Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי ביטוי microRNA ב קרום עכברוש עכברוש באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז. שיטה זו מתאימה ללימוד פרופיל הביטוי microRNA בקרום עכברוש עכברוש במספר תנאים פתולוגיים.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs noncoding קטנים המווסת את הביטוי RNA שליח הודעה שלאחר transcriptionally. פרופיל הביטוי miRNA נחקרה באיברים ורקמות שונים בעכברוש. עם זאת, שיטות סטנדרטיות לטיהור miRNAs וזיהוי הביטוי שלהם בממברנה פריטוניאלית עכברוש לא היו מבוססים היטב. פיתחנו שיטה יעילה ואמינה לטהר לכמת miRNAs באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז (qRT-PCR) בממברנה פריטוניאלית עכברוש. פרוטוקול זה מורכב של ארבעה שלבים: 1) טיהור מדגם קרום פריטוניאלי; 2) טיהור של RNA הכולל כולל מירנה מדגם הממברנה פריטוניאלית; 3) שעתוק לאחור של מירנה לייצר cDNA; ו 4) qRT-PCR כדי לגלות ביטוי מירנה. באמצעות פרוטוקול זה, קבענו בהצלחה כי הביטוי של miRNAs שישה (מירנה -142-3p, מירנה 21-5p, מירנה-221-3p, מירנה-223-3p, מירנה -327, ו- miRNA-34a-5p) גדלבאופן מובהק בממברנה הצפקית של מודל חולשת הצפק של העכברוש בהשוואה לאלו בקבוצת הביקורת. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי ללמוד את הפרופיל של ביטוי מירנה בקרום הצפק של חולדות בתנאים פתולוגיים רבים.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) הם קצרים, RNAs לא קידוד כי שלאחר transcriptionally לווסת את השליח RNA (mRNA) ביטוי 1 . שינויים בביטוי של miRNAs להסדיר את הביטוי של mRNAs רבים אשר ממלאים תפקידים מרכזיים במצבים פתולוגיים שונים, כולל סרטן, דלקות, הפרעות מטבוליות, ו פיברוזיס 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . לכן, miRNAs יש פוטנציאל כמו ביומרקרים חדשים ומטרות טיפוליות 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . פרופיל הביטוי miRNA נקבע בעכברוש שוניםאיברים ורקמות, כולל כבד, לב, ריאה וכליות. עם זאת, שיטות סטנדרטיות לטיהור וזיהוי של miRNAs בממברנה פריטוניאלית עכברוש לא היו מבוססים היטב.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא בהצלחה לטהר ולזהות miRNAs בממברנה פריטוניאלית עכברוש. ראשית, מדגם הממברנה הצפק היה homogenized באמצעות homogenizer זכוכית, ואחריו חשיפה למערכת biopolymer רטוש בעמודה microcentrifuge ספין 10 . לאחר מכן, סך כולל RNA כולל miRNA היה מטוהרים מדגם הממברנה פריטוניאלית באמצעות עמודה סיליקה מבוסס קרום סיליקה 10 . לאחר מכן, cDNA היה מסונתז מן RNA סך מטוהרים באמצעות transcriptase הפוך, פולימראז פולי (A), ו אוליגו dT תחל 11 . לבסוף, הביטוי של מירנה נקבע על ידי qRT-PCR באמצעות צבע intercalating 11 . הרציונל של פרוטוקול זה הוא בכמו על מחקרים קודמים שהראו טיהור משמעותי וזיהוי של מירנה ברקמות על ידי תהליך פשוט 8 , 10 , 11 . זה כבר דיווח כי השימוש במערכת biopolymer-רטוש בעמודה microcentrifuge ספין סיליקה קרום מבוסס ספין טור יכול לטהר באיכות גבוהה RNA סך מ רקמות 10 . השיטה של סינתזה cDNA מ RNA סך מטוהרים באמצעות transcriptase הפוך, פולימראז פולי (א), ו אוליגו dT תחל, ואת השיטה של גילוי ביטוי מירנה על ידי qRT-PCR באמצעות צבע intercalating בפרוטוקול זה דווחו כדי להראות דיוק גבוהה רגישות 11 . בנוסף, זהו תהליך פשוט, אשר חוסך זמן ומונע שגיאות טכניות. לכן, פרוטוקול זה שימושי במחקרים הדורשים זיהוי מדויק ורגיש מאוד של מירנה בממברנה פריטוניאלית עכברוש במגוון רחב של תנאים פתולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת Jichi רפואי ונערכו בהתאם לשימוש וטיפול של הנחיות לבעלי חיים ניסיוניים מן Jichi Medical University Guide עבור חיות מעבדה.
1. פריטוניום אוסף דוגמאות
- לאסוף את הפריטים הבאים: 50 צנטריפוגות צינור מ"ל עם כותנה ספוג ב isoflurane, גיליון הפקק, צלחת פטרי עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), מספריים כירורגי, מלקחיים.
- להרדים חולדה עם מנת יתר של isofluorane, ולאחר מכן לרסס את העור הבטן של החולדה עם אתנול 70%, ואת הרם חולדה על גיליון השעם על גבו.
- בצע חתך אורכי של העור הבטן, שריר, הממברנה פריטוניאלית באמצעות מספריים ו מלקחיים.
- להרים את הממברנה פריטוניאלית באמצעות מלקחיים, ולעשות חתכים אופקיים על החלק העליון שלה לאורך עצם הצלע הנמוך ביותר מתחת לסרעפת ועל l שלהצד ower על האזור לרוחב באמצעות מספריים כירורגית. לאחר מכן, לבצע חתכים אורך לרוחב כדי להסיר את הממברנה פריטוניאלית מהגוף באמצעות מספריים כירורגיים. לאחר מכן, לשטוף אותו עם PBS בצלחת פטרי.
- לחתוך ולקצץ 20 מ"ג (3-5 מ"מ 2 ) של דגימות קרום פריטוניאלי, אשר מתאים בגודל הצעדים הבאים, באמצעות מספריים כירורגי ומלקחיים.
2. מטהר RNAs סך דגימות ממברנה פריטוניאלית
הערה: הנה, דגימות הממברנה פריטוניאלית במשקל 20 מ"ג הם homogenized באמצעות homogenizer זכוכית מערכת biopolymer רטוש בעמודה ספין microcentrifuge. לאחר מכן, RNA הכולל מדגם הממברנה הצפק מבודד באמצעות טור ספין סיליקה מבוססי קרום.
- אסוף את הפריטים הבאים: 1.5 או 2.0 מ"ל צינורות microcentrifuge, אתנול 100%, כלורופורם, homogenizer זכוכית, קרח, biopolymer-רטוש מערכת בעמודה ספין microcentrifuge 10 10 , פנול / guanidine מבוסס מגיב תמוגה, לשטוף חיץ כולל guanidine ואתנול (לשטוף חיץ 1), וכן לשטוף חיץ כולל אתנול (לשטוף חיץ 2).
- שים 20 מ"ג מדגם קרום פריטוניאלית לתוך homogenizer זכוכית ולהוסיף 700 μL של מגיב תמוגה פנול / guanidine.
- Homogenize דגימת הממברנה הצפק על ידי לחיצה איטית על העלי על המדגם עם פיתול. חזור על תהליך זה כמה עשרות פעמים על הקרח עד דגימת הממברנה פריטוניאלית יש מומס לחלוטין לתוך מגיב תמוגה פנול / guanidine.
- לקבלת homogenization נוספת, העברת lysate homogenized כדי biopolymer-רטוש המערכת בעמודה ספין microcentrifuge ב 2.0 צינור מ"ל. ואז, צנטריפוגה אותו ב XG 14,000 במשך 3 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את lysate הומוגני לצינור microcentrifuge חדש.
- הוסף 140 μL של כלורופורם כדי lysate הומוגני ואת מכסה את האמבט. לאחר מכן, לערבב את הצינור על ידי היפוך במשך 15 s.
- דגירה הדגימות במשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. ואז, צנטריפוגה אותם XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את supernatant (בדרך כלל 300 μL) לצינור microcentrifuge חדש מבלי להפריע את המשקע, ולהוסיף 1.5x נפח שלה (בדרך כלל 450 μL) של אתנול 100%. לאחר מכן, לערבב את המדגם על ידי vortexing עבור 5 s.
- פיפטה עד 700 μL של המדגם לתוך עמודה ספין מבוסס סיליקה סיליקה ממוקם צינור 2.0 מ"ל אוסף. סגור את מכסה העמודה. ואז, צנטריפוגה זה ב XG 15,000 במשך 15 s. לאחר צנטריפוגה, להשליך את הזרימה דרך בצינור אוסף.
- הוסף 700 μL של חיץ לשטוף 1 לעמוד סיליקה מבוססי קרום סיליקה לשטוף בחום את המדגם. סגור את מכסה העמודה. ואז, צנטריפוגה זה ב XG 15,000 במשך 15 s. לאחר צנטריפוגה, להשליך את הזרימה דרך בצינור אוסף.
- הוסף 500 μL של חיץ לשטוף 2 סיליקה- membRane מבוסס ספין טור להסיר כל זכר של מלח. סגור את מכסה העמודה. ואז, צנטריפוגה זה ב XG 15,000 במשך 15 s. לאחר צנטריפוגה, להשליך את הזרימה דרך בצינור אוסף.
- חזור על 2.11.
- צנטריפוגה סיליקה קרום מבוסס ספין טור שוב ב XG 15,000 במשך 1 דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך את הזרימה דרך בצינור אוסף.
- מניחים את סיליקה קרום מבוסס ספין טור ב צינור 1.5 מ"ל חדש אוסף. לאחר מכן, העברת 25 μL של מים חינם RNase לתוך העמודה. סגור את מכסה העמודה. השאירו את המדגם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. ואז, צנטריפוגה אותו ב XG 15,000 במשך 1 דקות.
- מעבירים את eluate 25 μL המכיל RNA הכולל לצינור microcentrifuge חדש. לאחר מכן, לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
3. הפוך שעתוק של RNA סך
הערה: הפניה ודבקות המידע המינימלי לפרסום כמותי בזמן אמת PCR מומחה(IMQ) הנחיות מעודדות תרגול טוב יותר ועזרה בהשגת תוצאות אמינות וחד משמעיות 12 .
הערה: כאן, סך של 1.0 מיקרוגרם של רנ"א מבודד הוא transcript לאחור באמצעות transcriptase לאחור, פולימראז פולי (A), ו אוליגו dT תחל.
- אסוף את הפריטים הבאים: 1.5 מ"ל microcentrifuge צינורות; שמונה צינורות שפופרת היטב; מים נטולי RNase; קֶרַח; ערכת transcriptase לאחור (ראה טבלת חומרים) 11 .
- הכן פתרון לערבב מאסטר המכיל 2.0 μL של תערובת חומצה גרעין 10x, 2.0 μL של תמהיל transcriptase הפוך (מתוך הערכה), ו 4.0 μL של חיץ 5x Hi-spec עבור סכום כולל של 8.0 μL לכל צינור.
- לוותר 8.0 μL של פתרון לערבב הורים (מן הערכה) לתוך כל צינור.
- למדוד את כמות RNAs הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר. הוסף 1.0 מיקרוגרם של RNAs סך מבודדים מטוהרים מדגם הממברנה פריטוניאלית לכל צינור.
הערה: qRT-PCR עשוי להתבצע usiNg סך RNAs כתבנית ללא שעתוק לאחור עבור בקרת איכות של RNAs סך מטוהרים. אם כל DNA הוא מזוהם, מוצרים הגברה בלתי צפויות נצפים על ידי qRT-PCR. - הוסף מים RNase חינם לכל צינור כדי סך של 20 μL. לאחר מכן, לערבב היטב על ידי pipetting ו צנטריפוגה זה 15 s.
- דגירה הדגימות למשך 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס. מיד דגירה 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.
הערה: שלב זה יכול להתבצע ב cycler תרמי. - העברת cDNA לצינור microcentrifuge חדש לדלל עשר פעמים (1:10) עם מים ללא RNase.
- חנות cDNA מדולל על קרח באופן זמני, ב -80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך לפני השימוש.
4. qRT-PCR של מירנה
הערה: qRT-PCR של מירנה מבוצעת באמצעות צבע intercalating. הנה, primers עבור רנ"א, U6 קטן גרעיני 2 (RNU6-2), מירנה -142-3p, מירנה 21-5p, מירנה-221-3p, מירנה-223-3p, מירנה -327, ו מירנה -34a-5p שומשו.
- לאסוף את הפריטים הבאים: 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge, 96-גם צלחת תגובה עבור qRT-PCR, סרט דבק עבור 96-גם תגובה צלחת, מירנה ספציפיים primers, צבע ירוק מבוסס PCR Kit (ראה טבלה חומרים) 11 , בזמן אמת PCR כלי.
- הכן תערובת אב המכיל μL 12.5 של תערובת 2x PCR מאסטר, 2.5 μL של 5 מיקרומטר כל פריימר מירנה מומס במים nuclease חינם, ו 1.25 μL של תחל אוניברסלי 10x עבור כל טוב.
- לוותר על 22.5 μL של תערובת אב לתוך היטב כל צלחת 96-היטב.
- הוסף 2.5 μL של cDNA תבנית היטב כל אחד.
- חותם את הצלחת עם סרט דבק עבור 96-גם צלחת התגובה. ואז, צנטריפוגה צלחת ב 1000 xg במשך 30 s.
- הפעל את תוכנית רכיבה על אופניים PCR בזמן אמת PCR כלי ותוכנה כדלקמן.
- הגדר את הצלחת בזמן אמת מכשיר ה- PCR. בזמן אמת תוכנה PCR, להגדיר מאפיינים ניסיוניים (קלט ניסיונישם, לבחור "96 בארות" עבור סוג הניסוי של המכשיר, לבחור "2 - שיטת ΔΔCT " עבור שיטת quantitation, בחר "SYBR ריאגנטים ירוקים" עבור מגיב כדי לזהות את רצף היעד, לבחור "מהירות כבש רגילה" עבור הפעלת מכשיר).
- לאחר מכן, להקצות שמות לדגימות miRNAs היעד בכל טוב. דוגמאות נבדקות תמיד כפולים או בשלושה עותקים כדי לקבל מספיק נתונים לאימות התוצאות. בחר מדגם התייחסות ובקרה אנדוגנית. בחר "ללא" עבור צבע להשתמש כהפניה פסיבית.
- קלט נפח התגובה של "20 μL" ואת התנאים הבאים רכיבה על אופניים PCR בזמן אמת התוכנה PCR בהתאם להוראות: פרינקובציה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של denaturation ב 94 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות , חישול על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, וכן הרחבה ב 70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
- ניתוח נתונים qRT-PCR uלשיר את התוכנה של מכשיר ה- PCR בזמן אמת. ודא כי סף הבסיס אשר נקבעים באופן אוטומטי על ידי התוכנה מתאימים כל טוב.
- בדוק את מחזור הסף של miRNAs היעד בכל מדגם. מחזור הסף הוא הצומת בין עקומת הגברה לקו סף. ואז, לנרמל את רמת הביטוי של miRNAs היעד נגד RNU6-2 כבקרה אנדוגני, ולחשב את רמת הביטוי היחסי של miRNAs היעד באמצעות שיטה 2 - ΔΔCT 13 .
הערה: יצוין כי היציבות של רמת הביטוי של מירנה בקרה אנדוגני צריך להיות מאומת. בניסוי זה, RNU6-2 אושר להתבטא ברמה גבוהה יחסית קבוע לאורך כל קבוצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות המוצגות כאן מבוססות על המחקר הקודם שלנו 8 . חקרנו את פרופיל הביטוי מירנה ב fibrois פריטוניאלי. סיבוך פריטוניאלי הוא סיבוך גדול בדיאליזה פריטונאלית. זה מאופיין על ידי אובדן monolayer התא mesothelial ואת הצטברות עודף של מרכיבי מטריקס תאיים, והוא מזוהה עם קרום הממברנה הצפק 14 , 15 . מודל עכברוש סיבי פריטוניאלי נוצר על ידי הזרקה intraperitoneal של 100 מ"ל / ק"ג דיאליזה נוזל דיאליזה (2.5% גלוקוז, 100 מ"מ NaCl, 35 מ"ל נתרן לקטט, 2 mM CaCl 2 , ו 0.7 mM MgCl 2 המכיל 20 מ"מ methylglyoxal) עבור 5 ימים בשבוע במשך 3 שבועות על חולדות זכר, בגיל 12 שבועות עם משקולות הגוף של 230-250 גרם 16 . הקבוצות הבאות שימשו כבקרות: חולדות ללא כל טיפול (חולדות מדומה) וחולדות שהוזרקועם נוזל דיאליזה פריטוניאלית ללא methylglyoxal (חולדות שליטה). בהתבסס על הקרנה microarray מירנה, מצאנו כי רמות של miRNAs שישה (miRNA-142-3p, מירנה 21-5p, מירנה-221-3p, מירנה-223-3p, מירנה -327, ו מירנה -34a -5p) גדל באופן משמעותי בממברנה הצפקית של חולדות פיברוזיס צפק לעומת אלה חולדות מדומה חולדות שליטה, באמצעות qRT-PCR בעקבות פרוטוקול שהוצג בכתב היד הזה ( איור 1 ) 8 .
איור 1: miRNAs upregulated בקרום פריטוניאלי של חולדות פיברוזיס פריטוניאלית. QRT-PCR קביעת הביטוי של מירנה-142-3p, מירנה-21-5p, מירנה-221-3p, מירנה-223-3p, מירנה -327, ו- miRNA-34a-5p בחולדות מדומה (n = 6) , חולדות שליטה (n = 6), חולדות פיברוזיס fibroisal (n = 6). הערכים הם ממוצע ± שגיאה סטנדרטית (בארים שגיאה). ניתוח שונות(ANOVA) הועסק כדי לחקור הבדלים בין קבוצות. אם הבדיקה הסטטיסטית זוהתה על ידי ANOVA, הבדיקה של טוקי בוצעה כניתוח פוסט-הוק כדי להשוות את האמצעים של שתי קבוצות שונות. ההבדלים עם ערך p <0.05 נחשבו משמעותיים. קיצורים: qRT-PCR, כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז; MiRNAs, microRNAs; NS, לא משמעותי; *, P <0.05. נתון זה השתנה מ Morishita et al. 8 (באישור). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות פרוטוקול המוצג בכתב היד הזה, miRNAs בקרום עכברוש עכברוש טוהרו בהצלחה זוהה באמצעות qRT-PCR. האמינות של ניתוח נתונים qRT-PCR תלוי באיכות של miRNAs מטוהרים. לכן, טוהר miRNAs ניתן לבדוק לפני qRT-PCR על ידי היחס של ספיגת ב 260 ננומטר לזה ב 280 ננומטר, אשר ניתן למדוד באמצעות ספקטרופוטומטר. כאשר הגברה משמעותית של מירנה לא ניתן להשיג באמצעות qRT-PCR, הריכוז של cDNA תבנית עשוי להיות מוגברת. ריכוז של כל מירנה ספציפי תחל יכול גם להיות מוגברת.
ישנן מספר שיטות חלופיות כדי לקבוע את רמת הביטוי מירנה, כולל microarray, צפון סופג, assay הגנה ribonuclease. QRT-PCR הוא תהליך רגיש, תפוקה גבוהה הדורש כמות מינימלית של המדגם לעומת צפון סופג או assay הגנה ribonuclease. Microarrays לאפשר חקירה של expRession של miRNAs רבים בו זמנית, ואת הנתונים בדרך כלל מראים מתאם חזק עם הנתונים המתקבלים על ידי qRT-PCR 17 ; עם זאת, לא הושגה הסכמה לגבי מתודולוגיה שיכולה לאשר את תוקפם של השוואות נתונים microarray בין קבוצות מחקר 18 .
פרוטוקול זה כולל את המגבלות הבאות. ראשית, אימות של זיהוי מירנה על ידי פרוטוקול זה לא אומת באיברים אחרים כגון כבד, ריאות, וכליות. שנית, זה גם לא אומת בחיות ניסיוניות אחרות, כולל עכבר, אוגר, כלב, חזיר. הפלטפורמה של פרוטוקול זה לטיהור miRNAs באמצעות עמודה biopymer- רטוש ספין ו סיליקה קרום מבוסס ספין טור, זיהוי של miRNAs באמצעות qRT-PCR דווחה כדי להיות מסוגל לטהר באיכות גבוהה RNA מ רקמות ו מראה דיוק גבוהה ורגישות לזיהוי ביטוי מירנה 10, 11 . הראינו גם כי גילוי של ביטוי מירנה בממברנה פריטוניאלית יכול להתבצע בהצלחה באמצעות פרוטוקול זה. פרוטוקול זה יכול לשמש מחקרים חוקרת את הפרופיל של ביטוי מירנה בקרום הצפק של עכברושים במגוון רחב של תנאים פתולוגיים. בנוסף, דגימות רבות ניתן לטפל יחד באמצעות פרוטוקול זה כי זה כרוך בתהליך פשוט. לכן, פרוטוקול זה שימושי עבור מחקרים הדורשים ניתוח של פרופיל הביטוי של miRNAs רבים בתנאים פתולוגיים שונים של הממברנה פריטוניאלית.
כמה נקודות קריטיות יש לזכור בעת ביצוע פרוטוקול זה. ראשית, דגימות המכילות RNAs מטוהרים צריך להיות ממוקם על הקרח, כדי למנוע השפלה. בנוסף, השלב של homogenization צריך להתבצע על הקרח כדי להגן על RNAs מ השפלה החום. יתר על כן, דגימות הממברנה הצפק צריך להיות homogenized כראוי עד שיש להם שיתוףMpletely מומס מגיב תמוגה, ושימוש המגרסה עמודה להומוגניזציה נוספת מומלץ כי דגימות הממברנה פריטוניאלית מכילים רקמת חיבור משמעותית כי הוא עמיד בפני פירוק על ידי homogenization. שנית, היציבות של רמת הביטוי של מירנה בקרה אנדוגני צריך להיות מאומת על פני הגדרת ניסיוני ב qRT-PCR. זה הכרחי כי תנאים פתולוגיים שונים בהם הליך זה יכול לשמש להשפיע על רמות הביטוי של miRNAs שליטה אנדוגני, אשר יכול להתפשר על התוצאות.
לסיכום, יש לנו תיאר פרוטוקול לטיהור וזיהוי ביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית באמצעות qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות Miyako Shigeta על התמיכה הטכנית שלה מעולה. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי JSPS KAKENHI (מענק מספר 25461252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
