Vi præsenterer her protokoller for affinitetsoprensning af proteinkomplekser og deres separation ved blå nativ PAGE, efterfulgt af protein korrelation profilering ved anvendelse etiket fri kvantitativ massespektrometri. Denne metode er nyttig til at løse interactomes i distinkte proteinkomplekser.
Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.
I celler, de fleste proteiner udfører deres funktioner gennem forbigående protein-protein-interaktioner eller ved dannelse af stabile protein-aggregater. Karakterisering proteininteraktioner er afgørende for fuldt forstå cellulære processer. Affinitetsoprensning i kombination med massespektrometri (AP-MS) er en af de mest almindeligt anvendte strategier til at identificere native protein-interaktioner. Væsentlige forbedringer i instrument kapaciteter opnået i de seneste ti år har gjort denne fremgangsmåde ekstremt kraftfuld. Det er vigtigt at bemærke, at interaktionerne identificeret ved AP-MS eksperimenter, indbefatter en blanding af direkte og indirekte sammenhænge mellem agn og byttedyr. Desuden ofte proteiner deltage i flere forskellige komplekser inden for samme cellulære kontekst, som kan have forskellige biologiske roller, og derfor interaktionskandidater, som er identificeret ved AP-MS kan udgøre en blanding af forskellige protein-samlinger eller funktionelle enheder. Det er ikke muligt at udledesådan topologisk information a priori fra mono-dimensionelle lister over proteiner der genereres af simple AP-MS eksperimenter. Imidlertid kan teknikken udnyttes yderligere at definere arkitekturen af proteinkomplekser ved at kombinere det med en eller flere metoder til at løse disse enheder.
For at løse topologien af protein interaktioner identificeret ved AP-MS, har flere strategier blevet anvendt. En fremgangsmåde er at udføre iterative AP-MS forsøg under anvendelse byttedyr identificeret i en tidligere runde af forsøg som lokkemad 1. Selvom meget informativ, dette er en ganske arbejdskrævende opgave både eksperimentelt og analytisk. Protein tværbinding i kombination med massespektrometri anvendes i stigende grad til at udlede topologisk information om proteinkomplekser 2, 3, 4, 5. Men computational analyse af tværbundne peptider stadig en udfordrende opgave og dermed er flaskehalsen i arbejdsgangen. Fremkomsten af MS-spaltelige tværbindingsreagenser bør lette kortlægning af aminosyreresterne, der er i tæt nærhed i interagerende proteiner 6, 7. Et andet alternativ er at kombinere affinitetsoprensning med kendte ortogonale separationsteknikker 8, 9. Kromatografisk fraktionering ved gelfiltrering eller ionbytning eller saccharosegradientfraktionering er også for nylig blevet anvendt i kombination med kvantitativ massespektrometri til at beskrive multiproteinkomplekser på et system-plan, for at omgå den komplekse isolation trin 10, 11, 12, 13. Blå nativ polyacrylamidgelelektroforese (BN-PAGE) har været almindeligt anvendt tilundersøge native protein-interaktioner, typisk dem, der involverer mitokondriske membran proteinkomplekser 14. Denne adskillelse teknik blev også for nylig anvendes i kombination med etiket-frit protein kvantificering og korrelation profilering, ikke kun på mitokondrielle komplekser 15, 16, 17, men også for optrevling andre proteinkomplekser fra hele celler 18, 19. Vi antager, at kombinationen af affinitetsrensning med efterfølgende native fraktioneringstrin tilgange og kvantitativ MS bør give en nyttig strategi til løsning af flere proteinkonstruktioner indeholdende et særligt protein.
Her beskriver vi en fremgangsmåde, der kombinerer generiske epitopbaseret affinitetsoprensning med blå nativ polyacrylamidgelelektroforese af de isolerede komplekser, efterfulgt af kvantitativ masse spectrometry og protein korrelation profilering, for at løse de mange samlinger et protein kan være involveret i. Vi anvender musen embryonale stamceller, hvor et protein af interesse fusioneret til et epitopmærke udtrykkes fra det endogene locus for at opnå tæt på fysiologisk overflod og sikre en effektiv native kompleks isolation. Denne tilgang optrevler de multiple interaktioner et protein indgriber i, at løse dem i særskilte enheder baseret på deres sammenligningstabeller profiler, mens ikke kræver mere arbejde end konventionelle geLC-MS 20.
Her, beskriver vi anvendelsen af affinitetsoprensning efterfulgt af blå nativ gelelektroforese i kombination med kvantitativ massespektrometri til at løse proteinkomplekser. Denne fremgangsmåde giver en metode til at trævle endimensionale protein interaktion lister i funktionelle proteinkonstruktioner.
Vi viser fremgangsmåden baseret på anvendelsen af epitopmærkede proteiner. Men hvis en cellelinie, der udtrykker et mærket protein ikke er tilgængelig, kan en alternativ være at anvende antistoffer mod proteinet af interesse, forudsat at der er et peptid til rådighed til at opnå nativt kompetitiv eluering. Mængden af udgangsmateriale og mængde af perler skal muligvis ændres afhængigt af ekspressionsniveauet af målproteinet. Vi typisk udføre denne protokol med 2-5 x 10 8 celler udgangsmateriale, og dette er tilstrækkeligt selv for proteiner med lavt ekspressionsniveau. Lyseringsbufferen sammensætning bør vælges empirisk for at opnånær at fuldføre opløsningen af agn. Dette kan være en udfordring for nogle typer af proteiner, især kromatinbinding eller membranproteiner. Alternative muligheder omfatter forøgelse af mængden af salt, forudsat at proteinet kompleks under undersøgelsen er stabil i høj salt eller anvendelse af lydbehandling og / eller nuklease behandling for chromatin bindingsproteiner 20, 29. I tilfælde af membranproteiner, kan skifte detergent til DDM eller digitonin være tilrådeligt 30. I tilfælde af DNA-bindende proteiner, er det nyttigt at omfatte en nuklease, såsom Benzonase under oprensningen trin 20. Fuldstændig fjernelse af nukleinsyrer sikrer, at de detekterede interaktioner forekomme mellem proteiner og ikke er medieret af DNA.
Et kritisk element til at overveje, når du bruger denne metode er stabiliteten af komplekset, der undersøges. Proceduren er lang og kan involvere preserving proteinkomplekset natten over. Vi har opnået god succes med to kromatin remodeling komplekser (D. Bode og M. Pardo, data ikke vist), men dette bør evalueres. Affinitetsrensningstrinnet kan afkortes, hvis det kræves.
Alternative teknikker, der tillader native fraktionering, såsom gelpermeationskromatografi, er ofte blevet brugt i over 50 år til at karakterisere proteinkomplekser. Vi og andre har vist, at løsningen af blå nativ PAGE er overlegen i forhold til den, der opnås ved anvendelse af gelpermeationskromatografi 20, 31, 32, 33. En anden fordel ved blå nativ PAGE er, at det ikke kræver kromatografisystemer, som er dyre, men snarere anvender protein elektroforetisk udstyr, der er udbredt i laboratorier. Med hensyn til hands-on tid, denne metode involverer ikke mere arbejde end den traditionelle geLC-MS / MS enMETODE eller offline kromatografisk fraktionering. Men som de fleste fraktionering teknikker gør, det har en grænse for deres løsning. Komplekser, der er meget homogene eller tæt i masse og form kan være uden beslutningen tilbydes af blå nativ PAGE, og dermed protokol som rapporteret her, er måske ikke være universelt vellykket i løsningen særskilte komplekser med delte underenheder. Opmuntrende, har vi haft succes med at adskille to meget ens tetrameriske komplekser deler tre underenheder (M. Pardo, manuskript under udarbejdelse).
Da massespektrometri bliver stadig mere følsom, kan detekteres selv små mængder af ikke-specifikke interaktører og forurenende stoffer i AP-MS-prøver. Den foreslåede fremgangsmåde her, er måske hjælpe til diskrimination af reelle interaktører fra baggrund forurening i affinitetsoprensning ved at fokusere opmærksomheden på proteiner med migration toppe, der falder sammen med agn migration toppe ved højere molekylvægt end den forde monomere proteiner.
Adskillige grupper har brugt fraktioneringsteknikker efterfulgt af protein korrelation profilering at afgrænse proteinkomplekser ved cellulær skala uden behov for forudgående isolation 10, 11, 12, 34. Imidlertid kan dette resultere i manglende detektering sub-støkiometrisk interaktioner. Inkorporeringen af en berigning trin gennem affinitetsoprensning kan bidrage til at overvinde dette. Den her beskrevne fremgangsmåde bør være generelt egnede til at udforske topologien af proteinkomplekser og optrævling de multiple komplekser et givet protein tager del i inden for samme cellulære kontekst. Strategien er enkel og modtagelig for laboratorier, der måske ikke har dyrt kromatografisk fraktionering udstyr til at løse proteinkomplekser.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).
Protein G Dynabeads | Life Technologies | 10003D | |
FLAG antibody M2 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
Tween-20, protein grade, 10% solution | Millipore | 655206 | |
Dimethyl pimelimidate | Sigma-Aldrich | 80490 | |
0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2 | Sigma-Aldrich | T0449 | |
3x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
Vivaspin 5K NMWCO, PES | Sartorius | VS0112 | |
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel | Life Technologies | BN1001 | |
20x NativePAGE Running Buffer | Life Technologies | BN2001 | |
20x NativePAGE Cathode Additive | Life Technologies | BN2002 | |
4x NativePAGE sample loading buffer | Life Technologies | BN2003 | |
NativeMARK | Life Technologies | LC0725 | |
NativePAGE 5% G-250 sample additive | Life Technologies | BN2004 | |
Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene | Thermo | 249944 | |
Multiscreen HTS 96-well filtration system | Thermo | MSDVN6550 | |
Nunc 96-well cap natural | Thermo | 276002 | |
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A/0627/17 | |
Trypsin, sequencing grade | Roche | 11418475001 | |
Software | |||
MaxQuant (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant |
Perseus (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus |