Summary
在这里，我们提出了使用定量实时逆转录聚合酶链反应检测大鼠腹膜中microRNA表达的方案。该方法适用于在几种病理条件下研究大鼠腹膜中的microRNA表达谱。
Abstract
微小RNA（miRNA）是在转录后调节信使RNA表达的小型非编码RNA。已经在大鼠的各种器官和组织中研究了miRNA表达谱。然而，用于纯化miRNA的标准方法和其在大鼠腹膜中的表达检测尚未很好地建立。我们已经开发了一种有效和可靠的方法，使用定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）在大鼠腹膜中纯化和定量miRNA。该方案由四个步骤组成：1）净化腹膜样品; 2）从腹膜样品纯化包括miRNA的总RNA; 3）逆转录miRNA产生cDNA;和4）qRT-PCR检测miRNA表达。使用该方案，我们成功地确定了6种miRNA（miRNA-142-3p，miRNA-21-5p，miRNA-221-3p，miRNA-223-3p，miRNA-327和miRNA-34a-5p）的表达增加与对照组相比，大鼠腹膜纤维化模型的腹膜显着。该方案可用于研究许多病理条件下大鼠腹膜中miRNA表达谱。
Introduction
微小RNA（miRNA）是转录后调节信使RNA（mRNA）表达的短的非编码RNA。 miRNAs表达的变化调节许多在各种病理状况（包括癌症，炎症，代谢紊乱和纤维化）2,3,4,5,6,7,8中发挥关键作用的mRNA的表达。因此，miRNA具有潜在的新生物标志物和治疗靶标2,3,4,5,6,7,8。已经在各种大鼠中测定了miRNA表达谱器官和组织，包括肝脏，心脏，肺和肾脏9 。然而，用于纯化和检测大鼠腹膜中的miRNA的标准方法尚未得到很好的建立。
该方案的总体目标是成功地纯化和检测大鼠腹膜中的miRNA。首先，使用玻璃均化器将腹膜样品匀浆，然后在微量离心旋转塔10中暴露于生物聚合物破碎系统。接下来，使用基于二氧化硅膜的旋转柱10从腹膜样品纯化包括miRNA的总RNA。然后，使用逆转录酶，poly（A）聚合酶和oligo-dT引物11从纯化的总RNA合成cDNA。最后，使用插层染料11通过qRT-PCR测定miRNA的表达。这个协议的理由是b在以前的研究中，通过简单的过程8,10,11，显示了组织中miRNA的显着纯化和检测。据报道，在微量离心旋转柱和基于二氧化硅膜的旋转柱中使用生物聚合物粉碎系统可以从组织10中纯化高质量的总RNA。已经报道了使用逆转录酶，poly（A）聚合酶和oligo-dT引物从纯化的总RNA合成cDNA的方法，以及通过使用插入染料通过qRT-PCR检测miRNA表达的方法已经报道显示出高精度和灵敏度11 。此外，这是一个简单的过程，节省时间并防止技术错误。因此，该方案在需要在大范围病理条件下对大鼠腹膜中的miRNA进行高度准确和灵敏的检测的研究中是有用的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物实验方案均由Jichi Medical University动物伦理委员会批准，并按照“Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals”的实验动物使用和护理指南进行。
腹膜样本收集
- 收集以下物品：50 ml离心管，棉花浸泡在异氟烷，软木塞，磷酸盐缓冲盐水（PBS），手术剪刀和镊子的培养皿中。
- 用过量的异氟烷安乐死大鼠，然后用70％乙醇喷洒大鼠的腹部皮肤，并将大鼠放在软木塞背面。
- 使用剪刀和镊子在腹部皮肤，肌肉和腹膜中进行纵向切口。
- 使用镊子拾取腹膜，并在其上部沿着隔膜下方的最下肋骨上方进行水平切口，并在其上侧面使用手术剪刀。接下来，使用手术剪刀进行横向纵向切口以从身体移除腹膜。然后用PBS在培养皿中洗涤。
- 切割并修剪20毫克（3-5毫米2 ）的腹膜样品，这是适合以下步骤的尺寸，使用手术剪刀和镊子。
2.从腹膜样品中纯化总RNA
注意：在这里，使用玻璃均化器和生物聚合物切碎系统将微量20mg的腹膜膜样品在微量离心旋转柱中均质化。然后，使用基于二氧化硅膜的旋转柱分离来自腹膜样品的总RNA。
- 收集以下物品：在微量离心旋转塔10中的 1.5或2.0mL微量离心管，100％乙醇，氯仿，玻璃均化器，冰，生物聚合物切碎系统10 ，苯酚/胍基裂解试剂，包括胍和乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液1）和包含乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液2）。
- 将20毫升腹膜样品放入玻璃匀浆器中，加入700微升苯酚/胍基裂解液。
- 通过将杵慢慢地压在样品上，使腹膜膜样品均匀化。在冰上重复此过程数十次，直到腹膜膜样品完全溶解于苯酚/胍基裂解试剂中。
- 为了进一步均化，将匀浆的裂解物转移到2.0mL收集管中的微量离心旋转柱中的生物聚合物切碎系统。然后在4℃下以14,000xg离心3分钟。
- 将匀浆的裂解液转移到新的微量离心管中。
- 向匀浆的裂解液中加入140μL氯仿，并盖上浴缸安全地然后，通过倒置将管混合15秒。
- 在室温下孵育样品2-3分钟。然后在4℃下以12,000 xg离心15分钟。
- 将上清液（通常为300μL）转移到新的微量离心管中，不会干扰沉淀物，并将其体积（通常为450μL）的100％乙醇加入其中。然后，通过涡旋混合样品5秒。
- 将最多700μL样品吸取到置于2.0 mL收集管中的基于硅胶的旋转柱中。关闭列的顶盖。然后，以15,000 xg离心15秒。离心后，放弃收集管中的流通。
- 将700μL洗涤缓冲液1加入到基于二氧化硅膜的旋转柱中以严格洗涤样品。关闭列的顶盖。然后，以15,000 xg离心15秒。离心后，放弃收集管中的流通。
- 将500μL洗涤缓冲液2加入到二氧化硅膜中基于rane的旋转柱以除去任何痕量的盐。关闭列的顶盖。然后，以15,000 xg离心15秒。离心后，放弃收集管中的流通。
- 重复2.11。
- 再次以15,000xg离心二氧化硅膜基旋转柱1分钟。离心后，放弃收集管中的流通。
- 将二氧化硅膜旋转柱放入新的1.5 mL收集管中。然后，将25μL无RNase的水转入柱中。关闭列的顶盖。将样品在室温下放置5分钟。然后，以15,000 xg离心1分钟。
- 将含有总RNA的25μL洗脱液转移到新的微量离心管中。然后将其存放在-80°C使用前。
3.逆转录RNA
注意：参考和遵守定量实时PCR发布的最低限度信息（MIQE）指南鼓励更好的实践，并帮助获得可靠和明确的结果12 。
注意：这里，使用逆转录酶，poly（A）聚合酶和oligo-dT引物逆转录总共1.0μg的分离的RNA。
- 收集以下物品：1.5 mL微量离心管;八孔条管;无RNase的水;冰;逆转录酶试剂盒（见材料表） 11 。
- 准备一个主混合物溶液，其中含有2.0μL的10x核酸混合物，2.0μL的逆转录酶混合物（来自试剂盒）和4.0μL5x高规格缓冲液，总共每管8.0μL。
- 将8.0μL主混合液（从试剂盒）分配到每个管中。
- 使用分光光度计测量总RNA的量。将从腹膜膜样品纯化的1.0μg分离的总RNA添加到每个管中。
注意：可以使用qRT-PCR进行将总RNA作为模板，无逆转录用于纯化的总RNA的质量控制。如果任何DNA被污染，则通过qRT-PCR观察到意想不到的扩增产物。 - 每个管中加入不含RNase的水，总共20μL。然后通过移液彻底混合并离心15秒。
- 在37℃下孵育样品60分钟。立即在95°C孵育5分钟。
注意：该步骤可以在热循环仪中进行。 - 将cDNA转移到新的微量离心管中，用无RNase的水稀释10倍（1:10）。
- 将稀释的cDNA暂时储存在冰上，长期在-80℃下使用。
miRNA的qRT-PCR
注：使用插层染料进行miRNA的qRT-PCR。在这里，RNA引物，U6小核2（RNU6-2），miRNA-142-3p，miRNA-21-5p，miRNA-221-3p，miRNA-223-3p，miRNA-327和miRNA-34a-5p被使用。
- 收集以下物品：1.5mL微量离心管，qRT-PCR的96孔反应板，96孔反应板的粘合膜，miRNA特异性引物，基于绿色染料的PCR试剂盒（参见材料表） 11和a实时PCR仪。
- 准备一个主混合物，其中含有12.5μL的2x PCR主混合物，2.5μL的5μM每个miRNA引物溶解在不含核酸酶的水中，每个孔用的是1.25μL的10x通用引物。
- 将22.5μL的主混合物分配到96孔板的每个孔中。
- 向每个孔中加入2.5μL模板cDNA。
- 用96孔反应板的粘合膜密封板。然后，以1,000×g离心30秒。
- 使用实时PCR仪器和软件运行PCR循环程序如下。
- 将板置于实时PCR仪中。在实时PCR软件中，定义实验性质（输入实验名称，选择“96孔”为实验型仪器，选择“2 - ΔΔCT方法”进行定量方法，选择“SYBR绿色试剂”作为试剂检测目标序列，选择“标准斜坡速度”为仪器运行）。
- 然后，为每个孔中的样品和目标miRNA分配名称。样品总是经过一式两份测试，以获得足够的数据用于验证结果。选择参考样本和内源性对照。选择“无”用作被动参考的染料。
- 在实时PCR软件中按照以下说明输入反应体积为“20μL”和以下PCR循环条件：在95°C预温育15 min，然后在94°C变性15 s的40个循环，在55℃退火30秒，在70℃延伸30秒。
- 分析qRT-PCR数据u唱实时PCR仪的软件。确认由软件自动确定的阈值和基线在每个孔中都是合适的。
- 检查每个样品中目标miRNA的阈值循环。阈值循环是放大曲线和阈值线之间的交点。然后，将目标miRNA的表达水平与RNU6-2作为内源性对照标准化，并使用2 - ΔΔCT方法计算目标miRNA的相对表达水平。
注意：应注意内源性对照miRNA表达水平的稳定性。在该实验中，RNU6-2被证实在高水平表达并且在每个组中表达相对不变。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这里提供的结果是基于我们以前报告的研究8 。我们调查了腹膜纤维化中的miRNA表达谱。腹膜纤维化是腹膜透析的主要并发症。其特征在于间皮细胞单层的损失和细胞外基质成分的过量积累，并且与腹膜破裂14,15相关。通过腹膜内注射100mL / kg腹膜透析液（2.5％葡萄糖，100mM NaCl，35mM乳酸钠，2mM CaCl 2和含有20mM甲基乙二醛的0.7mM MgCl 2 ），产生腹膜纤维化大鼠模型5雄性大鼠，每周一周，持续3周，年龄12周，体重230-250克。以下组作为对照：无任何治疗的大鼠（模拟大鼠）和大鼠注射腹膜透析液无甲基乙二醛（对照组大鼠）。基于miRNA微阵列筛选，我们发现六种miRNA（miRNA-142-3p，miRNA-21-5p，miRNA-221-3p，miRNA-223-3p，miRNA-327和miRNA-34a-5p）的水平，与模拟大鼠和对照大鼠相比，腹膜纤维化大鼠腹膜膜显着增加，按照本手册中提出的方案（ 图1 ） 8使用qRT-PCR。
图1：腹膜纤维化大鼠腹膜中上调的miRNA。 qRT-PCR测定模拟大鼠中miRNA-142-3p，miRNA-21-5p，miRNA-221-3p，miRNA-223-3p，miRNA-327和miRNA-34a-5p的表达（n = 6） ，对照组大鼠（n = 6）和腹膜纤维化大鼠（n = 6）。值是平均值±标准误差（误差条）。方差分析（ANOVA）用于调查组间差异。如果通过ANOVA检测到统计学显着性，则进行Tukey检验作为事后分析以比较两个不同组的平均值。与p值<0.05的差异被认为是显着的。缩写：qRT-PCR，定量实时逆转录聚合酶链反应; miRNA，微小RNA; NS，不重要; *，p <0.05。这个数字已经从Morishita 等人修改8 （有许可）。 请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
使用本手册中提出的方案，大鼠腹膜中的miRNA成功纯化并使用qRT-PCR进行检测。 qRT-PCR数据分析的可靠性取决于纯化的miRNA的质量。因此，可以在qRT-PCR前通过260nm处的吸光度与280nm处的吸光度比检查miRNA的纯度，这可以使用分光光度计测量。当使用qRT-PCR不能获得miRNA的显着扩增时，模板cDNA的浓度可能会增加。每个miRNA特异性引物的浓度也可以增加。
确定miRNA表达水平有几种替代方法，包括微阵列，Northern印迹和核糖核酸酶保护测定。 qRT-PCR是一种敏感的，高通量的方法，与Northern印迹或核糖核酸酶保护测定相比，需要最少量的样品。微阵列可以对exp进行调查许多miRNAs同时发生，数据通常与qRT-PCR 17获得的数据具有很强的相关性;然而，对于可以确认研究组18之间的微阵列数据比较的有效性的方法尚未达成共识。
此协议有以下限制。首先，通过该方案验证miRNA检测在其他器官如肝，肺和肾中尚未得到验证。其次，还有其他实验动物，包括小鼠，仓鼠，狗和猪都没有得到验证。已经报道了使用生物聚合物粉碎旋转柱和基于二氧化硅膜的旋转柱纯化miRNA的方案以及使用qRT-PCR检测miRNA的平台能够从组织中纯化高质量的RNA，显示出高精度和灵敏度的检测miRNA表达10， 11 。我们还表明，可以使用该方案成功地进行大鼠腹膜中miRNA表达的检测。该方案可用于研究大范围病理条件下大鼠腹膜中miRNA表达谱的研究。此外，由于涉及到一个简单的过程，许多样品可以使用该协议一起处理。因此，该方案对于需要分析许多miRNA在腹膜的各种病理状况中的表达谱的研究是有用的。
按照本协议，应牢记若干关键点。首先，将含有纯化RNA的样品置于冰上以避免降解。此外，均匀化步骤应在冰上进行，以保护RNA免受热降解。此外，腹膜样品应该充分均质，直到它们具有共同作用由于腹膜膜含有通过均质化抵抗溶解的大量结缔组织，推荐使用柱式切碎机进一步均化。其次，应在qRT-PCR的实验设置中验证内源性对照miRNA的表达水平的稳定性。这是必要的，因为可以使用该程序的各种病理条件可能影响内源性对照miRNA的表达水平，这可能损害结果。
总之，我们已经描述了使用qRT-PCR纯化和检测大鼠腹膜中microRNA表达的方案。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称他们没有利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢Miyako Shigeta的出色的技术支持。这项工作得到了JSS KAKENHI（授权号25461252）的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N.
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
