Här presenterar vi protokoll för affinitetsrening av proteinkomplex och deras separation genom blå nativ PAGE, följt av proteinkorrelations profilering med hjälp av etikett fri kvantitativ masspektrometri. Denna metod är användbar för att lösa interactomes i distinkta proteinkomplex.
Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.
I celler, de flesta proteiner utföra sina uppgifter genom tillfälliga protein-proteininteraktioner eller genom att bilda stabila proteinaggregat. Karakterisera proteininteraktioner är avgörande för att fullt ut förstå cellulära processer. Affinitetsrening i kombination med masspektrometri (AP-MS) är en av de mest allmänt tillämpade strategier för att identifiera nativa proteininteraktioner. Betydande förbättringar i instrument kapacitet uppnås under det senaste decenniet har gjort denna metod extremt kraftfull. Det är viktigt att notera att de interaktioner som identifieras av AP-MS försök innefattar en blandning av direkta och indirekta samband mellan bete och bytesorganismer. Dessutom ofta proteiner delta i flera olika komplex inom samma cellulära sammanhang, som kan ha olika biologiska roller, och därför interactmedlemmarna som identifieras av AP-MS kan representera en blandning av distinkta proteinaggregaten eller funktionella enheter. Det är inte möjligt att härledasådan topologisk information som a priori från mono-dimensionell listor av proteiner alstrade genom enkla AP-MS experiment. Emellertid, kan tekniken utnyttjas ytterligare för att definiera arkitekturen av proteinkomplex genom att kombinera det med ett eller flera förfaranden för att lösa dessa aggregat.
För att lösa topologin för proteininteraktioner som identifierats genom AP-MS, har flera strategier tillämpats. Ett tillvägagångssätt är att utföra iterativ AP-MS-försök med användning av de bytesorganismer identifierade i en tidigare runda av experiment som beten 1. Även om mycket informativt, är detta en ganska arbetsintensiv uppgift både experimentellt och analytiskt. Protein tvärbindning i kombination med masspektrometri används alltmer för att härleda topologisk information om proteinkomplex 2, 3, 4, 5. Men computational analys av tvärbundna peptiderna fortfarande förblir en utmanande uppgift och följaktligen är flaskhalsen i arbetsflödet. Tillkomsten av MS-klyvningsbara tvärbindningsreagens bör underlätta kartläggningen av de aminosyrarester som är i omedelbar närhet i interagerande proteiner 6, 7. Ett annat alternativ är att kombinera affinitetsrening med tidigare ortogonala separationstekniker 8, 9. Kromatografisk fraktionering genom gelfiltrering eller jonbyte, eller sukrosgradientfraktionering har också nyligen använts i kombination med kvantitativ masspektrometri för att beskriva multiproteinkomplex vid en systemomfattande nivå, förbi den komplexa isoleringssteget 10, 11, 12, 13. Blå nativ polyakrylamidgelelektrofores (BN-PAGE) har i stor utsträckning för attundersöka nativa proteininteraktioner, typiskt de som inbegriper mitokondriell membranproteinkomplex 14. Denna separationsteknik har också nyligen använts i kombination med etikett-fritt protein kvantifiering och korrelations profilering, inte bara på mitokondriella komplex 15, 16, 17, utan också för unraveling andra proteinkomplex från hela celler 18, 19. Vi hypotesen att kombinationen av affinitetsrening med efterföljande nativa fraktioneringsmetoder och kvantitativ MS bör tillhandahålla en användbar strategi för att lösa flera proteinaggregat som innehåller ett särskilt protein.
Här beskriver vi en metod som kombinerar generisk epitop baserad affinitetsrening med blå nativ polyakrylamidgelelektrofores av de isolerade komplexen, följt av kvantitativ mass spectrometry och proteinkorrelations profilering, för att lösa de multipla aggregaten ett protein kan vara inblandade i. Vi använder mus embryonala stamceller där ett protein av intresse smält till en epitopmärkning uttrycks från den endogena lokuset för att uppnå nära fysiologiskt överflöd och säkerställa effektiv nativa komplex isolering. Detta tillvägagångssätt unravels de multipla interaktioner ett protein ingriper i, lösa dem i distinkta aggregat baserat på deras korrelations profiler, samtidigt som inte kräver mer arbete än konventionell geLC-MS 20.
Här beskriver vi användningen av affinitetsrening följt av blå nativ gelelektrofores i kombination med kvantitativ masspektrometri för att lösa proteinkomplex. Detta tillvägagångssätt erbjuder en metod för att riva upp endimensionella proteininteraktionslistor i funktionella proteinaggregat.
Vi visar den metod som bygger på användning av epitopmärkta proteiner. Emellertid, om en cellinje som uttrycker ett märkt protein inte är tillgänglig, kanske ett alternativ vara att använda antikroppar mot proteinet av intresse, förutsatt att det är en peptid som finns för att uppnå nativt kompetitiv eluering. Den mängd utgångsmaterial och mängd av pärlor kan behöva modifieras beroende på expressionsnivån av målproteinet. Vi utför typiskt detta protokoll med 2-5 x 10 8 celler utgångsmaterial, och detta är tillräckligt även för proteiner med låg expressionsnivå. Lysbufferten kompositionen bör väljas empiriskt för att uppnånära att slutföra upplösningen av betet. Detta kan vara svårt för vissa typer av proteiner, i synnerhet kromatin-bindning eller membranproteiner. Alternativ är att öka mängden av salt, förutsatt att proteinkomplexet som studeras är stabilt i hög salthalt, eller med användning av sonikering och / eller nukleasbehandling för kromatin bindande proteiner 20, 29. I fallet av membranproteiner, kan omkopplings detergent till DDM eller digitonin vara tillrådligt 30. I fallet med DNA-bindande proteiner, är det användbart att inkludera ett nukleas såsom Benzonase under reningssteget 20. Fullständigt avlägsnande av nukleinsyror säkerställer att interaktioner detekterade ske mellan proteiner och är inte medieras av DNA.
Ett kritiskt element att beakta när man använder denna metod är stabiliteten hos komplexet som undersöks. Tillvägagångssättet är lång och kan innebära preserving proteinkomplexet över natten. Vi har uppnått god framgång med två kromatinremodellering komplex (D. Bode och M. Pardo, data visas inte), men detta bör utvärderas. Steget affinitetsrening kan förkortas om så erfordras.
Alternativa tekniker som gör att nativt fraktione, såsom storleksexklusionskromatografi, har i stor utsträckning använts i över 50 år för att karakterisera proteinkomplex. Vi och andra har visat att lösningen av blå nativ PAGE är överlägsen den som uppnås med användning av storlekssorterande kromatografi 20, 31, 32, 33. En annan fördel med blå nativ PAGE är att den inte kräver kromatografisystem, som är dyrt, utan snarare använder protein elektroforesutrustning som är utbredd i laboratorier. När det gäller praktisk tid, den här metoden inte innebär mer arbete än den traditionella geLC-MS / MS aILLVÄGAGÅNGSSÄTT eller offline kromatografisk fraktionering. Men eftersom de flesta fraktioneringstekniker gör, har det en gräns för sin upplösning. Komplex som är mycket homogen eller nära i massa och form kan vara bortom upplösning som erbjuds av blått infödd PAGE, och därmed det protokoll som rapporteras här är kanske inte allmänt framgångsrik i att lösa olika komplex med delade subenheter. Uppmuntrande, har vi varit framgångsrika i att separera två mycket likartade tetra komplex som delar tre subenheter (M. Pardo, manuskript under utarbetande).
Eftersom masspektrometri blivit allt känsligare, kan även mycket små mängder av icke-specifika Interactmedlemmar och föroreningar detekteras i AP-MS-proverna. Den metod som presenteras här kan hjälpa till vid diskriminering av verkliga interactmedlemmar från bakgrundskontaminering i affinitetsrening genom att fokusera uppmärksamheten på proteiner med migrations toppar som sammanfaller med bete migrations toppar vid högre molekylvikt än den hosde monomera proteiner.
Flera grupper har använt fraktioneringstekniker, följt av proteinkorrelations profilering att avgränsa proteinkomplex vid cellulär skala utan behov av föregående isolering 10, 11, 12, 34. Detta kan dock innebära att upptäcka under stökiometriska interaktioner. Inkorporeringen av ett anrikningssteg genom affinitetsrening kan hjälpa till att övervinna detta. Det tillvägagångssätt som beskrivs här bör vara allmänt användbar för att utforska topologi av proteinkomplex och unraveling de multipla komplexen ett givet protein tar del i inom samma cellulära sammanhanget. Strategin är enkel och mottaglig för laboratorier som inte kan ha dyra kromatografiska fraktione utrustning för att lösa proteinkomplex.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).
Protein G Dynabeads | Life Technologies | 10003D | |
FLAG antibody M2 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
Tween-20, protein grade, 10% solution | Millipore | 655206 | |
Dimethyl pimelimidate | Sigma-Aldrich | 80490 | |
0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2 | Sigma-Aldrich | T0449 | |
3x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
Vivaspin 5K NMWCO, PES | Sartorius | VS0112 | |
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel | Life Technologies | BN1001 | |
20x NativePAGE Running Buffer | Life Technologies | BN2001 | |
20x NativePAGE Cathode Additive | Life Technologies | BN2002 | |
4x NativePAGE sample loading buffer | Life Technologies | BN2003 | |
NativeMARK | Life Technologies | LC0725 | |
NativePAGE 5% G-250 sample additive | Life Technologies | BN2004 | |
Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene | Thermo | 249944 | |
Multiscreen HTS 96-well filtration system | Thermo | MSDVN6550 | |
Nunc 96-well cap natural | Thermo | 276002 | |
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A/0627/17 | |
Trypsin, sequencing grade | Roche | 11418475001 | |
Software | |||
MaxQuant (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant |
Perseus (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus |