Summary
Nous présentons ici un protocole pour la détection de l'expression de microARN dans la membrane péritonéale de rat en utilisant une réaction quantitative en chaîne à la polymérase en transcription inverse quantitative en temps réel. Cette méthode est appropriée pour étudier le profil d'expression de microARN dans la membrane péritonéale de rat dans plusieurs états pathologiques.
Abstract
Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants qui régulent l'expression de l'ARN messager après la transcription. Le profil d'expression des miARN a été étudié dans divers organes et tissus chez le rat. Cependant, les méthodes standard pour la purification des miARN et la détection de leur expression dans la membrane péritonéale de rat n'ont pas été bien établies. Nous avons développé une méthode efficace et fiable pour purifier et quantifier les miARN en utilisant une réaction quantitative en chaîne à la polymérase de transcription inverse en temps réel (qRT-PCR) dans une membrane péritonéale de rat. Ce protocole comporte quatre étapes: 1) purification de l'échantillon de membrane péritonéale; 2) purification de l'ARN total, y compris le miARN provenant de l'échantillon de membrane péritonéale; 3) transcription inverse du miRNA pour produire de l'ADNc; Et 4) qRT-PCR pour détecter l'expression de l'ARNm. En utilisant ce protocole, nous avons déterminé avec succès que l'expression de six miARN (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 et miRNA-34a-5p) augmentaientDe manière significative dans la membrane péritonéale d'un modèle de fibrose péritonéale de rat par rapport à ceux des groupes témoins. Ce protocole peut être utilisé pour étudier le profil de l'expression de l'ARNm dans la membrane péritonéale des rats dans de nombreux états pathologiques.
Introduction
Les microARN (ARNm) sont des ARN courts et non codants qui post-transcriptionnellement régulent l'expression de l'ARN messager (ARNm) 1 . Les changements dans l'expression des miARN régulent l'expression de nombreux ARNm qui jouent des rôles essentiels dans diverses conditions pathologiques, y compris le cancer, l'inflammation, les troubles métaboliques et la fibrose 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Par conséquent, les miARN possèdent du potentiel comme nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Le profil d'expression des miARN a été déterminé en plusieurs ratsOrganes et tissus, y compris le foie, le cœur, les poumons et les reins 9 . Cependant, les méthodes standard pour la purification et la détection des miARN dans la membrane péritonéale de rat n'ont pas été bien établies.
L'objectif global de ce protocole est de purifier avec succès et de détecter les miARN dans la membrane péritonéale du rat. Tout d'abord, l'échantillon de membrane péritonéale a été homogénéisé à l'aide d'un homogénéisateur de verre, suivi d'une exposition à un système de déchiquetage de biopolymères dans une colonne de spin de microcentrifugeuse 10 . Ensuite, l'ARN total comprenant le miARN a été purifié à partir de l'échantillon de membrane péritonéale en utilisant une colonne de spin à base de silice 10 . Ensuite, l'ADNc a été synthétisé à partir de l'ARN total purifié en utilisant la transcriptase inverse, la poly (A) polymérase et l'amorce oligo-dT 11 . Enfin, l'expression de miRNA a été déterminée par qRT-PCR en utilisant un colorant intercalaire 11 . La logique de ce protocole est bSur les études antérieures qui ont montré une purification et une détection significatives du miARN dans les tissus par un procédé simple 8 , 10 , 11 . Il a été rapporté que l'utilisation d'un système de déchiquetage de biopolymères dans une colonne de spin de microcentrifugeuse et une colonne de spin à base de silice peut purifier l'ARN total de haute qualité des tissus 10 . Le procédé de synthèse d'ADNc à partir d'ARN total purifié utilisant la transcriptase inverse, la poly (A) polymérase et l'amorce oligo-dT, et la méthode de détection de l'expression de l'IRAR par qRT-PCR utilisant un colorant intercalaire dans ce protocole ont été signalés pour montrer une grande précision et Sensibilité 11 . De plus, il s'agit d'un processus simple qui permet d'économiser du temps et empêche toute erreur technique. Par conséquent, ce protocole est utile dans les études nécessitant une détection très précise et sensible du miARN dans la membrane péritonéale des rats dans un large éventail de pathologies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tous les protocoles expérimentaux d'animaux ont été approuvés par le comité d'éthique animale de l'Université médicale de Jichi et ont été effectués conformément aux directives sur l'utilisation et l'entretien des animaux expérimentaux du Guide de l'Université médicale de Jichi pour les animaux de laboratoire.
1. Collection d'échantillons de péritoine
- Recueillir les éléments suivants: tube de centrifugation de 50 ml avec du coton trempé dans de l'isoflurane, de la feuille de liège, de la boîte de Petri avec une solution salée tamponnée au phosphate (PBS), des ciseaux chirurgicaux et des pinces.
- Éuthaniser un rat avec un surdosage d'isofluorane, puis pulvériser la peau abdominale du rat avec 70% d'éthanol, et monter le rat sur la feuille de liège sur le dos.
- Faire une incision longitudinale dans la peau, les muscles et la membrane péritonéale à l'aide des ciseaux et des pinces.
- Prenez la membrane péritonéale à l'aide de la pince et faites des incisions horizontales sur sa partie supérieure le long de l'os de côtes le plus bas sous le diaphragme et sur son lDe l'autre côté de la région latérale à l'aide des ciseaux chirurgicaux. Ensuite, faites des incisions longitudinales latérales pour enlever la membrane péritonéale du corps à l'aide des ciseaux chirurgicaux. Puis, laver avec du PBS dans une boîte de Petri.
- Découpez et coupez 20 mg (3-5 mm 2 ) d'échantillons de membrane péritonéale, qui est une taille appropriée pour les étapes suivantes, en utilisant les ciseaux chirurgicaux et la pince.
2. ARN total purifiant des échantillons de membrane péritonéale
REMARQUE: Ici, des échantillons de membrane péritonéale pesant 20 mg sont homogénéisés à l'aide d'un homogénéisateur de verre et d'un système de déchiquetage de biopolymères dans une colonne de centrifugation à microcentrifugation. Ensuite, l'ARN total provenant de l'échantillon de membrane péritonéale est isolé à l'aide d'une colonne de spin à base de silice.
- Recueillir les éléments suivants: tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ou 2,0 ml, éthanol à 100%, chloroforme, homogénéisateur de verre, glace, système de déchiquetage de biopolymères dans une colonne de centrifugation à microcentrifugeuse 10 10 , réactif de lyse à base de phénol / guanidine, tampon de lavage comprenant de la guanidine et de l'éthanol (tampon de lavage 1) et un tampon de lavage comprenant l'éthanol (tampon de lavage 2).
- Mettez un échantillon de 20 mg de membrane péritonéale dans un homogénéisateur de verre et ajoutez 700 μL du réactif de lyse à base de phénol / guanidine.
- Homogénéiser l'échantillon de membrane péritonéale en appuyant lentement sur le pilon sur l'échantillon avec une torsion. Répétez ce processus plusieurs dizaines de fois sur de la glace jusqu'à ce que l'échantillon de membrane péritonéale soit complètement dissous dans le réactif de lyse à base de phénol / guanidine.
- Pour une autre homogénéisation, transférer le lysat homogénéisé dans le système de déchiquetage des biopolymères dans une colonne de centrifugation à microcentrifugeuse dans un tube de collecte de 2,0 mL. Ensuite, centrifuger à 14 000 xg pendant 3 min à 4 ° C.
- Transférer le lysat homogénéisé dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
- Ajouter 140 μL de chloroforme au lysat homogénéisé et capter le bainE en toute sécurité. Ensuite, mélanger le tube par inversion pendant 15 s.
- Incuber les échantillons pendant 2 à 3 minutes à température ambiante. Ensuite, centrifuger à 12 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
- Transférer le surnageant (généralement 300 μL) à un nouveau tube de microcentrifugeuse sans perturber le précipité et ajouter 1,5x son volume (habituellement 450 μl) d'éthanol à 100%. Ensuite, mélanger l'échantillon par vortexage pendant 5 s.
- Pipeter jusqu'à 700 μl de l'échantillon dans une colonne de spin à base de silice placée dans un tube de collecte de 2,0 ml. Fermez le cap de la colonne. Ensuite, centrifuger à 15 000 xg pendant 15 s. Après centrifugation, jeter l'écoulement dans le tube de collecte.
- Ajouter 700 μL de tampon de lavage 1 à la colonne de spin à base de silice pour laver soigneusement l'échantillon. Fermez le cap de la colonne. Ensuite, centrifuger à 15 000 xg pendant 15 s. Après centrifugation, jeter l'écoulement dans le tube de collecte.
- Ajouter 500 μL de tampon de lavage 2 à la silice-membColonne de spin basée sur le rane pour éliminer toute trace de sel. Fermez le cap de la colonne. Ensuite, centrifuger à 15 000 xg pendant 15 s. Après centrifugation, jeter l'écoulement dans le tube de collecte.
- Répétez 2.11.
- Centrifuger à nouveau la colonne de spin à base de silice à 15 000 xg pendant 1 min. Après centrifugation, jeter l'écoulement dans le tube de collecte.
- Placez la colonne de spin à base de silice dans un nouveau tube de collecte de 1,5 ml. Ensuite, transférer 25 μL d'eau sans RNase dans la colonne. Fermez le cap de la colonne. Laisser l'échantillon à température ambiante pendant 5 min. Ensuite, centrifuger à 15 000 xg pendant 1 min.
- Transférer l'éluat de 25 μL contenant l'ARN total à un nouveau tube de microcentrifugeuse. Ensuite, rangez-le à -80 ° C avant utilisation.
3. Transcription inverse de l'ARN total
REMARQUE: Référence et respect de l'information minimale pour la publication de l'expérience quantitative PCR en temps réel(MIQE) encouragent une meilleure pratique et contribuent à obtenir des résultats fiables et sans équivoque 12 .
NOTE: Ici, un total de 1,0 pg d'ARN isolé est transcrit en inverse en utilisant la transcriptase inverse, la poly (A) polymérase et l'amorce oligo-dT.
- Recueillir les éléments suivants: tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL; Tubes à bande à huit puits; Eau exempte de RNase; la glace; Kit de transcriptase inverse (voir tableaux de matériaux) 11 .
- Préparez une solution de mélange maître qui contient 2,0 μL de mélange d'acide nucléique 10x, 2,0 μL de mélange de transcriptase inverse (à partir du kit) et 4,0 μL de 5x tampon hi-spec pour un total de 8,0 μL par tube.
- Distribuer 8,0 μL de solution de mélange maître (du kit) dans chaque tube.
- Mesurer la quantité d'ARN total en utilisant un spectrophotomètre. Ajouter 1,0 μg d'ARN totals isolés purifiés à partir de l'échantillon de membrane péritonéale à chaque tube.
REMARQUE: qRT-PCR peut être effectué usiNg ARN total en tant que modèle sans transcription inverse pour le contrôle de la qualité des ARN totalisés purifiés. Si un ADN est contaminé, des produits d'amplification inattendus sont observés par qRT-PCR. - Ajouter de l'eau exempte de RNase à chaque tube pour un total de 20 μL. Ensuite, mélanger soigneusement en pipetant et centrifuger pendant 15 s.
- Incuber les échantillons pendant 60 min à 37 ° C. Incuber immédiatement pendant 5 min à 95 ° C.
REMARQUE: Cette étape peut être effectuée dans un thermocoupleur. - Transférer l'ADNc sur un nouveau tube de microcentrifugeuse et diluer dix fois (1:10) avec de l'eau exempte de RNase.
- Rangez l'ADNc dilué sur glace temporairement et à -80 ° C pour un long terme avant utilisation.
4. qRT-PCR de miARN
NOTE: qRT-PCR de miARN est effectué en utilisant un colorant intercalaire. Ici, amorces pour l'ARN, U6 petit nucléaire 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 et miRNA-34a-5p ont été utilisées.
- Recueillir les éléments suivants: tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL, plaque de réaction de 96 puits pour qRT-PCR, film adhésif pour la plaque de réaction à 96 puits, amorces spécifiques à l'ARNm, kit de PCR à base de colorant vert (voir tableau de matériaux) 11 et un Instrument de PCR en temps réel.
- Préparez un mélange maître contenant 12,5 μL de mélange principal de PCR 2x, 2,5 μL de 5 μM chaque amorce miARN dissous dans de l'eau exempte de nuclease et 1,25 μl d'amorce universelle 10x pour chaque puits.
- Dispenser 22,5 μL de mélange maître dans chaque puits de la plaque à 96 puits.
- Ajouter 2,5 μl d'ADNc modèle à chaque puits.
- Sceller la plaque avec un film adhésif pour la plaque de réaction à 96 puits. Ensuite, centrifuger la plaque à 1000 xg pendant 30 s.
- Exécutez le programme de cyclage PCR avec l'instrument et le logiciel de PCR en temps réel comme suit.
- Réglez la plaque dans l'instrument de PCR en temps réel. Dans le logiciel de PCR en temps réel, définissez les propriétés expérimentales (entrée expérimentaleNom, choisissez "96 puits" pour le type d'instrument expérimental, choisissez "méthode 2 - ΔΔCT " pour la méthode de quantification, choisissez "réactifs verts SYBR" pour que le réactif détecte la séquence cible, choisissez "vitesse de rampe standard" pour Instrument exécuté).
- Ensuite, attribuez les noms aux échantillons et ciblez les ARNm dans chaque puits. Les échantillons sont toujours testés en double ou en triple pour obtenir suffisamment de données pour la validation des résultats. Sélectionnez l'échantillon de référence et le contrôle endogène. Sélectionnez "none" pour que le colorant soit utilisé comme référence passive.
- Entrer un volume de réaction de "20 μL" et les conditions de cyclage de PCR suivantes dans le logiciel de PCR en temps réel conformément aux instructions: préincubation à 95 ° C pendant 15 min, puis 40 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 15 s , Recuit à 55 ° C pendant 30 s, et extension à 70 ° C pendant 30 s.
- Analyser les données qRT-PCRChante le logiciel de l'instrument de PCR en temps réel. Confirmez que le seuil et la ligne de base qui sont automatiquement déterminés par le logiciel sont appropriés dans chaque puits.
- Vérifiez le cycle de seuil des miARN cible dans chaque échantillon. Le cycle de seuil est l'intersection entre une courbe d'amplification et une ligne de seuil. Ensuite, normalisez le niveau d'expression des miARN cible contre RNU6-2 en tant que contrôle endogène et calculez le niveau d'expression relatif des miARN cible en utilisant la méthode 2 - ΔΔCT 13 .
NOTE: Il convient de noter que la stabilité du niveau d'expression du miNrr de contrôle endogène doit être vérifiée. Dans cette expérience, RNU6-2 a été confirmé pour être exprimé à un niveau élevé et relativement invariant dans chaque groupe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les résultats présentés ici sont basés sur notre étude précédemment rapportée 8 . Nous avons étudié le profil d'expression du miARN dans la fibrose péritonéale. La fibrose péritonéale est une complication majeure de la dialyse péritonéale. Il se caractérise par la perte de la monocouche cellulaire mésothéliale et l'accumulation excessive de composants de la matrice extracellulaire, et est associé à une rupture de la membrane péritonéale 14 , 15 . Un modèle de rat de fibrose péritonéale a été produit par injection intrapéritonéale de 100 mL / kg de fluide de dialyse péritonéale (2,5% de glucose, 100 mM de NaCl, 35 mM de lactate de sodium, 2 mM de CaCl2 et 0,7 mM de MgCl2 contenant 20 mM de méthylgllyoxal) pendant 5 Jours par semaine pendant 3 semaines chez les rats mâles, âgés de 12 semaines et avec des poids corporels de 230-250 g 16 . Les groupes suivants ont servi de témoins: des rats sans traitement (rats simulés) et des rats injectésAvec un fluide de dialyse peritoneal sans méthylgllyoxal (rat témoin). En se basant sur le dépistage des microarray de miARN, nous avons constaté que les niveaux de six miARN (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 et miRNA-34a-5p) A augmenté significativement dans la membrane péritonéale des rats de fibrose péritonéale par rapport à ceux chez les rats simulés et les rats témoins, en utilisant qRT-PCR suite au protocole présenté dans ce manuscrit ( figure 1 ) 8 .
Figure 1: MiRNAs à régulation positive dans la membrane péritonéale des rats de fibrose péritonéale. QRT-PCR détermination de l'expression de miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 et miARN-34a-5p chez des rats simulés (n = 6) , Des rats témoins (n = 6) et des rats de fibrose péritonéale (n = 6). Les valeurs sont la moyenne ± erreur standard (barres d'erreur). Analyse de variance(ANOVA) a été utilisé pour étudier les différences entre les groupes. Si la signification statistique a été détectée par ANOVA, le test de Tukey a été effectué comme une analyse post hoc pour comparer les moyens de deux groupes différents. Les différences avec une valeur p <0,05 ont été considérées comme significatives. Abréviations: qRT-PCR, réaction quantitative en chaîne en polymérase à transcription inverse quantitative en temps réel; MiARN, microARN; NS, pas significatif; *, P <0,05. Ce chiffre a été modifié de Morishita et al. 8 (avec permission). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En utilisant le protocole présenté dans ce manuscrit, les miARN dans la membrane péritonéale de rat ont été purifiés avec succès et ont été détectés à l'aide de la PCR qRT. La fiabilité de l'analyse des données qRT-PCR dépend de la qualité des miARN purifiés. Par conséquent, la pureté des miRNAs peut être vérifiée avant qRT-PCR par le rapport absorbance à 260 nm à celui à 280 nm, qui peut être mesuré à l'aide d'un spectrophotomètre. Lorsque l'amplification significative du miRNA ne peut pas être obtenue en utilisant qRT-PCR, la concentration de l'ADNc modèle peut être augmentée. La concentration de chaque amorce spécifique à l'ARNm peut également être augmentée.
Il existe plusieurs méthodes alternatives pour déterminer le niveau de l'expression de l'ARNm, y compris le microarray, le Northern Blot et le test de protection des ribonucléases. QRT-PCR est une procédure sensible et à haut débit qui requiert une quantité minimale d'échantillon par rapport à l'essai de protection par Northern blot ou ribonucléase. Les microarrays permettent d'enquêter sur l'expRessource de nombreux miARN simultanément, et les données montrent généralement une forte corrélation avec les données obtenues par qRT-PCR 17 ; Cependant, aucun consensus n'a été atteint concernant une méthodologie qui peut confirmer la validité des comparaisons de données de microarrays entre les groupes de recherche 18 .
Ce protocole comporte les limitations suivantes. Tout d'abord, la validation de la détection de l'ARNm par ce protocole n'a pas été vérifiée dans d'autres organes tels que le foie, les poumons et les reins. Deuxièmement, il n'a pas encore été vérifié dans d'autres animaux expérimentaux, y compris la souris, le hamster, le chien et le porc. La plate-forme de ce protocole pour la purification des miARN utilisant une colonne de spin de déchiquetage de biopolymères et une colonne de spin à base de silice et la détection de miARN utilisant qRT-PCR a été signalé pour pouvoir purifier l'ARN de haute qualité des tissus et Montre une grande précision et une sensibilité pour la détection de l'expression de l'ARNm 10, 11 . Nous avons également montré que la détection de l'expression de l'ARNm dans la membrane péritonéale des rats peut être menée avec succès à l'aide de ce protocole. Ce protocole peut être utilisé pour des études sur le profil de l'expression de l'ARNm dans la membrane péritonéale des rats dans un large éventail de pathologies. En outre, de nombreux échantillons peuvent être traités ensemble en utilisant ce protocole car cela implique un processus simple. Par conséquent, ce protocole est utile pour les études nécessitant une analyse du profil d'expression de nombreux ARNm dans diverses conditions pathologiques de la membrane péritonéale.
Plusieurs points critiques doivent être pris en compte lors de la suite de ce protocole. Tout d'abord, les échantillons contenant des ARN purifiés doivent être placés sur de la glace pour éviter la dégradation. De plus, l'étape d'homogénéisation doit être effectuée sur de la glace pour protéger les ARN de la dégradation de la chaleur. En outre, les échantillons de membrane péritonéale devraient être homogénéisés de manière adéquate jusqu'à ce qu'ilsComplètement dissous dans le réactif de lyse, et l'utilisation d'un déchiqueteur de colonne pour une homogénéisation supplémentaire est recommandée car les échantillons de membrane péritonéale contiennent un tissu conjonctif important résistant à la dissolution par homogénéisation. Deuxièmement, la stabilité du niveau d'expression du miNrr de contrôle endogène devrait être vérifiée dans l'ensemble expérimental dans qRT-PCR. Ceci est nécessaire parce que diverses conditions pathologiques dans lesquelles cette procédure peut être utilisée peuvent affecter les niveaux d'expression des miRNAs de contrôle endogène, ce qui peut compromettre les résultats.
En conclusion, nous avons décrit un protocole pour la purification et la détection de l'expression de microARN dans la membrane péritonéale de rat en utilisant qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêt.
Acknowledgments
Nous souhaitons remercier Miyako Shigeta pour son excellent soutien technique. Ce travail a été partiellement soutenu par JSPS KAKENHI (numéro de subvention 25461252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N.
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
