydrolyserbar ATP analog är inte tillräckligt för kompetitiv bindning 13, 18. Affinitet rG4R1 för lindas, är enkelsträngat DNA en storleksordning mindre än tHan börjar tetramolecular G4-DNA, och därmed rG4R1 ska inte ta binder till pärlorna. För att minska denna möjlighet är emellertid detta steg bör ske vid 37 ° C, och elueringsvolymen bör separeras från pärlorna så snabbt som möjligt. Elueringen steg upprepas två gånger för att säkerställa maximal återhämtning. Om nedströmstillämpningar kräver att proteinet att vara fri från DNA-kontaminanter, rekommenderar vi en ytterligare sanering steg, i vilket den renade beredningen på nytt bundna till streptavidinpärloma i syfte att avlägsna eventuella biotinylerade DNA: n, om den är närvarande.
Vi har funnit att rG4R1 är känslig för nedbrytning om rätt förhållanden inte bibehålls under hela protokollet. För att upprätthålla integriteten och aktiviteten hos enzymet, använder vi följande kritiska skyddsåtgärder. Proteashämmare hålls närvarande under hela reningsförfarandet. Protokollet utförs vid 4 ° C, om inte annat anges. Proteinet renas i närvaro av lactalbumin och β-merkaptoetanol. Protokollet utförs i tid (i en dag för den rening). Dessutom har vi funnit att flera frys-tö cykler påverkar aktiviteten hos proteinet negativt, så vi alikvot proteinet till "engångsbruk" 7 il alikvoter efter rening och förvara dem vid -80 ° C.
Även om närvaron av laktalbumin i förberedelse krävs för att upprätthålla integriteten och aktiviteten hos proteinet, som nämnts ovan, har vi funnit att detta också kan hindra efterföljande tillämpningar. Andra potentiella interfererande molekyler som är närvarande i den renade rG4R1 beredningen inkluderar ATP, β-merkaptoetanol och pekas DNA. Till exempel har vi funnit denna proteinberedning är oförenlig med BIACORE-analys på grund av den höga bakgrundssignalen från buffertkomponenterna. Även närvaron av laktalbumin i proteinberedningen utesluter användning av standard Bradfordoch BCA protein kvantifiering analyser. Emellertid har vi utvecklat en alternativ gelbaserad kvantifiering metod för att kringgå denna begränsning.
Detta reningsförfarande, vilket utnyttjar den enzymatiska aktiviteten för G4R1 som ett medel för att specifikt rena det, gör denna metod skiljer sig från andra metoder. Till exempel, har andra grupper uttryckt FLAG-märkt rG4R1 i humana celler 15, 25 eller GST-märkt rG4R1 i insektsceller 26 och renades den genom FLAG- eller GST-affinitetskromatografi, respektive. Dessa metoder har fördelen av att vara gjort i en eukaryot expressionssystem jämfört med ett bakteriellt uttryckssystem. Uppskattade Kd-värden för den resulterande renade GST-G4R1 för G4 strukturer befanns vara en storleksordning högre 14 än vår rapporterade Kd-värden 12, 13. Vi tillskriver this avvikelse i K-värden för skillnader i samband med en skrymmande GST-tag mot en 6xHis-tag, skillnader i renhet som erhålls från dessa två reningsscheman, och skillnader i omfattningen och typen av posttranslationella modifieringar som förvärvats i en bakteriell kontra en insektsexpressionssystem. Vårt tillvägagångssätt har en klar fördel jämfört med de tidigare nämnda alternativen eftersom reningen av detta protein inte beror helt på dess enzymatiska aktivitet. Därför får vi i första hand ett enzym som har vikts och modifieras på ett sådant sätt som upprätthåller sina enzymatiska egenskaper. Andra affinitets tag och / eller storleksuteslutningstekniker inte kan skilja aktivt enzym från enzymatiskt döda enzym. Det skulle vara bra för framtida protokoll utveckling att kombinera styrkorna hos andra gruppers reningsprotokoll 15, 25, 26 (dvs en människa eller insektscelluttryckion-system) med styrkan i våra protokoll (dvs katalytisk baserad rening) för att ytterligare förbättra denna metod.
Även om detta protokoll är för närvarande specifikt för G4R1, kan det enkelt anpassas till eventuella ATP-beroende, G4-lösa proteiner, innefattande, men inte begränsat till, BLM, WRN, FANCJ, hnRNP proteiner, hPif1, och / eller ChlR1 / DDX1. Genom att förändra sekvensen av nukleinsyran bunden till streptavidinpärloma, kan detta protokoll anpassas för att rena andra ATP-beroende nukleinsyra-enzymer för vilka produkten av den enzymatiska reaktionen är inte längre ett substrat för enzymet, inklusive nukleinsyra-helikaser och nukleaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka våra finansieringskällor, inklusive en generös gåva från Ware Foundation (till JPV), National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (till PJS), och Ball State University start medel (till PJS). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/mL in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/mL in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or from standard source |
| 1 M Tris-HCl, pH 7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or from standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH 7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or from standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or from standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or from standard source |
| 0.2 M EDTA, pH 6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or from standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | From standard source | ||
| 500 mL centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
References
- Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
- Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
- Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
- Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
- Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
- Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
- Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
- Sexton, A. N., Collins, K. The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
- Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
- Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
- Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
- Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).
- Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
- Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
- Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
- BD Biosciences. , Available from: http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf (2016).
- Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
- Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).
