Здесь представлены протоколы для аффинной очистки белковых комплексов и их разделения по синим нативного PAGE с последующим профилированием белка корреляции с использованием меток бесплатного количественного масс-спектрометрии. Этот метод полезен для решения интерактомов Into различных белковых комплексов.
Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.
В клетках, большинство белков выполняют свои функции через транзиторных белок-белковых взаимодействий, или путем формирования стабильных белковых агрегатов. Характеризуя белковые взаимодействия имеет решающее значение для полного понимания клеточных процессов. Сродство очистки в сочетании с масс-спектрометрией (AP-MS) является одним из наиболее часто применяемых стратегий для выявления нативные белковых взаимодействий. Значительные улучшения в возможностях инструментов, достигнутых в последнее десятилетие сделали этот подход чрезвычайно мощным. Важно отметить, что взаимодействия, выявленные в экспериментах AP-MS включают смесь прямых и косвенных ассоциаций между приманкой и охотится. Кроме того, часто белки принимают участие в нескольких различных комплексов в пределах одной и той же сотовой связи, которые могут иметь различные биологические функции, и, следовательно, interactors, которые определены с помощью AP-MS может представлять собой смесь различных белковых агрегатов или функциональных объектов. Это не возможно получитьтакая топологическая информация априори из моно-мерных списков белков , полученных с помощью простых экспериментов AP-MS. Тем не менее, этот метод может быть использован в дальнейшем, чтобы определить архитектуру белковых комплексов путем объединения его с одним или несколькими способами, чтобы решить эти сборки.
Для решения топологии белковых взаимодействий, определенных с помощью AP-MS, несколько стратегий, которые были применены. Один из подходов заключаются в выполнении итеративных экспериментов AP-MS с использованием охотится , указанные в предыдущем туре экспериментов , как приманки 1. Хотя очень информативный, это довольно интенсивная задача труда экспериментально и аналитически. Белок сшивание в сочетании с масс – спектрометрией все чаще используется для получения топологической информации о белковых комплексов 2, 3, 4, 5. Тем не менее, computatioNAL анализ сшитых пептидов по-прежнему остается сложной задачей, и, следовательно, является узким местом в процессе. Появление МС-расщепляемые сшивающих реагентов должно облегчить отображение аминокислотных остатков , которые находятся в непосредственной близости от взаимодействующих белков в 6, 7. Другой альтернативой является сочетание аффинной очистки с предыдущими методами разделения ортогональных 8, 9. Хроматографическое фракционирование с помощью гель – фильтрации или ионного обмена, или градиенте сахарозы фракционирования также недавно были использованы в сочетании с количественным масс – спектрометрии для описания мультибелковых комплексов на уровне всей системы, минуя сложный этап изоляции 10, 11, 12, 13. Электрофорез Синий гель родной полиакриламид (BN-PAGE) широко применяется дляисследовать нативные белковые взаимодействия, как правило , те , которые вовлекают митохондриальную мембрану белковых комплексов 14. Этот метод разделения был также недавно использован в сочетании с этикеткой , свободной от белков и количественной оценкой корреляции профилирования, а не только на митохондриальных комплексах 15, 16, 17, но и для распутывания других белковых комплексов из целых клеток 18, 19. Мы предположили, что комбинация аффинной очистки с последующими нативными подходами фракционирования и количественным MS должна обеспечивать полезную стратегию для решения нескольких сборок белков, содержащих конкретный белок.
Здесь мы опишем метод, который сочетает в себе общий эпитоп на основе аффинной очистки с синим нативного электрофореза в полиакриламидном геле выделенных комплексов, с последующим количественным массового зрectrometry и белок корреляция профилирование, чтобы решить многочисленные сборки белок, может быть задействованы. Мы используем мышиные эмбриональные стволовые клетки, где интерес белок слит с эпитоп теге экспрессируется эндогенным локус для достижения близких к физиологическому изобилию и обеспечить эффективную уроженку комплекс изоляции. Этот подход распутывает множественные взаимодействия белка участвует в, разрешая их в различные сборки на основе их корреляция профилей, в то время как не требующие больше работы , чем обычные НЕЦЫ-MS 20.
Здесь мы опишем использование аффинной очистки с последующим синим электрофореза нативного гель в сочетании с количественной масс-спектрометрии для решения белковых комплексов. Этот подход предлагает способ распутать одномерные списки взаимодействия белка в функциональных белковых агрегатов.
Мы демонстрируем метод, основанный на использовании эпитопов меченых белков. Однако, если линия клеток, экспрессирующих белок, помеченный не доступна, альтернативой может быть использование антител против белка, представляющего интерес, при условии, есть пептид, доступный для достижения нативный конкурентного элюирования. Количество исходного материала и количества гранул, возможно, должно быть изменено в зависимости от уровня экспрессии белка-мишени. Мы обычно выполняют этот протокол с 2-5 × 10 8 клеток исходного материала, и этого достаточно даже для белков с низким уровнем экспрессии. Состав буфера для лизиса должен быть выбран эмпирический для достижениярядом с полной солюбилизации приманки. Это может быть сложным для некоторых типов белков, в частности хроматина связывания или мембранных белков. Альтернативные варианты включают в себя увеличение количества соли, при условии , что сложный белок при исследовании устойчиво в высокой концентрации соли, или с помощью ультразвука и / или лечения нуклеазы для хроматина связывающих белков 20, 29. В случае мембранных белков, переключая моющее средство DDM или дигитонину может быть целесообразным 30. В случае ДНК – связывающие белки, это полезно включать нуклеазу , такую как бензоназу во время стадии очистки 20. Полное удаление нуклеиновых кислот гарантирует, что взаимодействие обнаруженное происходит между белками и не опосредованы ДНК.
Критический элемент следует учитывать при использовании этого подхода является стабильность комплекса под следствием. Процедура долго и может включать в себя preservinг белка комплекс в течение ночи. Мы достигли хороших успехов с двух хроматина комплексов (Д. Боде и М. Пардо, данные не показаны), но это должно быть оценено. Стадия аффинной очистки может быть сокращена, если это необходимо.
Альтернативные методы, позволяющие родное фракционирование, такие как гель-проникающая хроматография, которые широко используются в течение более 50 лет, чтобы охарактеризовать белковые комплексы. Мы и другие показали , что разрешение синего нативного PAGE превосходит , что достигается с помощью эксклюзионной хроматографии на 20, 31, 32, 33. Еще одно преимущества голубого нативного ПААГА является то, что он не требует системы хроматографии, которые являются дорогостоящими, а использует белка электрофоретическое оборудование, которое широко распространен в лабораториях. С точки зрения практического времени, этот метод не предполагает больше работы, чем традиционные НЕЛЦ-MS / MS аpproach или отсутствует хроматографического фракционирования. Однако, как и большинство методов фракционирования, она имеет предел их разрешения. Комплексы, которые очень однородна или близки по массе и форме, может быть за разрешением, предложенной синим нативного ПААГ, и, следовательно, протокол, как сообщалось здесь не может быть универсально успешным в решении различных комплексов с общими субъединиц. Обнадеживает то, что мы добились успеха в выделении двух очень похожих тетрамерные комплексов обмена трех субъединиц (М. Пардо, рукописи в процессе подготовки).
Так как масс-спектрометрия становится все более чувствительным, даже незначительные количества неспецифических interactors и загрязняющих веществ могут быть обнаружены в образцах АП-MS. Подход, представленный здесь, может помочь в различении реальных interactors от фонового загрязнения в аффинных очистках, сосредоточив внимание на белках с миграционными пиками, совпадающий с приманкой миграции пиками при более высокой молекулярной массе, чем умономерные белки.
Несколько групп использовали методы фракционирования с последующими профилированием белка корреляции очертить белковые комплексы на клеточном уровне без необходимости предварительного выделения 10, 11, 12, 34. Тем не менее, это может привести к невозможности обнаружить суб-стехиометрических взаимодействия. Включение обогащения, шаг через аффинной очистки может помочь преодолеть это. Описанный здесь подход должен быть в целом полезен для изучения топологии белковых комплексов и разгадывая множество комплексов данного белка принимает участие в пределах одной и той же сотовой связи. Стратегия проста и поддающийся лабораторию, которые не могут иметь дорогое хроматографическое фракционирование оборудования для решения белковых комплексов.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).
Protein G Dynabeads | Life Technologies | 10003D | |
FLAG antibody M2 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
Tween-20, protein grade, 10% solution | Millipore | 655206 | |
Dimethyl pimelimidate | Sigma-Aldrich | 80490 | |
0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2 | Sigma-Aldrich | T0449 | |
3x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
Vivaspin 5K NMWCO, PES | Sartorius | VS0112 | |
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel | Life Technologies | BN1001 | |
20x NativePAGE Running Buffer | Life Technologies | BN2001 | |
20x NativePAGE Cathode Additive | Life Technologies | BN2002 | |
4x NativePAGE sample loading buffer | Life Technologies | BN2003 | |
NativeMARK | Life Technologies | LC0725 | |
NativePAGE 5% G-250 sample additive | Life Technologies | BN2004 | |
Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene | Thermo | 249944 | |
Multiscreen HTS 96-well filtration system | Thermo | MSDVN6550 | |
Nunc 96-well cap natural | Thermo | 276002 | |
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A/0627/17 | |
Trypsin, sequencing grade | Roche | 11418475001 | |
Software | |||
MaxQuant (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant |
Perseus (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus |