Summary
هنا نقدم بروتوكول للكشف عن التعبير ميكرورنا في الفئران الغشاء البريتوني باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي عكس النسخ البلمرة سلسلة من ردود الفعل. هذه الطريقة مناسبة لدراسة الملف الشخصي التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني الفئران في العديد من الحالات المرضية.
Abstract
ميكرورناس (ميرناس) هي رنا غير نكودينغ الصغيرة التي تنظم رسول رسول التعبير بعد ترانسكريبتيونالي. وقد تم التحقيق في الملف الشخصي التعبير ميرنا في مختلف الأجهزة والأنسجة في الفئران. ومع ذلك، لم يتم تأسيس أساليب موحدة لتنقية ميرناس والكشف عن التعبير في الغشاء البريتوني الفئران راسخة. قمنا بتطوير طريقة فعالة وموثوق بها لتنقية وتحديد ميرناس باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي عكس النسخ البلمرة سلسلة من ردود الفعل (كرت-ير) في الفئران الغشاء البريتوني. يتكون هذا البروتوكول من أربع خطوات: 1) تنقية عينة الغشاء البريتوني. 2) تنقية رنا الكلي بما في ذلك ميرنا من عينة الغشاء البريتوني. 3) النسخ العكسي من ميرنا لإنتاج [كدنا]؛ و 4) كرت-ير للكشف عن التعبير ميرنا. باستخدام هذا البروتوكول، قررنا بنجاح أن التعبير عن ستة ميرناس (ميرنا-142-3p، ميرنا-21-5p، ميرنا-221-3p، ميرنا -223-3p، ميرنا -327، و ميرنا -34a-5P) زيادةبشكل ملحوظ في الغشاء البريتوني من الفئران نموذج التليف البريتوني مقارنة مع تلك الموجودة في مجموعات السيطرة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة الملف الشخصي للتعبير ميرنا في الغشاء البريتوني من الفئران في العديد من الحالات المرضية.
Introduction
ميكرورناس (ميرناس) قصيرة، رناس غير الشفرة التي بعد ترانسكريبتيونالي تنظيم رنا رسول (مرنا) التعبير 1 . التغيرات في التعبير عن ميرناس تنظيم التعبير عن العديد من مرناس التي تلعب الأدوار المحورية في مختلف الظروف المرضية، بما في ذلك السرطان، والتهاب، واضطرابات التمثيل الغذائي، والتليف 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 . لذلك، ميرناس لها إمكانات المؤشرات الحيوية الرواية والأهداف العلاجية 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 . وقد تم تحديد الملف الشخصي التعبير ميرنا في مختلف الفئرانوالأعضاء والأنسجة، بما في ذلك الكبد والقلب والرئة والكلى 9 . ومع ذلك، لم يتم تأسيس أساليب موحدة لتنقية وكشف عن ميرناس في الغشاء البريتوني الفئران راسخة.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو لتنقية بنجاح وكشف ميرناس في الغشاء البريتوني الفئران. أولا، تم تجانس عينة الغشاء البريتوني باستخدام الخالط الزجاج، تليها التعرض لنظام التمزق الحيوي البوليمر في عمود تدور ميكروسنتريفوج 10 . بعد ذلك، تم تنقية مجموع الحمض النووي الريبي بما في ذلك ميرنا من عينة الغشاء البريتوني باستخدام عمود تدور غشاء السيليكا القائمة على 10 . ثم، تم تصنيعه [كدنا] من الحمض النووي الريبي مجموع المنقى باستخدام ترانسكريبتاس العكسي، بولي (A) البلمرة، و أوليغو دت التمهيدي 11 . وأخيرا، تم تحديد التعبير عن ميرنا بواسطة كرت-ير باستخدام صبغ مقحم 11 . والأساس المنطقي لهذا البروتوكول هو بأسيد على الدراسات السابقة التي أظهرت تنقية كبيرة والكشف عن ميرنا في الأنسجة عن طريق عملية بسيطة 8 ، 10 ، 11 . وقد أفيد بأن استخدام نظام تمزيق بيوليمر الحيوية في عمود تدور ميكروسنتريفوج والعمودي تدور الغشاء السيليكا الغشاء يمكن تنقية عالية الجودة الحمض النووي الريبي مجموع من الأنسجة 10 . وقد تم الإبلاغ عن طريقة توليف [كدنا] من تنقية الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام ترانسكريبتاسيس العكسي، بولي (A) البلمرة، و أوليغو دت التمهيدي، وطريقة الكشف عن التعبير ميرنا بواسطة كرت-ير باستخدام صبغ مقحم في هذا البروتوكول لإظهار دقة عالية و حساسية 11 . وبالإضافة إلى ذلك، وهذا هو عملية بسيطة، مما يوفر الوقت ويمنع الخطأ التقني. لذلك، هذا البروتوكول مفيد في الدراسات التي تتطلب الكشف دقيقة للغاية وحساسة من ميرنا في الفئران الغشاء البريتوني في مجموعة واسعة من الحالات المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية الحيوانية من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوانية من جامعة جيتشي الطبية وأجري وفقا وفقا لرعاية واستخدام المبادئ التوجيهية الحيوانات التجريبية من دليل جامعة جيتشي الطبية للحيوانات المختبر.
1. البريتوني جمع العينات
- جمع العناصر التالية: 50 مل أنبوب الطرد المركزي مع القطن منقوع في إيسوفلوران، ورقة الفلين، طبق بتري مع الفوسفات مخزنة المالحة (بس)، مقص الجراحية، وملقط.
- الموت ببطء الفئران مع جرعة زائدة من إيسوفلوران، ثم رش الجلد في البطن من الفئران مع الايثانول 70٪، وجبل الفئران على ورقة الفلين على ظهرها.
- جعل شق طولي في الجلد في البطن، والعضلات، والغشاء البريتوني باستخدام مقص وملقط.
- التقاط الغشاء البريتوني باستخدام ملقط، وجعل الشقوق الأفقية على الجزء العلوي على طول العظم الضلع السفلي تحت الحجاب الحاجز وعلى لأور، جانب، عن، ال التعريف، جانبي، اقليم، الاستعمال، ال التعريف، جراحية، سسيسورس. المقبل، وجعل الشقوق الطولية الجانبية لإزالة الغشاء البريتوني من الجسم باستخدام مقص جراحي. ثم، وغسله مع برنامج تلفزيوني في طبق بتري.
- قطع وتقليم 20 ملغ (3-5 ملم 2 ) من عينات الغشاء البريتوني، وهو حجم مناسب للخطوات التالية، وذلك باستخدام مقص جراحي وملقط.
2. تنقية رنا الكلي من عينات الغشاء البريتوني
ملاحظة: هنا، يتم تجانس عينات الغشاء البريتوني وزنها 20 ملغ باستخدام الخالط الزجاج ونظام تمزيق بيوليمر الحيوية في العمود تدور ميكروسنتريفوج. ثم، يتم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من عينة الغشاء البريتوني باستخدام عمود تدور الغشاء السيليكا الغشاء.
- جمع العناصر التالية: 1.5 أو 2.0 مل أنابيب ميكروسنتريفوج، الإيثانول بنسبة 100٪، الكلوروفورم، الخالط الزجاج، والجليد، ونظام تمزيق البوليمر الحيوي في عمود تدور ميكروسنتريفوج 10 10 ، الفينول / كوانيدين القائم على تحلل كاشف، غسل العازلة بما في ذلك غوانيدين والإيثانول (غسل العازلة 1)، وغسل العازلة بما في ذلك الإيثانول (غسل العازلة 2).
- وضع 20 ملغ عينة الغشاء البريتوني في الخالط الزجاج وإضافة 700 ميكرولتر من الكاشف تحلل القائم على الفينول / غوانيدين.
- تجانس عينة الغشاء البريتوني عن طريق الضغط ببطء على مدقة على العينة مع التواء. كرر هذه العملية عدة عشرات من المرات على الجليد حتى عينة الغشاء البريتوني قد حلت تماما في كاشف تحلل القائم على الفينول / غوانيدين.
- لمزيد من التجانس، نقل المحللة المتجانس إلى نظام تمزيق البوليمر الحيوي في عمود تدور ميكروسنتريفوج في أنبوب جمع 2.0 مل. ثم، أجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نقل المحللة المتجانس إلى أنبوب ميكروسنتريفوج جديد.
- إضافة 140 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى المحللة المتجانسة وغطاء الحوضe بشكل آمن. ثم، مزيج أنبوب عن طريق انقلاب لمدة 15 ثانية.
- احتضان العينات لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، أجهزة الطرد المركزي لهم في 12000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل طاف (عادة 300 ميكرولتر) إلى أنبوب ميكروسنتريفوج جديد دون إزعاج راسب، وإضافة 1.5X حجمه (عادة 450 ميكرولتر) من الايثانول بنسبة 100٪. ثم، مزج العينة بواسطة فورتيكسينغ لمدة 5 ثوان.
- ماصة تصل إلى 700 ميكرولتر من العينة في عمود تدور الغشاء السيليكا الغشاء وضعت في أنبوب جمع 2.0 مل. أغلق غطاء العمود. ثم، أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي، وتجاهل تدفق من خلال في أنبوب جمع.
- إضافة 700 ميكرولتر من غسل العازلة 1 إلى عمود تدور الغشاء السيليكا الغشاء لغسل بعنف العينة. أغلق غطاء العمود. ثم، أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي، وتجاهل تدفق من خلال في أنبوب جمع.
- إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة 2 إلى السيليكا-ممبرن القائم على عمود تدور لإزالة أي أثر للملح. أغلق غطاء العمود. ثم، أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي، وتجاهل تدفق من خلال في أنبوب جمع.
- كرر 2.11.
- أجهزة الطرد المركزي العمودية تدور على غشاء السيليكا الغشاء مرة أخرى في 15،000 x ج لمدة 1 دقيقة. بعد الطرد المركزي، وتجاهل تدفق من خلال في أنبوب جمع.
- وضع عمود تدور الغشاء السيليكا الغشاء في أنبوب جمع 1.5 مل جديد. ثم، ونقل 25 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه في العمود. أغلق غطاء العمود. ترك العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم، أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة.
- نقل 25 ميكرولتر شطافة تحتوي على مجموع الحمض النووي الريبي إلى أنبوب ميكروسنتريفوج جديد. ثم، تخزينه في -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.
3. النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي مجموع
ملاحظة: مرجع والالتزام الحد الأدنى من المعلومات لنشر الكمي في الوقت الحقيقي ير التجربة(ميق) تشجع ممارسة أفضل وتساعد في الحصول على نتائج موثوقة لا لبس فيها 12 .
ملاحظة: هنا، ما مجموعه 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي معزولة هو عكس مكتوبة باستخدام ترانسكريبتاسيس العكسي، بولي (A) البلمرة، و أوليغو دت التمهيدي.
- جمع العناصر التالية: 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج. أنابيب الشريط ثمانية جيدا. ريبونوكلياز المياه مجانا. جليد؛ مجموعة النسخ العكسي (انظر جدول المواد) 11 .
- إعداد حل مزيج الرئيسي الذي يحتوي على 2.0 ميكرولتر من مزيج حمض النووي 10X، 2.0 ميكرولتر من مزيج ترانسكريبتاس العكسي (من عدة)، و 4.0 ميكرولتر من العازلة مرحبا 5X المواصفات لما مجموعه 8.0 ميكرولتر لكل أنبوب.
- الاستغناء 8.0 ميكرولتر من حل مزيج الرئيسي (من عدة) في كل أنبوب.
- قياس كمية من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مقياس الطيف الضوئي. إضافة 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع معزولة تنقيته من عينة الغشاء البريتوني إلى كل أنبوب.
ملاحظة: كرت-ير يمكن أن يؤديها وسينغ رنا الكلي كقالب دون النسخ العكسي لمراقبة الجودة من الحمض النووي الريبي مجموع المنقى. إذا ملوث أي دنا، ويلاحظ منتجات التضخيم غير متوقعة من قبل كرت-ير. - إضافة ريبونوكلياز خالية من المياه إلى كل أنبوب إلى ما مجموعه 20 ميكرولتر. ثم، تخلط جيدا عن طريق بيبتينغ وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية.
- احتضان العينات لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. احتضان فورا لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة في سيكلر الحرارية. - نقل [كدنا إلى أنبوب ميكروسنتريفوج جديد وتمييع عشر مرات (1:10) مع المياه خالية من ريبونوكلياز.
- تخزين كدنا المخفف على الجليد مؤقتا، وعند -80 درجة مئوية على المدى الطويل قبل الاستخدام.
4. كرت-ير من ميرنا
ملاحظة: يتم تنفيذ كرت-ير من ميرنا باستخدام صبغ مقحم. هنا، الاشعال ل رنا، U6 النووية الصغيرة 2 (RNU6-2)، ميرنا-142-3p، ميرنا -21-5p، ميرنا-221-3p، ميرنا -223-3p، ميرنا -327، و ميرنا -34a-5P استخدمت.
- جمع العناصر التالية: 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج، 96-جيدا لوحة رد الفعل ل كرت-ير، فيلم لاصق لوحة 96-جيدا رد فعل، الاشعال ميرنا محددة، الأخضر ير يستند صبغ كيت (انظر الجدول المواد) 11 ، و في الوقت الحقيقي ير أداة.
- إعداد مزيج الرئيسي يحتوي على 12.5 ميكرولتر من 2X ير مزيج الرئيسي، 2.5 ميكرولتر من 5 ميكرومتر كل التمهيدي ميرنا الذائبة في المياه نوكليس خالية، و 1.25 ميكرولتر من التمهيدي العالمي 10X لكل بئر.
- الاستغناء 22.5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة 96 جيدا.
- إضافة 2.5 ميكرولتر من قالب [كدنا] لكل بئر.
- ختم لوحة مع فيلم لاصق لوحة 96-رد فعل جيدا. ثم، أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1000 x ج لمدة 30 ثانية.
- تشغيل برنامج الدراجات ير مع الوقت الحقيقي ير أداة والبرمجيات على النحو التالي.
- تعيين لوحة في الوقت الحقيقي ير أداة. في الوقت الحقيقي البرمجيات ير، وتحديد الخصائص التجريبية (المدخلات التجريبيةاختر "96- ويلز " للنوع التجريبي للأداة، واختر "2 - طريقة ΔΔCT " لطريقة الكميات، واختر "الكواشف الخضراء سيبر" للكاشف لاكتشاف التسلسل المستهدف، واختر "سرعة المنحدر القياسية" أداة المدى).
- ثم، تعيين أسماء للعينات وميرناس المستهدفة في كل بئر. يتم اختبار العينات دائما في نسخة مكررة أو ثلاثية للحصول على بيانات كافية للتحقق من صحة النتائج. حدد عينة مرجعية والسيطرة الذاتية. حدد "لا شيء" للصبغة لاستخدام كمرجع السلبي.
- إدخال حجم رد فعل من "20 ميكرولتر" وظروف الدراجات ير التالية في الوقت الحقيقي البرمجيات ير وفقا للتعليمات: بريانكوباشيون عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم 40 دورات من تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، الصلب في 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والإرشاد في 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
- تحليل بيانات كرت-ير شالغناء البرنامج من أداة ير في الوقت الحقيقي. تأكد من أن العتبة وخط الأساس التي يتم تحديدها تلقائيا بواسطة البرامج مناسبة في كل بئر.
- تحقق من دورة الحد من ميرناس الهدف في كل عينة. ودورة العتبة هي التقاطع بين منحنى التضخيم وخط العتبة. ثم، تطبيع مستوى التعبير من ميرناس الهدف ضد RNU6-2 باعتبارها السيطرة الذاتية، وحساب مستوى التعبير النسبي من ميرناس الهدف باستخدام طريقة 2 - ΔΔCT 13 .
ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أنه ينبغي التحقق من استقرار مستوى التعبير من ميرنا التحكم الذاتية. في هذه التجربة، تم تأكيد RNU6-2 على مستوى عال ومتغير نسبيا عبر كل مجموعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتستند النتائج المعروضة هنا على دراستنا ذكرت سابقا 8 . نحن التحقيق في الملف الشخصي التعبير ميرنا في التليف البريتوني. التليف البريتوني هو أحد المضاعفات الرئيسية في غسيل الكلى البريتوني. ويتميز فقدان الخلايا أحادية الطبقة الظهارية وتراكم الزائد من مكونات المصفوفة خارج الخلية، ويرتبط مع فشل الغشاء البريتوني 14 ، 15 . تم إنتاج نموذج الفئران التليف البريتوني عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 مل / كغ السائل غسيل الكلى البريتوني (2.5٪ الجلوكوز، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 35 ملي اكتات الصوديوم، 2 ملي كاكل 2 ، و 0.7 ملي مغكل 2 تحتوي على 20 ملي ميثيل غليوكسال) لمدة 5 أيام في الأسبوع لمدة 3 أسابيع للذكور الفئران، الذين تتراوح أعمارهم بين 12 أسبوعا ومع أوزان الجسم من 230-250 ز 16 . المجموعات التالية كانت بمثابة الضوابط: الفئران دون أي علاج (الفئران وهمية) والجرذان حقنمع سائل غسيل الكلى البريتوني دون ميثيل غليوكسال (السيطرة الفئران). على أساس ميرنا فحص ميكروأري، وجدنا أن مستويات ستة ميرناس (ميرنا -142-3p، ميرنا -21-5p، ميرنا-221-3p، ميرنا -223-3p، ميرنا -327، و ميرنا -34 أ -5 ب) زيادة كبيرة في الغشاء البريتوني من الفئران التليف البريتوني مقارنة مع تلك الموجودة في الفئران وهمية والجرذان السيطرة، وذلك باستخدام كرت-ير التالية بروتوكول المقدمة في هذه المخطوطة ( الشكل 1 ) 8 .
الشكل 1: أوبريغولاتد ميرناس في الغشاء البريتوني من الفئران التليف الفئران. كرت-ير تحديد التعبير عن ميرنا-142-3p، ميرنا-21-5p، ميرنا-221-3p، ميرنا -223-3p، ميرنا -327، و ميرنا -34a-5P في الفئران وهمية (ن = 6) ، والجرذان السيطرة (ن = 6)، والجرذان التليف البريتوني (ن = 6). القيم هي متوسط ± الخطأ القياسي (أشرطة الخطأ). تحليل التباين(أنوفا) للتحقيق في الاختلافات بين المجموعات. إذا تم الكشف عن دلالة إحصائية من قبل أنوفا، تم إجراء اختبار توكي على أنه تحليل ما بعد خاص لمقارنة وسائل مجموعتين مختلفتين. اعتبرت الاختلافات مع قيمة p <0.05 كبيرة. الاختصارات: كرت-ير، الكمي في الوقت الحقيقي عكس النسخ البلمرة سلسلة من ردود الفعل. ميرناس، ميكرورناس. نس، ليست كبيرة. *، p <0.05. وقد تم تعديل هذا الرقم من موريشيتا وآخرون. 8 (بإذن). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام بروتوكول المقدمة في هذه المخطوطة، ميرناس في الفئران الغشاء البريتوني تم تنقيته بنجاح وكشف باستخدام كرت-ير. موثوقية تحليل البيانات كرت-ير يعتمد على نوعية ميرناس المنقى. لذلك، قد يتم فحص نقاء ميرناس قبل كرت-ير بنسبة الامتصاصية في 260 نانومتر إلى أن في 280 نانومتر، والتي يمكن قياسها باستخدام الطيفي. عندما تضخيم كبير من ميرنا لا يمكن الحصول عليها باستخدام كرت-ير، يمكن زيادة تركيز قالب [كدنا]. ويمكن أيضا زيادة تركيز كل ميرنا التمهيدي محددة.
هناك العديد من الطرق البديلة لتحديد مستوى التعبير ميرنا، بما في ذلك ميكروأري، النشاف الشمالية، وفحص الحماية ريبونوكلياز. كرت-ير هو إجراء حساس، عالية الإنتاجية التي تتطلب قدرا ضئيلا من العينة بالمقارنة مع النشاف الشمالية أو ريبونوكلياز فحص الحماية. ميكروأرس تمكن التحقيق في إكسريسين العديد من ميرناس في وقت واحد، والبيانات تظهر عموما وجود علاقة قوية مع البيانات التي تم الحصول عليها من قبل كرت-ير 17 ؛ ومع ذلك، لم يتم التوصل إلى توافق في الآراء بشأن منهجية يمكن أن تؤكد صحة مقارنات البيانات ميكروأري بين المجموعات البحثية 18 .
هذا البروتوكول لديه القيود التالية. أولا، التحقق من صحة ميرنا الكشف عن طريق هذا البروتوكول لم يتم التحقق منها في أجهزة أخرى مثل الكبد والرئة والكلى. ثانيا، كما أنه لم يتم التحقق منها في الحيوانات التجريبية الأخرى، بما في ذلك الماوس، الهامستر، الكلب، والخنازير. وقد تم الإبلاغ عن منصة هذا البروتوكول لتنقية ميرناس باستخدام عمود تدور البوليمر الحيوي تمزيق العمودية تدور الغشاء السيليكا، والكشف عن ميرناس باستخدام كرت-ير لتكون قادرة على تنقية الحمض النووي الريبي ذات جودة عالية من الأنسجة و يظهر دقة عالية وحساسية للكشف عن ميرنا التعبير 10، 11 . وأظهرنا أيضا أن الكشف عن التعبير ميرنا في الغشاء البريتوني الفئران يمكن أن تجرى بنجاح باستخدام هذا البروتوكول. هذا البروتوكول يمكن استخدامها للدراسات التحقيق في الملف الشخصي للتعبير ميرنا في الغشاء البريتوني من الفئران في مجموعة واسعة من الحالات المرضية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن علاج العديد من العينات معا باستخدام هذا البروتوكول لأنه ينطوي على عملية بسيطة. لذلك، هذا البروتوكول هو مفيد للدراسات التي تتطلب تحليل ملف تعريف العديد من ميرناس في مختلف الظروف المرضية للغشاء البريتوني.
وينبغي أن نضع في الاعتبار عدة نقاط حاسمة عند اتباع هذا البروتوكول. أولا، يجب أن توضع العينات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المنقى على الجليد لتجنب تدهور. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تنفيذ خطوة التجانس على الجليد لحماية الحمض النووي الريبي من تدهور الحرارة. وعلاوة على ذلك، يجب أن تكون عينات الغشاء البريتوني متجانسة بشكل كاف حتى يكون لديهممبلتيلي يذوب في كاشف تحلل، ويوصى باستخدام تقطيع العمود لمزيد من التجانس لعينات الغشاء البريتوني تحتوي على النسيج الضام كبيرة التي هي مقاومة للذوبان عن طريق التجانس. ثانيا، يجب التحقق من استقرار مستوى التعبير عن ميرنا التحكم الذاتية عبر مجموعة التجريبية في كرت-ير. هذا ضروري لأن الظروف المرضية المختلفة التي يمكن استخدام هذا الإجراء يمكن أن تؤثر على مستويات التعبير من ميرناس السيطرة الذاتية، والتي يمكن أن تضر النتائج.
في الختام، لقد وصفنا بروتوكول لتنقية وكشف التعبير ميكرورنا في الفئران الغشاء البريتوني باستخدام كرت-ير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه لا يوجد لديهم أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر مياكو شيجيتا لدعمها الفني الممتاز. وقد حظي هذا العمل بدعم جزئي من جسبس كاكينهي (رقم المنحة 25461252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N.
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
