这里,我们提出使用无标记的定量质谱法对蛋白复合物的亲和纯化和由蓝色天然PAGE它们的分离协议,其次是蛋白相关性分析。这种方法是非常有用的解决相互作用组分成不同的蛋白复合物。
Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.
在细胞中,大多数蛋白质通过暂时性蛋白质 – 蛋白质相互作用或通过形成稳定的蛋白质组合件执行它们的功能。表征蛋白质相互作用,对于全面理解细胞过程的关键。与质谱法(AP-MS)组合的亲和纯化是最普遍应用的策略,以确定天然蛋白质相互作用之一。在过去十年中取得了仪器功能显著进步使得这种方法非常强大。需要注意的是通过AP-MS实验确定的相互作用包括诱饵和猎物之间的直接和间接关联的混合物是很重要的。此外,经常蛋白质参与相同的细胞范围内几个不同的复合物,其可能具有不同的生物学作用,并因此由AP-MS鉴定的相互作用因子可能代表的不同的蛋白质的组件或功能实体的混合。这是不可能推导这种拓扑信息由简单的AP-MS实验中产生的蛋白质的单维列表先验 。然而,该技术可以进一步利用通过将其与一种或多种方法组合以解决这些组件来定义的蛋白质复合物的结构。
为了解决通过AP-MS鉴定蛋白质相互作用的拓扑结构,几种策略已经被应用。一种方法是使用执行在先前轮实验作为诱饵1中确定的猎物迭代AP-MS实验。虽然信息量很大,这是一个相当劳动密集型任务实验与分析。蛋白的交联在与质谱结合越来越多地被用来推导对蛋白复合物2,3,4,5的拓扑信息。但是,计算中交联肽的最终分析仍是一项艰巨的任务,因此在工作流程中的瓶颈。 MS-裂解的交联试剂的出现应推动有紧密接近中相互作用蛋白6,7的氨基酸残基的映射。另一种方法是亲和纯化与现有的正交分离技术8,9结合。通过凝胶过滤或离子交换,或蔗糖梯度分级色谱分离最近也被与定量质谱组合使用在一个系统范围内的电平,以描述多蛋白复合物,通过绕过复杂的分离步骤10,11,12,13。蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE)已被广泛地应用到调查天然蛋白的相互作用,通常是那些涉及线粒体膜蛋白复合物14。这种分离技术最近还结合使用无标记蛋白定量和相关性分析,不仅对线粒体复合物15,16,17,但也可用于从全细胞18,19解开其他蛋白复合物。我们假设,亲和纯化的,随后分馏天然方法和定量MS的组合应提供用于解决含有特定蛋白多蛋白组件的有用策略。
在这里,我们描述了结合了通用的基于表位的亲和纯化与分离的复合物的蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,随后定量质谱属ectrometry和蛋白质的相关性分析,解决了多个组件的蛋白可能参与。我们采用其中融合到表位标签的目的蛋白从内源性基因表达来实现接近生理丰度和确保有效的天然小鼠胚胎干细胞复杂的隔离。这种方法的揭开多种相互作用的蛋白质接合,解决这些基于其相关波形不同组件,而无需比常规GELC-MS 20更多的工作。
在这里,我们描述了使用亲和纯化,然后与定量质谱组合蓝色本地凝胶电泳来解决蛋白质复合物。这种方法提供解开一维蛋白相互作用列表分成功能性蛋白组件的方法。
我们证明基于使用表位标记蛋白的方法。然而,如果表达标记蛋白的细胞系中不可用,另一种可能是使用的抗体针对感兴趣的蛋白质,只要可实现本机在竞争性洗脱的肽。起始材料和珠量的量可能需要根据目标蛋白的表达水平进行修改。我们通常执行该协议与起始原料2-5×10 8个细胞,这是足够的,即使对于具有低表达水平的蛋白质。裂解缓冲液的组合物应当凭经验选择以实现接近完成诱饵的溶解。这可能是某些类型的蛋白质的具有挑战性的,尤其是染色质结合或膜蛋白。替代方案包括增加盐的量,条件是所研究的蛋白复合物是稳定在高盐,或使用超声处理和/或核酸酶处理为染色质结合蛋白20,29。在膜蛋白质的情况下,切换到洗涤剂DDM或毛地黄皂苷是可取30。在的DNA结合蛋白的情况下,有用的是包括这样的核酸酶在纯化步骤20的Benzonase。完全去除的核酸可确保检测到的相互作用蛋白质之间发生,并且不受DNA介导的。
一个关键因素来考虑使用此方法时,正在调查该复合物的稳定性。该过程是漫长的,可能涉及preservin克蛋白质复合物过夜。我们已经取得了两个染色质重塑复合物(D·博德和M·帕多,数据未显示)很成功,但这应该进行评估。如果所需要的亲和纯化步骤可以被缩短。
替代性技术,让本地分馏,如尺寸排阻色谱法,已被广泛应用于超过50年来表征蛋白质复合物。我们和其他人已经表明,蓝色天然PAGE的分辨率优于使用尺寸排阻色谱法20,31,32,33来实现的。蓝色天然PAGE的另一个优点是,它不需要色谱系统,这是昂贵的,而是使用蛋白电泳设备是在实验室普遍。在方面动手的时候,这种方法不涉及比传统GELC-MS / MS更工作接近角或离线色谱分离。然而,由于大多数分级技术做的,它有一个限制它们的分辨率。配合是非常均匀的或接近的质量和形状可以是超越蓝色天然PAGE所提供的分辨率,因此,问题报告可能不会在解决与共享亚基不同复合普遍成功的协议。令人鼓舞的是,我们在分离两个非常相似的四聚体复合分享三个亚基(M·帕多,手稿准备)是成功的。
由于质谱分析已经变得越来越敏感,非特异性相互作用物和污染物甚至微量可以AP-MS样品中被检测到。这里介绍的方法可能通过集中关注与移民峰,在分子量比更高的诱饵迁移峰重合蛋白质从亲和纯化背景污染实际作用因子的歧视帮助单体蛋白质。
一些研究小组已经使用分级分离技术,随后蛋白相关性分析以描绘在细胞水平的蛋白质复合物,而无需先前的隔离10,11,12,34。然而,这可能导致无法检测到亚化学计量的相互作用。通过亲和纯化富集步骤的引入可以帮助克服这一点。这里所描述的方法应该是探索蛋白质复合物的拓扑和解开多个复合给定蛋白质参与在相同的细胞环境中通常是有用的。该战略很简单,适于可能没有昂贵的色谱分离设备解决蛋白质复合物的实验室。
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).
Protein G Dynabeads | Life Technologies | 10003D | |
FLAG antibody M2 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
Tween-20, protein grade, 10% solution | Millipore | 655206 | |
Dimethyl pimelimidate | Sigma-Aldrich | 80490 | |
0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2 | Sigma-Aldrich | T0449 | |
3x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
Vivaspin 5K NMWCO, PES | Sartorius | VS0112 | |
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel | Life Technologies | BN1001 | |
20x NativePAGE Running Buffer | Life Technologies | BN2001 | |
20x NativePAGE Cathode Additive | Life Technologies | BN2002 | |
4x NativePAGE sample loading buffer | Life Technologies | BN2003 | |
NativeMARK | Life Technologies | LC0725 | |
NativePAGE 5% G-250 sample additive | Life Technologies | BN2004 | |
Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene | Thermo | 249944 | |
Multiscreen HTS 96-well filtration system | Thermo | MSDVN6550 | |
Nunc 96-well cap natural | Thermo | 276002 | |
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A/0627/17 | |
Trypsin, sequencing grade | Roche | 11418475001 | |
Software | |||
MaxQuant (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant |
Perseus (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus |