यहाँ हम लेबल मुक्त मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि और नीले देशी पृष्ठ द्वारा उनके अलग होने के लिए प्रोटोकॉल, प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा के बाद प्रस्तुत करते हैं। इस विधि अलग प्रोटीन परिसरों में interactomes को हल करने में उपयोगी है।
Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.
कोशिकाओं में, सबसे प्रोटीन अस्थायी प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्य क्रिया के माध्यम से या स्थिर प्रोटीन विधानसभाओं के गठन से उनके कार्य करते हैं। प्रोटीन बातचीत की विशेषताओं को पूरी तरह से समझ कोशिकीय प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एपी एमएस) के साथ संयोजन में समानता शुद्धि सबसे अधिक आवेदन किया रणनीतियों देशी प्रोटीन बातचीत की पहचान करने से एक है। पिछले एक दशक में हासिल साधन क्षमताओं में महत्वपूर्ण सुधार इस दृष्टिकोण अत्यंत शक्तिशाली बना दिया है। यह ध्यान रखें कि बातचीत एपी एमएस प्रयोगों से पहचान चारा और preys के बीच प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संघों का एक मिश्रण शामिल महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, अक्सर प्रोटीन ही सेलुलर संदर्भ में कई अलग अलग परिसरों, विभिन्न जैविक भूमिका है हो सकता है में भाग लेने, और इसलिए interactors कि एपी एमएस द्वारा पहचाने जाते हैं विशिष्ट प्रोटीन विधानसभाओं या कार्यात्मक संस्थाओं का एक मिश्रण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। यह प्राप्त करने के लिए संभव नहीं हैइस तरह के संस्थानिक जानकारी सरल एपी एमएस प्रयोगों द्वारा उत्पन्न प्रोटीन की मोनो आयामी सूची से एक प्रायोरी। हालांकि, तकनीक आगे इन विधानसभाओं को हल करने में एक या अधिक तरीकों के साथ संयोजित करके प्रोटीन परिसरों की वास्तुकला को परिभाषित करने के शोषण किया जा सकता।
आदेश एपी एमएस के माध्यम से पहचान प्रोटीन बातचीत के टोपोलॉजी को हल करने के लिए, कई रणनीतियों लागू किया गया है। एक दृष्टिकोण preys फँसाना चाहे 1 के रूप में प्रयोगों की एक पिछले चक्र में पहचान का उपयोग कर पुनरावृत्ति एपी एमएस प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए है। हालांकि बहुत जानकारीपूर्ण, यह काफी श्रम गहन कार्य दोनों प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक है। प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में क्रॉस-लिंकिंग तेजी से प्रोटीन परिसरों 2, 3, 4, 5 पर संस्थानिक जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता जा रहा है। हालांकि, computatioपार से जुड़े पेप्टाइड्स के एनएएल विश्लेषण अभी भी एक चुनौती भरा काम रहता है और इसलिए कार्यप्रवाह में अड़चन है। MS-cleavable पार जोड़ने अभिकर्मकों के आगमन के एमिनो एसिड अवशेष है कि प्रोटीन 6, 7 बातचीत में निकट हैं की मैपिंग की सुविधा चाहिए। एक अन्य विकल्प पहले ओर्थोगोनल जुदाई तकनीक 8, 9 के साथ आत्मीयता शुद्धि गठबंधन करने के लिए है। जेल निस्पंदन या आयन एक्सचेंज, या सुक्रोज ढाल विभाजन द्वारा Chromatographic विभाजन भी हाल ही में एक सिस्टम-वाइड स्तर पर multiprotein परिसरों का वर्णन करने के द्वारा गुजर जटिल अलगाव कदम 10, 11, 12, 13 मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया है। ब्लू देशी पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (बी एन-पृष्ठ) व्यापक रूप से लागू किया गया हैदेशी प्रोटीन बातचीत, आम तौर पर mitochondrial झिल्ली प्रोटीन परिसरों 14 से जुड़े उन की जांच। यह अलगाव तकनीक भी हाल ही में लेबल से मुक्त प्रोटीन मात्रा और सहसंबंध रूपरेखा, mitochondrial परिसरों 15, पर न केवल के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया था 16, 17, लेकिन यह भी, पूरे कोशिकाओं 18 से 19 अन्य प्रोटीन परिसरों को उजागर करने के लिए। हम धारणा है कि बाद में देशी विभाजन दृष्टिकोण और मात्रात्मक एमएस के साथ आत्मीयता शुद्धि के संयोजन एक विशेष प्रोटीन युक्त कई प्रोटीन विधानसभाओं के समाधान के लिए एक उपयोगी रणनीति प्रदान करना चाहिए।
यहाँ हम एक विधि है कि पृथक परिसरों के नीले देशी पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ सामान्य एपीटोप आधारित आत्मीयता शुद्धि को जोड़ती है, मात्रात्मक बड़े पैमाने पर एसपी द्वारा पीछा किया वर्णनectrometry और प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा, कई विधानसभाओं एक प्रोटीन में शामिल किया जा सकता है हल करने के लिए। हम मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं जहां ब्याज की एक प्रोटीन एक एपीटोप टैग करने के लिए जुड़े हुए अंतर्जात ठिकाना से व्यक्त किया जाता है शारीरिक बहुतायत के करीब प्राप्त करने और कुशल देशी सुनिश्चित करने के लिए रोजगार जटिल अलगाव। यह दृष्टिकोण कई बातचीत unravels एक प्रोटीन में संलग्न है, उन्हें, उनके सह-संबंध प्रोफाइल के आधार पर अलग-अलग विधानसभाओं में हल करने पारंपरिक geLC-एमएस 20 से अधिक नहीं काम की आवश्यकता होती है, जबकि।
यहाँ, हम प्रोटीन परिसरों को हल करने आत्मीयता मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में नीले देशी जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद शुद्धि के उपयोग का वर्णन। यह दृष्टिकोण क्रियात्मक प्रोटीन विधानसभाओं में एक आयामी प्रोटीन बातचीत सूचियों को जानने के लिए एक विधि प्रदान करता है।
हम विधि एपीटोप-टैग प्रोटीन के उपयोग पर आधारित का प्रदर्शन। हालांकि, अगर एक सेल लाइन एक टैग प्रोटीन व्यक्त उपलब्ध नहीं है, एक विकल्प के हित के प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करने, उपलब्ध कराई गई एक पेप्टाइड देशी प्रतिस्पर्धी क्षालन प्राप्त करने के लिए उपलब्ध नहीं है हो सकता है। सामग्री और मोती की मात्रा शुरू करने की राशि लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है। हम आम तौर पर 2-5 x 10 8 कोशिकाओं सामग्री शुरू करने के साथ इस प्रोटोकॉल करते हैं, और यह और भी कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ प्रोटीन के लिए पर्याप्त है। lysis बफर रचना अनुभव से चुना जाना चाहिए प्राप्त करने के लिएके पास चारा के solubilization पूरा करने के लिए। इस प्रोटीन के कुछ प्रकार के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, विशेष रूप से क्रोमेटिन बंधन या झिल्ली प्रोटीन में। वैकल्पिक विकल्प, नमक की मात्रा बढ़ती है, बशर्ते कि अध्ययन के तहत प्रोटीन जटिल उच्च नमक, या क्रोमेटिन बंधनकारी प्रोटीन 20, 29 के लिए sonication और / या nuclease उपचार का उपयोग करने में स्थिर है शामिल हैं। झिल्ली प्रोटीन के मामले में, DDM या digitonin के लिए डिटर्जेंट स्विचिंग उचित 30 हो सकता है। DNA बाइंडिंग प्रोटीन के मामले में, यह एक nuclease जैसे शुद्धि कदम 20 के दौरान Benzonase शामिल करने के लिए उपयोगी है। न्यूक्लिक एसिड को पूरी तरह निकाला सुनिश्चित करता है कि बातचीत का पता चला प्रोटीन के बीच होते हैं और डीएनए द्वारा मध्यस्थता नहीं कर रहे हैं।
एक महत्वपूर्ण तत्व पर विचार करने के लिए जब इस दृष्टिकोण का उपयोग कर जांच की जा रही जटिल की स्थिरता है। प्रक्रिया लंबी है और preservin शामिल हो सकता हैग्राम प्रोटीन जटिल रात भर। हम दो क्रोमेटिन remodeling परिसरों (डी बोडे और एम पार्डो, नहीं दिखाया डेटा) के साथ अच्छे सफलता हासिल की है, लेकिन यह मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यदि आवश्यक हो तो आत्मीयता शुद्धि कदम छोटा किया जा सकता।
वैकल्पिक तकनीकों कि देशी विभाजन की अनुमति देते हैं, इस तरह के आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के रूप में, व्यापक रूप से प्रोटीन परिसरों चिह्नित करने के लिए 50 से अधिक वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम और दूसरों से पता चला है नीले देशी पेज के संकल्प आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी 20, 31, 32, 33 का प्रयोग कर प्राप्त है कि करने के लिए बेहतर है। नीले देशी पृष्ठ का एक और लाभ यह है कि यह क्रोमैटोग्राफी प्रणाली है, जो महंगे हैं की आवश्यकता नहीं है, बल्कि प्रोटीन electrophoretic उपकरण है कि प्रयोगशालाओं में व्यापक है उपयोग करता है। के संदर्भ में हाथ समय, इस विधि की तुलना में परंपरागत geLC-एमएस / एमएस एक और अधिक काम शामिल नहीं करता हैpproach या ऑफलाइन chromatographic विभाजन। हालांकि, ज्यादातर विभाजन तकनीक करते हैं, यह उनके समाधान करने के लिए एक सीमा होती है। परिसर है कि बहुत सजातीय या बड़े पैमाने पर और आकार में करीब हैं संकल्प नीले देशी पेज द्वारा की पेशकश की है, और इसलिए प्रोटोकॉल के रूप में यहां सूचना साझा सब यूनिटों के साथ अलग परिसरों को हल करने में सर्वत्र सफल नहीं हो सकता है परे हो सकता है। प्रोत्साहन, हम तीन सब यूनिटों (एम पार्डो, तैयारी में पांडुलिपि) को साझा करने के दो बहुत ही इसी तरह की tetrameric परिसरों को अलग करने में सफल रहे हैं।
के बाद से मास स्पेक्ट्रोमेट्री तेजी से संवेदनशील बन गया है, गैर विशिष्ट interactors और प्रदूषक के भी मिनट मात्रा में एपी एमएस नमूनों में पता लगाया जा सकता। यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण प्रवास चोटियों के साथ प्रोटीन की तुलना में अधिक आणविक भार पर चारा प्रवास चोटियों के साथ मेल खाना पर ध्यान केंद्रित द्वारा आत्मीयता शुद्धि में पृष्ठभूमि संक्रमण से वास्तविक interactors के भेदभाव करने में सहायता कर सकते हैंमोनोमेरिक प्रोटीन।
कई समूह पिछले अलगाव 10, 11, 12, 34 के लिए आवश्यकता के बिना सेलुलर पैमाने पर प्रोटीन परिसरों चित्रित करने के लिए प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा के बाद विभाजन तकनीक का इस्तेमाल किया है। हालांकि, इस उप stoichiometric बातचीत का पता लगाने के विफलता हो सकती है। आत्मीयता शुद्धि के माध्यम से एक संवर्धन कदम का समावेश इस पर काबू पाने के लिए कर सकते हैं। दृष्टिकोण यहाँ वर्णित प्रोटीन परिसरों की टोपोलॉजी की खोज और कई परिसरों किसी दिए गए प्रोटीन ही सेलुलर संदर्भ में में भाग लेता है को उजागर करने के लिए आम तौर पर उपयोगी होना चाहिए। रणनीति सरल और प्रयोगशालाओं कि प्रोटीन परिसरों को हल करने महंगा chromatographic विभाजन उपकरण नहीं हो सकता है के लिए उत्तरदायी है।
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).
Protein G Dynabeads | Life Technologies | 10003D | |
FLAG antibody M2 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
Tween-20, protein grade, 10% solution | Millipore | 655206 | |
Dimethyl pimelimidate | Sigma-Aldrich | 80490 | |
0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2 | Sigma-Aldrich | T0449 | |
3x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
Vivaspin 5K NMWCO, PES | Sartorius | VS0112 | |
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel | Life Technologies | BN1001 | |
20x NativePAGE Running Buffer | Life Technologies | BN2001 | |
20x NativePAGE Cathode Additive | Life Technologies | BN2002 | |
4x NativePAGE sample loading buffer | Life Technologies | BN2003 | |
NativeMARK | Life Technologies | LC0725 | |
NativePAGE 5% G-250 sample additive | Life Technologies | BN2004 | |
Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene | Thermo | 249944 | |
Multiscreen HTS 96-well filtration system | Thermo | MSDVN6550 | |
Nunc 96-well cap natural | Thermo | 276002 | |
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A/0627/17 | |
Trypsin, sequencing grade | Roche | 11418475001 | |
Software | |||
MaxQuant (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant |
Perseus (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus |